МЕТИЛОВЫЙ ЭФИР 24-ДИБРОМ-4-ОКСО-2-ЦИАНО-3,23-ДИНОРЛУП-28-ОВОЙ КИСЛОТЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2022 года по МПК C07J9/00 A61P35/00 A61K31/575 

Активное развитие и совершенствование противоопухолевых (антинеопластических) химиотерапевтических средств для лечения злокачественных новообразований постоянно сталкивается с проблемой множественных побочных эффектов химиотерапии. Пентациклические тритерпеноиды растительного происхождения представляют собой ценный источник новых противоопухолевых агентов с селективным действием в отношении раковых клеток, часто на фоне отсутствия токсических эффектов в отношении нормальных клеток человека [S. M. Kamble, S. N. Goyal, C. R. Patil. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review // RSC Advances. – 2014. – Vol. 4. – P. 33370-33382.; Е. Е. Rufino-Palomares, F. J. Reyes-Zurita, K. Mokhtari, P.P. Medina. Anti-cancer and antiangiogenic properties of various natural pentacyclic triterpenoids and some of their chemical derivatives // Current Organic Chemistry. - 2015. - Vol. 19. - P. 919-947.; A. V. Markov , M. A. Zenkova , E. B. Logashenko. Modulation of tumour-related signaling pathways by natural pentacyclic triterpenoids and their semisynthetic derivatives // Current Medicinal Chemistry. – 2017. – Vol. 24. – No. 13. - P. 1277-1320.; G. Peron, G. Marzaro, S. DallʼAcqua. Known triterpenes and their derivatives as scaffolds for the development of new therapeutic agents for cancer // Current Medicinal Chemistry. – 2018. – Vol. 25. – P. 1259–1269.; B. Jing, M. Liu, L. Yang, H.-y. Cai, J.-b. Chen, Z.-x. Li, X.Kou, Y.-z. Wu, D.-j. Qin, L. Zhou, J. Jin, H. Lei, H.-z. Xu, W.-w. WANG, Y.-l. Wu. Characterization of naturally occurring pentacyclic triterpenes as novel inhibitors of deubiquitinating protease USP7 with anticancer activity in vitro // Acta Pharmacologica Sinica. – 2018. − Vol. 39. − P. 492–498.; Y. Ren, A. D. Kinghorn. Natural product triterpenoids and their semi-synthetic derivatives with potential anticancer activity // Planta Medica. – 2019. – Vol. 85. – P. 802-814.; C. Soica, M. Voicu, R. Ghiulai, C. Dehelean, R. Racoviceanu, C. Trandafirescu, O.-J. Rosca, G. Nistor, M. Mioc, A. Mioc. Natural compounds in sex hormone-dependent cancers: the role of triterpenes as therapeutic agents // Frontiers in Endocrinology. - 2021. – Vol. 11. - A. 612396.]. При этом пентациклические тритерпеноиды лупанового типа – бетулин, бетулиновая кислота и их многочисленные полусинтетические производные имеют наиболее высокий потенциал в качестве эффективных и селективных ингибиторов опухолевой пролиферации и ангиогенеза [R. Csuk. Betulinic acid and its derivatives: a patent review (2008-2013) // Expert Opinion Therapeutic Patents. − 2014. − Vol. 24. – No. 8. − P. 1−11.; A. Stepulak. Comprehensive review on betulin as a potent anticancer agent // BioMed Research International. − 2015. − Vol. 2015. − P. 1−11.; D.-M. Zhang, H.-G. Xu, L. Wang, Y.-J. Li, P.-H. Sun, X.-M. Wu, G.-J. Wang, W.-M. Chen, W.-C. Ye. Betulinic acid and its derivatives as potential antitumor agents // Medicinal Research Reviews. − 2015. − Vol. 35. – No. 6 − P. 1127−1155.; M. Ali-Seyed, I. Jantan, K. Vijayaraghavan, S.N.A. Bukhari. Betulinic acid: recent advances in chemical modifications, effective delivery, and molecular mechanisms of a promising anticancer therapy // Chemical Biology and Drug Design. − 2016. − Vol. 87. – No. 4. − P. 517−536.; Y. Ye, T. Zhang, H. Yuan, D. Li, H. Lou, P. Fan. Mitochondria-targeted lupane triterpenoid derivatives and their selective apoptosis-inducing anticancer mechanisms // Journal of Medicinal Chemistry. – 2017. – Vol. 60. – P. 6353−6363.; A.-Q. Zeng, Y. Yu, Y.-Q. Yao, F.-F. Yang, M. Liao, L.-J. Song, Y.-L. Li, Y. Yu, Y.-J. Li, Y.-L. Deng, S.-P. Yang, C.-J. Zeng, P. Liu, Y.-M. Xie, J.-L. Yang, Y.-W. Zhang, T.-H. Ye, Y.-Q. Wei. Betulinic acid impairs metastasis and reduces immunosuppressive cells in breast cancer models // Oncotarget. – 2018. − Vol. 9. − No. 3. − P. 3794−3804. A. Hordyjewska, A. Ostapiuk, A. Horecka, J. Kurzepa. Betulin and betulinic acid: triterpenoids derivativeswith a powerful biological potential // Phytochemistry Reviews. – 2019. – Vol. 18. – P. 929–951.; A. Lombrea, A. D. Scurtu, S. Avram, I. Z. Pavel, M. Turks, J. Luginina4, U. Peipinš, C. A. Dehelean, C. Soica, C. Danciu. Anticancer potential of betulonic acid derivatives // International Journal of Molecular Sciences. – 2021. – Vol. 22. – P. 3676.; W. Jiang, X. Li, S. Dong, W. Zhou. Betulinic acid in the treatment of tumour diseases: Application and research progress // Biomedicine & Pharmacotherapy. – 2021. – Vol. 142. – P. 111990.]. Повсеместное распространение в растительном мире и доступность бетулина, высокий терапевтический потенциал и положительные результаты многочисленных биологических испытаний его полусинтетических производных обусловливают высокую практическую значимость данного тритерпеноида для медицинской и фармацевтической химии. В литературе описаны примеры синтеза на основе бетулина гидрированных по С(20)-С(29) связи производных, которые проявляют более высокую противоопухолевую активность по сравнению с негидрированными аналогами [R. Mukherjee, V. Kumar, S. K. Srivastava, S. K. Agarwal, A. C. Burman. Betulinic acid derivatives as anticancer agents: structure activity relationship // Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. – 2006. − Vol. 6. – P. 271–279.; L. Borkova, L. Jasikova, J. Rehulka, K. Frisonsova, M. Urban, I. Frydrych, I. Popa, M. Hajduch, N. J. Dickinson, M. Vlk, P. Dzubak, J. Sarek. Synthesis of cytotoxic 2,2-difluoroderivatives of dihydrobetulinic acid and allobetulin and study of their impact on cancer cells // European Journal of Medicinal Chemistry. − 2015. – Vol. 96. – P. 482−490.; A. Spivak, R. Khalitova, D. Nedopekina, L. Dzhemileva, M. Yunusbaeva, V. Odinokov, V. D'yakonov, U. Dzhemilev. Synthesis and evaluation of anticancer activities of novel С-28 guanidine-functionalized triterpene acid derivatives. // Molecules. – 2018. – Vol. 23. – No. 11. – P. 3000.; K. Kuczynska, B. Bończak, L. Rárová, M. Kvasnicová, M. Strnad, Z. Pakulski, P. Cmoch, M. Fiałkowski. Synthesis and cytotoxic activity of 1,2,3-triazoles derived from 2,3-seco-dihydrobetulin via a click chemistry approach. // Journal of Molecular Structure. – 2022. − Vol. 1250. – P. 131751.]. Таким образом, процесс гидрирования лупановых тритерпеноидов может обеспечить получение новых цитотоксически активных агентов.

Описания заявляемого соединения и его свойств в источниках информации не обнаружено.

Ближайший аналог описываемого соединения по структуре – метиловый эфир 4,20-диоксо-24,24,30,30-тетрабром-2-циано-3,4-секо-3,23,29-тринорлуп-28-овой кислоты, который проявляет избирательную цитотоксическую активность (IC₅₀ 5,49 мкМ) в отношении линии клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 [A. V. Nazarov, I.A. Tolmacheva, A.E. Zhukova, V.V. Grishko. Synthetic modification and cytotoxic evaluation of 2-cyano-3,4-secotriterpenic methylketones // Chemical Papers. – 2019. – Vol. 73. – P. 1767–1775.].

Изобретение решает задачу получения новых 3,4-секо-лупановых тритерпеноидов, содержащих в расщепленном А кольце дибром- и нитрильную группы.

Технический результат изобретения заключается в получении новых 3,4-секо-лупановых тритерпеноидов, которые содержат в расщепленном А кольце дибром- и нитрильную группы и обладают цитотоксическими свойствами.

1. Указанный технический результат достигается тем, что синтезирован метиловый эфир 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты формулы I:

Метиловый эфир 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты I получают в результате реакции озонирования метилового эфира 2-циано-3,4-секо-3-норлуп-4(23)-ен-28-овой кислоты и последующего бромирования нового, ранее не описанного промежуточного продукта – метилового эфира 4-оксо-2-циано-3,4-секо-3,23-динорлупан-28-овой кислоты. Синтезированное соединение I представляет собой мелкокристаллическое вещество белого цвета, хорошо растворимое в хлороформе, дихлорметане, четыреххлористом углероде, этиловом спирте, бензоле, толуоле, диметилсульфоксиде. Указанное соединение плохо растворимо в гексане и не растворимо в воде.

2. Соединение I (метиловый эфир 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты) проявляет цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток линий MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома), НСТ 116 (колоректальная карцинома), MS (меланома), RD ТЕ 32 (рабдомиосаркома), А549 (немелкоклеточная карцинома легкого), PC-3 (карцинома простаты), HBL-100 (молочная железа, клетки, иммортализованные вирусом SV-40 и ставшие туморогенными из-за длительного культивирования), НBL-100/Dox (молочная железа, клеточная линия с гиперэкспрессией P-гликопротеина, полученная в результате селекции с доксорубицином).

Структура соединения I подтверждена методами ИК и ЯМР спектроскопии. Спектральные характеристики соединения I приведены в таблице 1. Спектры ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР (δ, м.д.; J, Гц) записывали для растворов соединений в CDCl₃ на спектрометре Bruker AVANCE II (Германия) при рабочей частоте прибора 400 и 100 МГц, соответственно. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан. ИК спектры (v, см^-1) регистрировали на ИК-Фурье-спектрометре IFS 66/S Bruker (Германия) в тонкой пленке, полученной испарением раствора вещества в СНСl₃ на поверхности стекла NaCl. Интервал температуры плавления определяли на приборе OptiMelt МРА100 (США) со скоростью 1°С в мин. Величину удельного оптического вращения определяли для растворов соединений в CHCl₃ с помощью поляриметра 341 модели Perkin-Elmer (США) при длине волны 589 нм. Качественный контроль реакции проводили методом ТСХ на пластинах «Sorbfil» (Россия). Обнаружение веществ осуществляли обработкой пластин 5% H₂SO₄ c последующим прогреванием при 95-100°С в течение 2-3 мин. Для колоночной хроматографии использовали силикагель марки «Macherey-nagel» (60-200 μm), элюент смесь петролейный эфир-этил ацетат (7:1).

В исследованиях in vitro выявлена цитотоксическая активность соединения I в отношении раковых клеток линий MCF-7, HepG2, НСТ 116, MS, RD ТЕ 32, А549, PC-3, HBL-100, НBL-100/Dox. В качестве нормальных нераковых клеток использовали клеточную линию эмбриональной почки человека HEK293.

Сущность предлагаемого решения и возможность его осуществления подтверждается примерами 1, 2 и результатами исследований, приведенными в таблицах 1, 2.

Пример 1. Получение метилового эфира 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты (соединение I).

Через раствор 1 ммоль метилового эфира 2-циано-3,4-секо-3-норлуп-4(23)-ен-28-овой кислоты в 50 мл СH₂Cl₂ пропускали озон при -50 °С. Реакцию контролировали с помощью ТСХ. Через 2 ч растворитель отгоняли в вакууме, остаток очищали колоночной хроматографией с использованием в качестве элюента смеси петролейный эфир−этилацетат−хлороформ (10:1:1). Полученный таким образом метиловый эфир 4-оксо-2-циано-3,4-секо-3,23-динорлупан-28-овой кислоты в количестве 2 ммоль растворяли в 10 мл уксусной кислоты, добавляли 6 ммоль пербромида пиридиний бромида (C₅H₅Br₃N) и реакционную смесь кипятили в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали, промывали H₂O (30 мл) и экстрагировали этилацетатом (30 мл × 3). Органический слой отделяли и промывали NaHCO₃, сушили над безводным MgSO₄. Растворитель отгоняли под вакуумом, остаток очищали колоночной хроматографией, элюируя продукт смесью петролейный эфир−этилацетат−хлороформ (20:1:1).

Выход соединения I: 60%. R_f 0.5 (петролейный эфир−этилацетат, 5:1). Т. пл. 146-149 °C. [α]-25.1 (с 0.5, CHCl₃).

Пример 2. Исследование цитотоксической активности соединения I в отношении клеток линий MCF-7, HepG2, НСТ 116, MS, RD ТЕ 32, А549, PC-3, HBL-100, НBL-100/Dox, HEK293.

Клетки выращивали при температуре 37°С во влажной стерильной атмосфере 5% CO₂ в соответствующих средах: для MCF-7, HepG2, НСТ 116, А549, PC-3 использовали DMEM; для MS, RD ТЕ 32, HBL-100, HBL-100/Dox − RPMI 1640. В культуральные среды добавляли 10% эмбриональную телячью сыворотку, 2 мМ L-глутамина и 1%-ный раствор пенициллина/стрептомицина. В эксперименте клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 1×10⁴ клеток/100 мкл. Через 24 ч инкубации к культурам клеток добавляли соединение I и препараты сравнения (доксорубицин и камптотецин), растворенные в ДМСО, в диапазоне концентраций от 3,125 до 100 мкМ. В качестве контроля использовали лунки с добавлением ДМСО, конечная концентрация которого не превышала 1% и была не токсична для клеток. Выживаемость клеток оценивали через 72 ч инкубации с исследуемыми соединениями путем добавления в каждую лунку 20 мкл МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) (Alfa Aesar, Великобритания) в концентрации 5 мг/мл, после чего планшеты инкубировали еще 4 ч. Затем среду сливали, выпавшие кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО. Оптическую плотность растворов измеряли при 544 нм с помощью планшетного спектрофотометра FLUOstar Optima (BMG Labtech, Германия). По изменению оптической плотности определяли показатель IC₅₀ - концентрацию, токсичную для 50% клеток в культуре. Результаты исследования цитотоксической активности в виде среднего значения трех независимых экспериментов представлены в таблице 2.

Соединение формулы I может быть использовано непосредственно для разработки противоопухолевого средства.

Таблица 1

Данные ИК, ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР спектров соединения I

Соединение ИК спектр
(ν, см^-1) Спектр ¹Н ЯМР
(400 МГц, CDCl₃, δ, м.д., J/Гц) Спектр ¹³С ЯМР
(100 МГц, CDCl₃, δ, м.д.) Соединение I 2954, 2870, 2247, 1726, 1457, 1384, 1160, 757 0,78 (д, J = 6,8 Hz, 3Н), 0,89 (д, J = 6,8 Hz, 3Н), 1,00 (с, 3Н), 1,02 (с, 3Н), 1,10 (с, 3Н), 2,23-2,35 (м, 4H), 2,45 (ддд, J = 16,4, 5,4, 10,5 Hz, 1Н), 2,85 (дд, J = 3,3, 11,8 Hz, 1Н), 3,67 (с, 3 Н), 5,94 (с, 1Н) 12,17, 14,54, 14,69, 15,92, 19,21, 21,31, 22,77, 22,91, 24,50, 26,32, 29,65, 29,77, 31,90, 32,42, 35,46, 37.22, 38.00, 39.15, 40,28, 40,38, 43,04, 43,13, 44,15, 48,84, 51,20, 51,76, 56,91, 119,48, 176,64, 197,09

Таблица 2

Цитотоксическая активность соединения I

Клеточные культуры
IC₅₀, мкM Соединение I Доксорубицин Камптотецин MCF-7 7,06±0,72 0,38±0,09 0,04±0,01 HCT116 3,86±0,08 1,30±0,34 1,88±0,09 RD TE32 0,66±0,04 1,27 ±0,03 1,71± 0,36 MS 16,47±1,53 1,29±0,16 0,77±0,33 A549 7,01±0,21 2,04±0,21 1,38± 0,02 PC-3 10,35±1,27 12,60±0,20 1,92±0,06 HepG2 16,55±0,41 1,78±0,30 3,01±0,16 HBL-100 0,99±0,001 0,35±0,03 н.о. НBL-100/Dox 1,70±0,14 74,53±4,91 н.о. HEK293 11,47±0,56 0,44±0,04 н.о.

Изобретение относится к области химии природных соединений класса 3,4-секо-лупановых тритерпеноидов – метиловому эфиру 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты, который проявляет цитотоксическую активность, в том числе в отношении раковых клеток линий MCF-7, НСТ 116, RD ТЕ 32, MS, А549, PC-3, HepG2, HBL-100, HBL-100/Dox. Технический результат – обеспечение 3,4-секо-лупановых тритерпеноидов, которые содержат в расщепленном А кольце дибром- и нитрильную группы и обладают цитотоксическими свойствами. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Метиловый эфир 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты формулы I

.

2. Метиловый эфир 24,24-дибром-4-оксо-2-циано-3,23-динорлуп-28-овой кислоты формулы I по п.1, проявляющий цитотоксическую активность в отношении раковых клеток линий MCF-7, НСТ 116, RD ТЕ 32, MS, А549, PC-3, HepG2, HBL-100, HBL-100/Dox.