Применение N'-бензилиденгидразида 3β-О-ацетил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овой кислоты в качестве средства, ингибирующего вирус Зика Российский патент 2024 года по МПК C07J63/00 C07J71/00 A61K31/567 A61K31/58 A61P31/14 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к производным глицирретиновой кислоты (ГЛК) (1) формулы (2-6), проявляющим противовирусную активность в отношении вируса Зика.

1 - Глицирретиновая кислота; 2 - N'-бензилиденгидразид 3β-O-ацетил-11-оксо-18βH-олеан-12-ен-30-овая кислота; 3 - 3-семикарбазон бутил-3-дезоксо-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оат; 4 - 1,2,3-тиадиазол метил-3-дезоксо-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оат; 5 - 3-О-ацетил-20β-(2-аминопиридинилкарбамоил)-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овая кислота; 6 - 1,2,3-тиадиазол бутил-3-дезоксо-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оат

Поиск новых противовирусных агентов представляет одну из актуальных проблем современной химии и медицины, что связано с широким распространением ряда социально-опасных вирусных инфекций (ВИЧ, гепатиты В и С, грипп A/H1N1, «свиной» и «птичий» гриппы, лихорадки Эбола, Марбурга, Чикунгунья, Ковид-19 и др.). Особую угрозу для человечества представляют флавивирусы, вектором распространения которых являются москиты (комары) Aedes sps., к которым относятся вирусы японского энцефалита, Денге и Зика, вызвавшие в последнее годы эпидемии в странах Азии, Карибского бассейна, Центральной и Южной Америки [Daep С.A., J.L., Eugenin E.A. Flaviviruses, an expanding threat in public health: focus on dengue, West Nile, and Japanese encephalitis virus. // J. Neurovirol., 2014, 20, 539-560; Zanluca C., Duarte dos Santos C.D. Zika virus - an overview. // Microbes and Infections, 2016, 18, 295-301]. Вирус Зика принадлежит к семейству Flaviviridae из рода Flavivirus, которое включает более 100 вирусов и родственен флавивирусам желтой лихорадки, Денге и Западного Нила [Zanluca С., Duarte dos Santos C.D. Zika virus - an overview. // Microbes and Infections, 2016, 18, 295-301]. Вирус Зика, как и другие родственные флавивирусы, имеет линейный, положительный одноцепочечный геном РНК, содержащий до 10794 нуклеотидов, кодирующих 3419 аминокислот [Kuno G., Chang G.J.J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. // Arch. Virol., 2007, 152, 687-696] в виде одного полипротеина с множеством трансмембранных доменов, который расщепляется на структурные и неструктурные белки (NS) как хозяином, так и вирусными протеазами. О новой вирусной угрозе для человечества, вызванной вирусом Зика объявила Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) в феврале 2016 года [http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2016/1st-emergency-committee-zika; Weaver S.C., Costa F., Garcia-Blanco M.A., Ko A.I., Ribeiro G.S., Saade G., Shi P.-Y., Vasilakis N. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. // Antiviral Res., 2016, 130, 69-80] как о чрезвычайной ситуации в области здравоохранения, имеющей международное значение. В первые 60 лет после открытия (1947 г. ) вирус Зика был географически локализован, и случаи заражения людей происходили спорадически только в Африке и Азии [Musso D., Nilles E.J., Cao-Lormeau V.-M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. // Clin. Microbiology and Infection, 2014, 20, 0595-0596]. В 2007 году первая массовая вспышка инфекции Зика произошла в Макронезии, которая охватила 70% населения [Chan J.F.W., Choi G.K.Y., Yip С.С.Y., Cheng V.C.C., Yen K.-W. Zika fever and congenital Zika syndrome: An unexpected emerging arboviral disease. // J. Infection, 2016, 72, 507-524]. Впоследствии инфекция Зика была зарегистрирована в Камбодже, Филиппинах и Таиланде в 2010-2014 гг. [Zanluca С., Duarte dos Santos C.D. Zika virus - an overview. // Microbes and Infections, 2016, 18, 295-301]. В конце 2015 года в Бразилии произошла крупная эпидемия вируса Зика во время олимпийских игр (440000-1400000 случаев заболевания). Из Бразилии вирус Зика распространился в другие страны американского континента (Америка) [Bogoch I., Brady О.J., Kraemer M.U.G., German M., Creatore M.I., Kulkarni M.A., Brownstein J.S., Mekaru S.R., Hay S.I., Groot E., Watts A., Khan K. Anticipating the international spread of Zika virus from Brazil. // www.thelancet.com., 2016, 387, 335-336; Petersen E., Wilson M.E., Touch S., McCloskey В., Mwaba P., Bates M., Dar O., Mattes F., Kidd M., Ippolito G., Azhar E.I., Zumla A. Rapid Spread of Zika virus in the Americas - Implications for Public Health Preparedness for Mass Gatherings at the 2016 Brazil Olympic Games. // Int. J. Infection Dis., 2016, 44, 11-15]. В 2015-2016 гг.случаи заболевания Зика были зарегистрированы в 69 странах и территориях, а в марте 2017 г. случаи инфекции Зика были зарегистрированы уже в 84 странах [http://ecdc.europa.eu/en/press/news; O.W. Health. Zika situation report. Archived from the original on 25 May 2017, 2017, 1]. Инфекция, вызванная вирусом Зика, сопровождается серьезными неврологическими осложнениями, такими как синдром Гийена-Барре [Brasil P., Sequeira Р.С, Freitas A.D., Zogbi H.E., Calvet G.A., de Souza R.V., Siqueira A.M., de Mendonca M.C.L., Nogueira R.M.R., de Filippis A.M.B., Solomon T. syndrome associated with Zika virus infection. // The Lancet, 2016, 387, 1482] и особенно опасна для беременных женщин, так как может привести к врожденным порокам развития плода и микроцефалии новорожденных [Mlakar J., Korva M., Tul N., M., M., Mraz J., Kolenc M., Resman Rus K., Vesnaver Vipotnik Т., Fabian V., Vizjak A., J., Petrovec M., T. Zika Virus Associated with Microcephaly. // N. Engl. J. Med., 2016 Feb 10. Epub ahead of print; Calvet G., Aguiar R.S., Melo A.S.O., Sampaio S.A., de Filippis I., Fabri A., Araujo E.S.M., de Sequeira P.C., de Mendonga M.C.L., de Oliveira L., Tschoeke D.A., Schrago C.G., Thompson F.L., Brasil P., Dos Santos F.B., Nogueira R.M.R., Tanuri A., de Filippis A.M.B. Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil: a case study. // The Lancet Infectious Diseases, 2016, 16, 653-660], что делает вирус Зика особенно опасным и совершенно отличным от других флавивирусов. В настоящее время установлено, что вирус Зика может передаваться перинатально во время родов, через грудное молоко, вирус был обнаружен в сперме и может передаваться половым путем [Weaver S.C., Costa F., Garcia-Blanco M.A., Ko A.I., Ribeiro G.S., Saade G., Shi P.-Y., Vasilakis N. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. // Antiviral Res., 2016, 130, 69-80;]. Большинство инфицированных вирусом Зика (80%) являются бессимптомными носителями вируса и могут быть донорами крови, что также представляет угрозу для распространения вируса Зика через банки крови [Weaver S.C, Costa F., Garcia-Blanco M.A., Ko A.I, Ribeiro G.S., Saade G., Shi P.-Y, Vasilakis N. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. // Antiviral Res., 2016, 130, 69-80; K-Kim. Current challenges in the development of vaccines and drugs against emerging vector-borne diseases. // Curr. Med. Chem., 2019, 26, 2974-2986]. Лицензионных вакцин и специфических противовирусных средств пост-инфекционной терапии вируса Зика до сих пор нет, несмотря на предпринятые мировым сообществом интенсивные исследования по поиску средств профилактики и лечения инфекции Зика [J.M. Richner, M.S. Diamon. Zika virus vaccines: immune response, current status, and future challenge. // Curr. Opin. Immunol., 2018, 53, 130-136; K-Kim. Current challenges in the development of vaccines and drugs against emerging vector-borne diseases. // Curr. Med. Chem., 2019, 26, 2974-2986]. Клиническое лечение инфекции Зика носит только поддерживающий характер, а терапевтический подход к инфицированным беременным женщинам ограничивается использованием жаропонижающих средств и анальгетиков [Wahid В., Ali A., Rafique S., Idrees M. Current status of therapeutic and vaccine approaches against Zika virus. // Eur. J. Intern. Med., 2017, 44 12-18; Saiz J., M.A. The Race to Find Antivirals for Zika Viru. // Antimicrob. Agents Ch., 2017, 61, pii: e00411-17; G. Duarte, A. Moron, A. Timerman, C. Fernandes, C. Mariani Neto, G. Almeida Filho, H. Werner Junior, H. Santo, J. Steibel, J. Bortoletti Filho, J. Andrade, M. M. Silva De N. Busso, P. Giraldo, R. Moreira De R. Passini Junior, R. Mattar, R. Francisco. Zika Virus Infection in Pregnant Women and Microcephaly. // Revista Brasileira de Ginecologia e /RBGO Gynecology and Obstetrics, 2017, 39, 235-248]. Поэтому актуальность разработки лекарств для лечения инфекции Зика очевидна, и все исследования, направленные на разработку противовирусных агентов этого типа, являются приоритетными в здравоохранении большинства стран и рекомендованы ВОЗ. На современном фармацевтическом рынке существует ограниченная группа противовирусных препаратов, обычно вызывающих лекарственную устойчивость, поэтому любые исследования по разработке новых противовирусных средств особенно актуальны в связи с доминирующим положением вирусных инфекций в общей структуре инфекционных заболеваний и существующей угрозой. возникновения и быстрого распространения (пандемии) новых вирусных инфекций. Одним из приоритетных направлений в разработке противовирусных препаратов является использование природных соединений растительного происхождения (вторичных метаболитов) с установленной противовирусной активностью и новым механизмом противовирусного действия [Martinez J.Р., Sasse F., Bronstrup M., Diez J., Meyerhans A. Antiviral drug discovery: broad-spectrum drugs from nature. // Nat. Prod. Rep., 2015, 32, 29-48]. Оптимизация структур лидирующих природных соединений с уже известной противовирусной активностью может привести к появлению новых соединений-лидеров и кандидатов для доклинических и клинических исследований.

Широко распространенными в растительном мире являются вторичные метаболиты растений, относящиеся к семейству пентациклических тритерпеноидов, которые привлекают исследователей благодаря широкому спектру биологической и фармакологической активности (противовоспалительной, противоопухолевой, противовирусной, противомикробной, кардио-, гепато- и гастропротекторной, иммуномодулирующей и др.) [R.A. Hill, J.D. Connolly. Triterpenoids. // Nat. Prod. Rep., 2018, 35, 1294-1329; J.P. Dzubak, M. Hajduch, D. Vydra, A. Hustova, M. Kvasnica, D. Biedermann, L. Markova, M. Urban, J. Sarek. Pharmacological activities of natural triterpenoids and their therapeutic implications. // Nat. Prod. Pep., 2006, 23, 394-411; R. Paduch, M. Kandefer-Szerszen. Antitumor and antiviral activity of pentacyclic triterpenes. // Mini-Rev. Org. Chem., 2014, 11(3), 262-268; J.A.R. Salvador, A.S. Leal, D.P.S. Alho, B.M.F. Goncalves, A.S. Valdeira, V.I.S. Mendes. Highlights of pentacyclic triterpenoids in the cancer settings. // Studies in Natural Products Chemistry, 2014, vol. 41, 33-73; S. Xiao, Z. Tian, Y. Wang, L. Si, L. Zhang, D. Zhou. Recent progress in the antiviral activity and mechanism study of pentacyclic triterpenoids and their derivatives. // Med. Res. Rev., 2018, 38(3), 9751-9764; Sheng H., Sun H. Synthesis, biology and clinical significance of pentacyclic triterpenes: a multi-target approach to prevention and treatment of metabolic and vascular diseases. // Nat. Prod. Rep., 2011, 28, 543-593]. Одним из хорошо известных пентациклических тритерпеноидов является глицирретиновая кислота (3β-гидрокси-11-оксоолеан-12-ен-30-овая кислота) (ГЛК) (1) - агликон глицирризиновой кислоты - основного биоактивного компонента корней солодки (Glycyrrhiza glabra L., Gl. Uralensis Fisher) (Leguminosae) [Толстиков Г.А., Болтина л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.А. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск: Академическое издательство «Гео», 2007. 311 с.; L. Wang, r. Yang, В. Yuan, Y. Liu, Ch. Liu. The antiviral and antimicrobial activities of licorice, a widely-used Chinese herb. // Acta Pharmaceutica Sinica, B, 2015, 5, 310-315]. Установлено, что ГЛК и ее производные обладают рядом замечательных фармакологических свойств, таких как противовоспалительные, противоязвенные, антиоксидантные, гепатопротекторные, противомикробные, противоопухолевые и противовирусные [Толстиков Г.А., Болтина л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.А. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск: Академическое издательство «Гео», 2007. 311 с.; В. Xu, G.-R. Wu, X.-Y Zhang, M.-M. Yan, R. Zhao, N.-N. Xue, K. Fang, H. Wang, M. Chen, W.-B. Guo, P.-L. Wang, H.-M. Lei. An overview of structurally modified glycyrrhetinic acid derivatives as antitumor agents. // Molecules, 2017, 22, 924-948; Sharma, F.; Sun Z.-G., Zhao T.-T, Lu N, Yang Y.-A., Zhu H-L. Research progress of Glycyrrhizic acid on antiviral activity. // Mini-Rev. Med. Chem., 2019, 19(10), 826-832]. Обнаружена противовирусная активность ГЛК и ее производных против некоторых ДНК- и РНК-вирусов, в том числе вируса простого герпеса 1 (HSV-1) [Pompei, R.; Laconi, S.; Ingianni, A. Antiviral properties of Glycyrrhizic acid and its semisynthetic derivatives. Mini-Rev. Med. Chem., 2009, 9, 996-1001]. Натриевая соль кислого сукцината ГЛК (препарат карбеноксолон) показала более высокую противовирусную активность против HSV-1, чем нативный тритерпеноид [Pompei, R.; Laconi, S.; Ingianni, A. Antiviral properties of Glycyrrhizic acid and its semisynthetic derivatives. Mini-Rev. Med. Chem., 2009, 9, 996-1001]. ГЛК и ее производные эффективно ингибировали обратную транскриптазу ВИЧ и накопление специфического белка ВИЧ-1 р24 [Покровский А.Г., Плясунова О.А., Ильичева Т.Н., Борисова О.А., Федюк Н.В., Петренко Н.И., Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности. // Химия в интересах устойчивого развития, 2001, 9, 485-491]. Производные ГЛК, модифицированные в положении С30 ароматическими группами, были высокоактивными ингибиторами вируса гепатита В [Wang LJ, Geng СА, Ma YB, Huang XY, Luo J, Chen H, Zhang XM, Chen JJ. Synthesis, biological evaluation and structure-activity relationships of glycyrrhetinic acid derivatives as novel anti-hepatitis В virus agents. Bioorg Med Chem Lett. 2012, 22, 3473-3479]. Среди производных ГЛК обнаружены ингибиторы вирусов гриппа [Tsuji M., Sriwilaijaroen N., Inoue H., Miki K., Kinoshita K., Koyama k., Furuhata K., Suzuki Y., Takahashi K. Synthesis and anti-influenza virus evaluation of triterpene-sialic acid conjugates. // Bioorg. Med. Chem., 2018, 26, 17-24; Liang S, Li M, Yu X, Jin H, Zhang Y, Zhang L, Zhou D, Xiao S. Synthesis and structure-activity relationship studies of water-soluble β-cyclodextrin-glycyrrhetinic acid conjugates as potential anti-influenza virus agents. // Eur. J. Med. Chem., 2019, 15, 166, 328-338]. Среди аминокислотных конъюгатов ГЛК мы обнаружили эффективные ингибиторы вируса гриппа A/H1N1 [Baltina L.A. (jr.), Khudobko M.V., Mikhailova L.R., Baltina L.A., Fedorova V.A., Orshanskaya Ya.A., Zarubaev V.V., Kiselev O.I. Synthesis and antiviral activity of amino-acid conjugates of Glycyrrhetic acid. // Chem. Nat. Compd, 2014, 50 (3), 473-477]. Противовирусный эффект ГЛК связан со стимулирующим действием на продукцию NO и экспрессию генов NO-синтазы в макрофагах [S. Xiao, Z. Tian, Y. Wang, L. Si, L. Zhang, D. Zhou. Recent progress in the antiviral activity and mechanism study of pentacyclic triterpenoids and their derivatives. // Med. Res. Rev., 2018, 38(3), 951-976]. Уникальным свойством ГЛК и других тритерпеновых веществ является способность подавлять вирусы на начальных этапах цикла репликации вирусов [S. Xiao, Z. Tian, Y. Wang, L. Si, L. Zhang, D. Zhou. Recent progress in the antiviral activity and mechanism study of pentacyclic triterpenoids and their derivatives. // Med. Res. Rev., 2018, 38(3), 951-976]. Следовательно, ГЛК не влияет на процессы реализации генетической информации вирусов и не вызывает развития лекарственной устойчивости. Противовирусная активность ГЛК и ее производных в отношении социально опасных флавивирусов, таких как вирус Зика, еще не изучалась.

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение заключается в поиске новых ингибиторов вируса Зика среди производных ГЛК, представляющих интерес в качестве потенциальных противовирусных агентов для лечения и профилактики социально опасной флавивирусной инфекции Зика.

Поставленная задача решается с помощью производных ГЛК 2-6, проявляющих противовирусную активность в отношении вируса Зика, а именно, N'-бензилиденгидразида 3β-О-ацетил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овой кислоты 2, 3-семикарбазона бутил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оата 3, 1,2,3-тиадиазола метил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оата 4, 3β-О-ацетил-20β-(2-аминопиридинилкарбамоил)-11-оксо-18βH-олеан-12-ен-30-овой кислоты 5, 1,2,3-тиадиазола бутил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оата 6.

Синтез соединения 2 описан в работе [L.A. Baltina, R.M. Kondratenko, A.K. Bulgakov. Synthesis and anti-microbial activity of benzylidenhydrazides of Glycyrrhetic acid. // Russ. J. Bioorg. Chem., 2020, 46 (2), 246-251; doi: 10.1134/S1068162020020065]. 3-Семикарбазон бутилового эфира ГЛК 3 и 1,2,3-тиадиазол 6 получали согласно [L.A. Baltina, D.M. Shayakhmetova, L.A. Baltina, T.R. Nugumanov. Synthesis of 1,2,3-thiadiazole of butyl Glycyrrhetinate. // Chem. Nat. Compd., 2019, 55 (4), 692-695; https://doi.org/10.1007/s10600-019-02780-х]. Синтез соединения 4 описан в работе [Ch. Gao, F.-J.-Dai, H.-W. Cui, Sh.-H. Peng, Y. He, X. Wang, Zh.-F. Yi, W.-W. Qiu. Synthesis of novel heterocyclic ring-fused 18β-Glycyrrhetinic acid derivatives with antitumor and antimetastatic activity. // Chem Biol Drug Des, 2014, 84, 223-233]. Синтез амида 3-О-ацетил-ГЛК 5 проводили хлорангидридным методом путем взаимодействия хлорангидрида 3-О-ацетил-ГЛК [L.A. Baltina, jr., M.V. Khudobko, L.R. Mikhailova, L.A. Baltina, V.A. Fedorova, Ya.A. Orshanskaya, V.V. Zarubaev, O.I. Kiselev. Synthesis and antiviral activity of amino-acid conjugates of Glycyrrhetic acid. // Chem Nat Compd, 2014, 50(3), 473-477] с 2-аминопиридином в хлористом метилене при комнатной температуре с последующей очисткой целевого продукта колоночной хроматографией (КХ) (выход 70%). Структуры всех полученных соединений подтверждены спектральными методами (ИК, ЯМР ¹H и ¹³С, LS-MS) и элементным анализом.

Противовирусные свойства производных ГЛК 2-6 в качестве ингибиторов вируса Зика были изучены в Китайском медицинском университете (г. Тайчунг, Тайвань) под руководством проф. Чэнь-Вэнь Лин (Cheng-Wen Lin). Цитотоксичность производных ГЛК 2-6 по отношению к клеткам SF268 (клетки глиобластомы человека) оценивалась через 96 ч после обработки МТТ методом [Lien J.C, Wang C.Y., Lai Н.С, Lu С.Y, Lin Y.F., Gao G.Y., Chen K.C., Huang А.С., Huang S.H., Lin C.W. Structure analysis and antiviral activity of CW-33 analogues against Japanese encephalitis virus. // Sci. Rep., 2018, 8(1), 16595]. Установлено, что все исследованные производные ГЛК являются малотоксичными веществами, 50%-я цитотоксическая концентрация (СС50) соединений была выше 50 мкМ) (табл 1).

Первичную оценку противовирусной активности производных ГЛК 2-6 проводили в культуре клеток SF268 по ингибированию цитопатического эффекта (СРЕ) вируса Зика через 96 ч после обработки в концентрации 10 мкМ. Изображения индуцированного СРЕ в каждой лунке 6-луночных планшетов получали под микроскопом через 96 часов после обработки. Установлено, что производные ГЛК 2-6 в концентрации 10 мкМ проявляют высокую (+++) ингибирующую активность в отношении СРЕ вируса Зика (табл. 1).

Противовирусную активность in vitro производных ГЛК в концентрации 10 мкМ определяли также по ингибирующему действию на экспрессию вирусного белка NS1 (неструктурный белок вируса Зика 1) в клетках, инфицированных вирусом Зика (ингибирование инфекционности вируса Зика) как соотношение NS1-положительных клеток к общему количеству ядер клеток. Установлено, что производные ГЛК 2-6 в концентрации 10 мкМ являются высокоэффективными ингибиторами вирусного белка NS1 (ингибирование 74-83%) (табл. 1).

Высокоактивные в концентрации 10 мкМ в тестах СРЕ и NS1 вируса Зика производные ГЛК 2-6 были протестированы в различных концентрациях (0.1, 1 и 10 мкМ) по ингибированию СРЕ, экспрессии вирусного белка NS1 и инфекционности вируса Зика в инфицированных клетках SF268 (Фиг. 1-5). Для этого клетки SF268 инфицировали вирусом при MOI 0.05 и сразу же обрабатывали производными ГЛК в различных концентрациях (0, 0.1, 1 и 10 мкМ). Затем обработанные/инфицированные клетки в каждой лунке проявляли иммунофлуоресцентным красителем для определения остаточной инфекционности вируса Зика после обработки производными ГЛК. Клетки окрашивали кроличьими анти-Зика-NS1 антителами (GeneTex, Inc) и антителами против кроличьего IgG, конъюгированными с AF555 (ThermoFisher). Затем ядра всех клеток окрашивали DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол). Остаточная инфекционность вируса (%) определялась как отношение NS1-положительных клеток (красные флуоресцентные сигналы) к общему количеству ядер клеток (синие флуоресцентные сигналы) с помощью программного обеспечения Image J. Установлено, что производные ГЛК 2-6 проявляют зависимое от концентрации ингибирующее действие на СРЕ, индуцированное вирусом Зика (Фиг. 1А-5А, верхняя строка) и с высокой эффективностью ингибируют экспрессию белка NS1 in vitro зависимым от концентрации образом (Фиг. 1А-5В, нижняя строка).

Для количественной оценки противовирусной активности и определения 50%-ингибирующей концентрации (IC50) проведен анализ in vitro ингибирующего действия производных ГЛК 2-6 в тесте инфекционности вируса Зика с иммунофлуоресцентным окрашиванием DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол). Установлено, что исследованные производные ГЛК 2-6 являются высокоактивными ингибиторами инфекционности вируса Зика, их 50%-ингибирующая концентрация составила менее 1 мкМ (IC50<1 мкМ) (табл. 1). Амид ГЛК 5 является наиболее высокоактивным соединением, ингибирующим инфекционность вируса Зика с IC50=0.13 мкМ. Терапевтический индекс (TI=СС50/IC50) для соединения 5 >384. Остальные производные ГЛК имели следующие значения IC50 и TI: соединение 2 (IC50=0.40 мкМ, TI>125), 3 (IC50=0.55 мкМ, TI>90.9), 4 (IC50=0.29 мкМ, TI>172) и 6 (IC50=0.56 мкМ, TI>89).

Таким образом, нами впервые обнаружены высокоактивные производные ГЛК, ингибирующие СРЕ, экспрессию (синтез) вирусного белка NS1 и инфекционность вируса Зика in vitro.

Для того, чтобы установить, на какой стадии репликации вируса Зика производные ГЛК 2-6 оказывают ингибирующее действие, был проведен анализ ингибирующей эффективности соединений в зависимости от времени добавления/удаления (time of addition): при одновременном добавлении соединений с вирусом (режим входа) (entry) (начальная стадия инфекции) и добавлении после инфицирования клеток вирусом (режим после входа) (post-entry) (пост-инфекционная стадия). Все исследованные производные ГЛК 2-6 с высокой эффективностью ингибировали репликацию вируса Зика как в режиме входа, так и после входа в зависимости от концентрации (табл. 2).

В режиме входа (entry) наиболее активным соединением является производное ГЛК 6, IC50 которого составила 0.50 мкМ, остальные соединения имели следующие значения IC50: соединение 5 (IC50=0.68 мкМ), 2 (IC50=1.36 мкМ), 3 (IC50=1.09 мкМ), 4 (IC50=0.62 мкМ). В режиме после входа (post-entry) производное ГЛК 6 также показало наивысший ингибирующий эффект на репликации вируса Зика (IC50=0.43 мкМ) по сравнению с другими производными ГЛК (табл. 2). Полученные результаты говорят о высокой (IC50=1-2 мкМ) и сходной по механизму действия противовирусной активности производных ГЛК, среди которых на данной модели наиболее активным является тиадиазол 6, эффективно ингибирующий репликацию вируса Зика как на начальной, так и пост-инфекционной стадии инфекции.

Сущность технического решения подтверждается следующими примерами.

Реагенты и соединения. Все реагенты были получены из компании Acros Organics (США). Растворители перед синтезом перегоняли или сушили по стандартным методикам. Глицирретиновая кислота (ГЛК) (1) была получена из Sigma-Aldrich Со. (США). Соединение 2 (N'-бензилиденгидразид 3β-O-ацетил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овой кислоты) получали согласно [L.A. Baltina, R.M. Kondratenko, A.K. Bulgakov. Synthesis and anti-microbial activity of benzylidenhydrazides of Glycyrrhetic acid. // Russ. J. Bioorg. Chem., 2020, 46 (2), 246-251; doi: 10.1134/S1068162020020065]. Синтез 3-семикарбазона бутил 11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оата 3 и 1,2,3-тиадиазола бутил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оата 6 опубликован в работе [L.A. Baltina, D.M. Shayakhmetova, L.A. Baltina, T.R. Nugumanov. Synthesis of 1,2,3-thiadiazole of butyl Glycyrrhetinate. // Chem. Nat. Compd., 2019, 55 (4), 692-695; https://doi.org/10.1007/s10600-019-02780-х]. Синтез 1,2,3-тиадиазола метил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оата 4 описан в работе [Ch. Gao, F.-J.-Dai, Н.-W. Cui, Sh.-H. Peng, Y. Не, X. Wang, Zh.-F. Yi, W.-W. Qiu. Synthesis of novel heterocyclic ring-fused 18β-Glycyrrhetinic acid derivatives with antitumor and antimetastatic activity. // Chem Biol Drug Des, 2014, 84, 223-233]. Соединение 5 получено хлорангидридным методом из хлорангидрида 3-О-ацетил-ГЛК [L.A. Baltina, jr., M.V. Khudobko, L.R. Mikhailova, L.A. Baltina, V.A. Fedorova, Ya.A. Orshanskaya, V.V. Zarubaev, O.I. Kiselev. Synthesis and antiviral activity of amino-acid conjugates of Glycyrrhetic acid. // Chem Nat Compd, 2014, 50(3), 473-477] и 2-аминопиридина в хлористом метилене.

Пример 1. Синтез производных глицирретиновой кислоты (2-6)

N'-Бензилиденгидразид 3β-О-ацетил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овой кислоты (2). Смесь 30-ацилгидразида 3-О-ацетил-ГЛК (0.5 ммоль) и бензальдегида (0.5 ммоль) в этаноле (10 мл) кипятили 6 ч и разбавляли 1%-ным раствором соляной кислоты (10 мл). Осадок отфильтровывали, промывали водой, сушили и очищали на колонке с силикагелем, элюируя бензолом и смесью бензола: этанола (300:1, 200:1, 100:1, v/v). Индивидуальные по ТСХ фракции объединяли и упаривали. Выход 74% (белый аморфный порошок); [α]_D²⁰+145° (с 0.06, CHCl₃). Лит. [α]_D²⁰+144° (с 0.06, CHCl₃) [L.A. Baltina, R.M. Kondratenko, A.K. Bulgakov. Synthesis and antimicrobial activity of benzylidenhydrazides of Glycyrrhetic acid. // Russ. J. Bioorg. Chem., 2020, 46 (2), 246-251; doi: 10.1134/S1068162020020065]: ИК (ν, см^-1): 3330, 1729, 1652, 1647, 1620. ЯМР ¹H (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 0.73 (3Н, с, СН₃-25); 0.86 (6Н, s, СН₃-23 и СН₃-24); 1.00 (3Н, s, СН₃-28); 1.17 (3Н, s, СН₃-29); 1.25 (6Н, с, СН₃-26, СН₃-25); 1.30 (3Н, с, СН₃-27); 1.50-1.85 (м, СН, СН₂); 2.04 (3Н, с, СОСН₃); 4.52 (1H, м, Н-3); 5.67 (1Н, с, Н-12); 7.26-7.54 (5Н, м, С₆Н₅); 8.95, 8.50 (2Н, оба уш. с, CONH, N=СН). ¹³С ЯМР (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 16.3 (С-25); 16.6 (С-24); 17.3 (С-6); 18.7 (С-26); 21.8 (СОСН₃); 23.3 (С-27); 23.5 (С-2); 26.3; 26.4 (С-15, С-16); 28.0 (С-28); 28.4 (С-23); 29.2 (С-29); 31.2 (С-21); 32.7 (С-7); 31.9 (С-17); 36.8 (С-10); 37.4 (С-22); 38.0 (С-4); 38.8 (С-1); 40.7 (С-19); 43.2 (С-8); 43.3 (С-14); 45.4 (С-20); 48.4 (С-18); 55.0 (С-5); 61.6 (С-9); 80.6 (С-3); 122.0-130.0 (С1'-С6', С-12); 149.0 (N=СН); 170.1 (С-13); 171.1 (СОСН₃); 175.0 (С-30); 200.2 (С-11). Найдено, %: С 75.95; H 8.72; N 4.42. C₃₉H₅4N₂O₄. Вычислено: С 76.18; H 8.85; N 4.56. М=614.83.

3-Семикарбазон бутил 11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оат (3). К раствору бутилового эфира 3-оксо-ГЛК (1 ммоль) в 50 мл этанола добавляли раствор гидрохлорида семикарбазида (6 ммоль) в 5 мл воды, ацетат натрия (6 ммоль) и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 6 часов с контролем по ТСХ. Реакционную смесь разбавляли холодной водой (50 мл), образовавшийся осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из 70% этанола. Выход 83% (белый порошок). [α]_D²⁰+158° (с 0.06, CH₂Cl₂). Лит. [α]_D²⁰+156° (с 0.06, CH₂Cl₂) [L.A. Baltina, D.M. Shayakhmetova, L.A. Baltina, T.R. Nugumanov. Synthesis of 1,2,3-thiadiazole of butyl Glycyrrhetinate. // Chem. Nat. Compd., 2019, 55 (4), 692-695; https://doi.org/10.1007/s10600-019-02780-x]. ИК (ν, см^-1): 3469, 3198, 1725, 1694, 1661, 1568. ЯМР ¹H (500 МГц, ДМСО-d₆, δ, м.д.): 0.71 (3Н, с, СН₃-28); 0.84 (3Н, т, J=4.8; СН₃-34); 0.96 (3Н, с, СН₃-25); 1.04 (6Н, с, СН₃-24, СН₃-27); 1.08 (6Н, с, СН₃-26, СН₃-29); 1.10-1.28 (2Н, м, Н-5, Н-22а); 1.32 (3Н, с, СН₃-23); 1.33-1.41 (2Н, м, H-1a, Н-7а); 1.50-1.59 (2Н, m, Н-15а, Н-22b); 1.70-1,88 (2Н, m, Н-6а, Н-7b); 1.90-2.02 (4Н, m, H-1b, H-6b, Н-15b, Н-16b); 2.28 (1Н, с, Н-9); 2.14-2.22 (2Н, м, Н-19); 2.34-2.42 (2Н, м, Н-21); 2.65-2.70 (5Н, м, 2Н-2, Н-18, 2Н-32); 3.90-4.00 (2Н, м, Н-31); 5.47 (1Н, с, Н-12); 8.53 (1H, с, NH). ¹³С ЯМР (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 13.7 (С-34); 15.5 (С-25); 18.5 (С-33); 18.7 (С-26); 19.2 (С-6); 19.7 (С-23); 23.3 (С-27); 23.8 (С-28); 26.2 (С-2); 26.4 (С-15); 28.3 (С-29); 28.4 (С-24); 28.6 (С-16); 30.6 (С-32); 31.0 (С-21); 31.8 (С-7); 32.1 (С-17); 36.6 (С-22); 37.7 (С-1); 38.6 (С-19); 41.0 (С-10); 41.2 (С-4); 43.3 (С-8); 43.9 (С-20); 45.2 (С-14); 48.3 (С-18); 54.9 (С-5); 60.9 (С-9); 64.1 (С-31); 128.1 (С-12); 158.3 (С-35); 158.5 (С-3); 170.0 (С-13); 176.3 (С-30); 199.5 (С-11). Найдено, %: С 72.10; H 9.45; N 7.15. Вычислено, %: С 72.25; H 9.53; N 7.22. C₃₅H₅₅N₃O₄. M=581.80.

1,2,3-тиадиазол метил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оат (4).

1) Синтез метилового эфира 3-семикарбазона ГЛК. К раствору метилового эфира 3-оксо-ГЛК (1 ммоль) [Толстиков Г.А., Болтина л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.А. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск: Академическое издательство «Гео», 2007. 311 с. ] в 50 мл этанола добавляли раствор гидрохлорида семикарбазида (6 ммоль) в 5 мл воды, ацетат натрия (6 ммоль) и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 6 часов с контролем по ТСХ. Реакционную смесь разбавляли холодной водой (50 мл), образовавшийся осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из 70% этанола. Выход 82% (белые кристаллы). Т.пл. 263-265°С; [α]_D²⁰+162° (с 0.06, CH₂Cl₂). ЯМР ¹H (500 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 0.79 (3Н, с, СН₃-28); 0.99-1.02 (1Н, м, Н-5); 1.05 (3Н, с, СН₃-25); 1.13 (6Н, с, СН₃-24, СН₃-27); 1.16 (3Н, с, СН₃-26); 1.20 (3Н, с, СН₃-29); 1.22-1.28 (2Н, м); 1.33 (3Н, с, СН₃-23); 1.34-1.44 (2Н, м); 1.47-1.65 (3Н, м); 1.78-2.08 (6Н, м); 2.24-2.42 (5Н, м); 2.84-2.88 (2Н, м); 3.67 (3Н, с, ОСН₃); 5.67 (1Н, с, Н-12); 8.18 (1Н, уш. с, NH). ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 15.3 (С-25); 18.6 (С-26); 18.8 (С-6); 19.6 (С-24); 23.3 (С-27); 23.9 (С-2); 26.4 (С-15); 26.5 (С-16); 28.3 (С-23, С-28); 28.5 (С-29); 31.1 (С-21); 31.8 (С-7); 32.3 (С-17); 37.7 (С-1); 36.7 (С-22); 38.5 (С-10); 41.1 (С-4); 41.4 (С-19); 43.3 (С-8); 44.0 (С-20); 45.2 (С-14); 48.4 (С-18); 51.8 (С-31); 55.3 (С-5); 60.9 (С-9); 128.4 (С-12); 158.7 (С-32); 158.2 (С-3); 169.5 (С-13); 176.9 (С-30); 199.6 (С-11). LS-MS: 540.5 [М+Н]⁺. Найдено, %: С 71.12, H 9.10, N 7.94; C₃₂H₄₉N₃O₄. Вычислено, %: С 71.20, H 9.15, N 7.78. M=540.72.

2) Синтез 1,2,3-тиадиазола метилового эфира ГЛК (4). К раствору 3-семикарбазона метилового эфира ГЛК (1 ммоль) в 20 мл хлористого метилена добавляли хлористый тионил (1 мл) и смесь выдерживали при перемешивании в течение 12 ч при комнатной температуре. Затем растворитель упаривали и остаток перекристаллизовывали из 70% этанола. Выход 80% (белый кристаллический порошок). Т.пл. 259-261°С; [α]_D²⁰+155° (с 0.1, CHCl₃). Лит. [Ch. Gao, F.-J.-Dai, H.-W. Cui, Sh.-H. Peng, Y. He, X. Wang, Zh.-F. Yi, W.-W. Qiu. Synthesis of novel heterocyclic ring-fused 18β-Glycyrrhetinic acid derivatives with antitumor and antimetastatic activity. // Chem Biol Drug Des, 2014, 84, 223-233]: Т.пл. 261-264°C. ИК (ν, см^-1): 1731, 1658, 1462, 1377. ЯМР ¹H (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 0.83, 0.86 (2H, м); 1.15 (6Н, с, 2СН₃); 1.20 (3Н, с, СН₃); 1.23 (3Н, с, СН₃); 1.37 (3Н, с, СН₃); 1.43 (3Н, с, СН₃); 1.50 (3Н, с, СН₃); 1.98-2.24 (3Н, м); 2.47-2.63 (1Н, м); 2.79 (1Н, д, J=10.3); 3.00 (1Н, с); 3.69 (3Н, с, ОСН₃); 4.62 (1H, д, J=17.0); 5.75 (1Н, с, Н-12). ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 15.8 (С-25); 18.2 (С-26); 18.4 (С-6); 23.4 (С-24); 23.9 (С-С-27); 26.4 (С-15); 26.6 (С-16); 28.3 (С-28); 28.6 (С-29); 31.1 (С-21); 31.4 (С-23); 31.7 (С-7); 31.8 (С-17); 36.1 (С-4); 37.4 (С-22); 37.8 (С-10); 38.1 (С-1); 41.2 (С-19); 43.4 (С-8); 44.5 (С-20); 46.3 (С-14); 48.4 (С-18); 51.8 (С-31); 52.3 (С-5); 59.8 (С-9); 128.4 (С-12); 145.5 (С-2); 165.0 (С-3); 171.6 (С-13); 176.9 (С-30); 199.5 (С-11). Найдено, %: С 70.80; H 8.52; N 5.30, S 5.86. C₃₁H₄₄N₂O₃S. Вычислено, %: С 70.95; H 8.45; N 5.34; S 6.11. M=524.73.

3β-О-ацетил-20β-(2-аминопиридинилкарбамоил)-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овая кислота (5). К раствору 1 ммоль хлорангидрида 3-О-ацетил-ГЛК [L.A. Baltina, jr., M.V. Khudobko, L.R. Mikhailova, L.A. Baltina, V.A. Fedorova, Ya.A. Orshanskaya, V.V. Zarubaev, O.I. Kiselev. Synthesis and antiviral activity of amino-acid conjugates of Glycyrrhetic acid. // Chem Nat Compd, 2014, 50(3), 473-477] в 15 мл хлористого метилена добавляли 2 ммоль 2-аминопиридина и перемешивали в течение 8 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали, остаток разбавляли 20 мл хлористого метилена, промывали 5% водным раствором NaHCO₃, насыщенным раствором NaCl, водой и сушили над MgSO₄. Продукт хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя бензолом с ТСХ-контролем. Индивидуальные по ТСХ объединяли и упаривали. Выход 70% (желтоватый порошок); [α]_D²⁰+152° (с 0.1, CH₂Cl₂). ИК-спектр (ν, см^-1): 3432, 1730, 1688, 1656, 1592, 1577, 1511, 1505. ¹H ЯМР (500 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): ЯМР ¹H (500 MHz, CDCl₃, δ, м.д.): 0.73 (1H, м, H-5); 0.77 (3Н, с, СН₃-28); 0.84 (6Н, с, СН₃-23, СН₃-24); 0.96-1.02 (2Н, м); 1.07 (3Н, с, СН₃-26); 1.12 (3Н, с, СН₃-29); 1.14-1.18 (1Н, м); 1.21 (3Н, с, СН₃-25); 1.35 (3Н, с, СН₃-27); 1.36-1.42 (3Н, м); 1.47-1.82 (7Н, м); 1.95-1.97 (3Н, м); 2.00 (3Н, с, СОСН₃); 2.21-2.24 (1Н, м, Н-18); 2.33 (1Н, уш. с, Н-9); 2.75 (1Н, д, J=13.5; Н-1_b); 4.49 (1Н, дд, J₁=4.2, J₂=11.4, Н-3); 5.72 (1Н, с, Н-12); 6.99 (1Н, м, H аром.); 7.30 (1Н, с, H аром.); 7.65 (1Н, м, H аром.); 8.02 (1Н, с, H аром.); 8.20 (2Н, м, H аром., NH). ЯМР ¹³С (125 MHz, CDCl₃, δ, м.д.): 16.38 (С-25); 16.67 (С-24); 17.33 (С-6); 18.61 (С-26); 21.31 (СН₃СО); 23.33 (С-27); 23.51 (С-2); 26.35 (С-15, С-16); 28.02 (С-23); 28.38 (С-28); 29.04 (С-29); 31.45 (С-21); 31.94 (С-17); 32.64 (С-7); 36.86 (С-10); 37.45 (С-22); 37.98 (С-4); 38.71 (С-1); 41.34 (С-19); 43.13 (С-8); 44.72 (С-20); 45.31 (С-14); 47.82 (С-18); 54.94 (С-5); 61.65 (С-9); 80.54 (С-3); 114.09 (С аром.); 119.68 (С аром.); 128.58 (С-12); 138.41 (С аром.); 147.53 (С аром.); 151.49 (С аром.); 168.73 (С-13); 170.92 (СН₃СО); 174.64 (С-30); 199.82 (С-11). LS-MS, 589.4 [М+Н]⁺. Найдено, %: С 75.30; H 8.75; N 4.58. C₃₇H₅₂O₄N₂. Вычислено, %: С 75.47; H 8.90; N 4.76. М=588.80.

1,2,3-Тиадиазол бутил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-оат (6). Получен аналогично соединению (4) из 3-семикарбазона (3). Выход 85% (белый кристаллический порошок). Т.пл. 122-124°С; [α]_D²⁰+160° (с 0.06, CH₂Cl₂). Лит. [L.A. Baltina, D.M. Shayakhmetova, L.A. Baltina, T.R. Nugumanov. Synthesis of 1,2,3-thiadiazole of butyl Glycyrrhetinate. // Chem. Nat. Compd., 2019, 55 (4), 692-695; https://doi.org/10.1007/s10600-019-02780-x]. Т.пл. 120-122°C; [α]_D²⁰+158° (c 0.06, CH₂Cl₂). ИК (ν, см^-1): 1726, 1658. ЯМР ¹H (300 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 0.80 (2H, с, СН₃-28); 0.92 (3Н, т, J=7.3, СН₃-34); 1.06 (3Н, с, СН₃-27); 5.71 (1Н, с, Н-12); 1.12 (3Н, с, СН₃-26); 1.17 (3Н, с, СН₃-29), 1.18-1.24 (м, СН, СН₂); 1.37 (3Н, с, СН₃-24), 1.40 (3Н, с, СН₃-25); 1.47 (3Н, с, СН₃-23); 1.55-1.62 (4Н, м, 2Н-32, Н-22b, 15а); 1.74-2.36 (м, СН, СН₂); 2.53 (1H, с, Н-9); 4.06-4.09 (2Н, м, Н-31), 4.36 (1Н, д, J=17, H-1b); 5.71 (1Н, с, Н-12). ЯМР ¹³С (125 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 13.7 (С-34); 15.8 (С-25); 18.2 (С-26); 18.6 (С-6); 19.2 (С-33); 23.3 (С-24); 23.9 (С -27); 26.3 (С-15); 26.6 (С-16); 28.4 (С-28); 28.7 (С-29); 30.7 (С-32); 31.1 (С-21); 31.4 (С-23); 31.7 (С-7); 31.8 (С-17); 36.1 (С-4); 37.4 (С-22); 37.7 (С-10); 38.1 (С-1); 41.2 (С-19); 43.4 (С-8); 44.0 (С-20); 45.3 (С-14); 48.4 (С-18); 52.2 (С-5); 59.8 (С-9); 64.3 (С-31), 128.4 (С-12); 145.5 (С-2); 165.0 (С-3); 170.8 (С-13); 176.4 (С-30); 199.3 (С-11). Найдено, %: С 71.92; H 8.90; N 5.04; S 5.56. C₃₄H₅₀N₂₀O₃S. Вычислено, %: С 72.04; H 8.89; N 4.94; S 5.65. M=566.81.

Пример 2. Исследование цитотоксичности и противовирусной активности производных глицирретиновой кислоты (2-6)

Клетки и вирусы: В работе использовали вирус Зика (штамм PRVABC59). Исследования противовирусной активности производных ГЛК 2-6 в отношении вируса Зика проводили в клетках SF268 (глиобластомы человека), которые культивировали в 10% фетальной телячьей сыворотке (FBS) в поддерживающей модифицированной среде Dulbeco (DMEM) с добавкой пенициллина/стрептомицина.

Цитотоксичность производных ГЛК. Оценка цитотоксичности проводилась с использованием тетратиазолилового красителя (МТТ тест) согласно [Lien J.C., Wang C.Y., Lai H.С., Lu C.Y., Lin Y.F., Gao G.Y., Chen K.C, Huang A.C, Huang S.H., Lin С.W. Structure analysis and antiviral activity of CW-33 analogues against Japanese encepfialitis virus. // Sci. Rep., 2018, 8(1), 16595] в клетках SF268 (3×103 клеток/лунку). Для этого клетки культивировали в 96-луночных планшетах, а затем обрабатывали производными ГЛК в концентрациях 0, 0.1, 10, 20 и 50 мкМ. После 96-часовой инкубации к клеткам добавляли раствор МТТ и проводили 4-х часовую реакцию до восстановления МТТ до пурпурного формазана, концентрацию которого измеряли по оптической плотности (λ OD570-630) с использованием считывающего устройства ELISA. Цитотоксическая концентрация или концентрация, вызывающая 50% гибели клеток (СС50) или 50% выживаемость обработанных клеток по сравнению с контрольными клетками рассчитывалась как выживаемость (%)=(поглощение обработанных клеток/поглощение контрольных клеток)×100%.

Анализы ингибирования цитопатического эффекта (СРЕ), синтеза вирусного белка NS1 и инфекционности вируса Зика. Противовирусную активность производных ГЛК в отношении вируса Зика определяли путем анализа цитопатического эффекта (СРЕ) вируса и экспрессии (синтеза) вирусного белка NS1 в инфицированных клетках. Клетки SF268 инфицировали штаммом вируса Зика PRVABC59 (MOI 0.05) и сразу же обрабатывали производными ГЛК в концентрации 10 мкМ. После 96-часовой инкубации инфицированные клетки окрашивали иммунофлуоресцентным красителем и фотографировали с помощью электронного микроскопа с обращенной фазой для определения СРЕ, вызванного вирусом Зика. Для определения инфекционности вируса Зика клетки SF268 инфицировали вирусом при MOI 0.05 и сразу же обрабатывали производными ГЛК в различных концентрациях (0, 0.1, 1 и 10 мкМ). Изображения индуцированного СРЕ в каждой лунке 6-луночных планшетов получали под микроскопом через 96 часов после обработки. Затем обработанные/инфицированные клетки в каждой лунке проявляли иммунофлуоресцентным красителем для определения остаточной инфекционности вируса Зика после обработки производными ГЛК. Клетки окрашивали кроличьими анти-Зика-NS1 антителами (GeneTex, Inc) и антителами против кроличьего IgG, конъюгированными с AF555 (ThermoFisher). Затем ядра всех клеток окрашивали DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол). Остаточная инфекционность вируса (%) определялась как отношение NS1-положительных клеток (красные флуоресцентные сигналы) к общему количеству ядер клеток (синие флуоресцентные сигналы) с помощью программного обеспечения Image J.

Для количественной характеристики противовирусного действия и определения значений 50% ингибирующих концентраций (IC50) был проведен количественный анализ ингибирующего действия производных ГЛК в тесте инфекционности вируса Зика в культуре клеток SF268 при концентрациях 0.1, 1 и 10 мкМ. Полумаксимальная (50%) ингибирующая концентрация (IC50) производных ГЛК (снижение 50% инфекционности вируса Зика) рассчитывалась в соответствии с ингибирующей активностью. Терапевтический индекс (TI) определяли как отношение СС50 к IC50.

Анализ противовирусной активности в зависимости от времени добавления (time-of-addition). Производные ГЛК в различных концентрациях (0, 0.1, 1, 10 мкМ) добавляли одновременно с вирусом (стадия входа или проникновения, entry) или через 1 час после заражения клеток вирусом (стадия после входа, после проникновения, post-entry) на монослой клеток SF268 в 6-луночных планшетах. Смесь вируса Зика и исследуемого соединения из монослоя клеток отбирали через 1 час после инкубации и использовали повторно. Остаточную инфекционность вируса Зика определяли с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания через 96 часов после инкубации, как описано выше в анализе ингибирования инфекционности.

Таким образом, нами установлено, что производные ГЛК 2-6 не оказывают токсического действия на клетки SF268 (50% цитотоксическая концентрация СС50>50 мкМ) и с высокой эффективностью ингибируют цитопатический эффект (СРЕ) вируса Зика in vitro. Предлагаемые соединения 2-6 являются выокоактивными ингибиторами инфекционности вируса Зика (более 70%), их 50%-ингибирующая концентрация (IC50) составляет менее 1 мкМ. Соединения 2-6 существенно снижают количество (% долю) NS1-положительных клеток в инфицированных клетках SF268 зависимым от концентрации образом. Производные ГЛК 2-6 с высокой эффективностью ингибируют репликацию вируса Зика как в начальной стадии инфекции (режим входа), так и после инфицирования клеток SF268 (режим после входа) вирусом Зика с IC50 1-2 мкМ. Предлагаемые производные ГЛК 2-6 являются высокоактивными ингибиторами вируса Зика и представляют интерес для дальнейших расширенных доклинических исследований в качестве кандидатов в новые противовирусные препараты (фармацевтические субстанции) для терапии и профилактики особо опасной вирусной инфекции Зика.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к применению N'-бензилиденгидразида 3β-О-ацетил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овой кислоты в качестве средства, ингибирующего вирус Зика. Изобретение позволяет с высокой эффективностью ингибировать цитопатический эффект (СРЕ) вируса Зика in vitro, не оказывая токсического действия на клетки SF268 (СС50>50 мкМ). 5 ил., 2 табл., 2 пр.

Применение N'-бензилиденгидразида 3β-О-ацетил-11-оксо-18βН-олеан-12-ен-30-овой кислоты в качестве средства, ингибирующего вирус Зика.