НЕЙТРОПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЕДЕНЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Советский патент 1994 года по МПК C07K5/08 C07K5/10 A61K37/02 

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям - нейропептидам, обладающим поведенческой активностью, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - поиск в ряду пептидов новых химических соединений, обладающих более выраженным стимулирующим действием на процессы памяти, двигательную активность, в меньших дозах - малотоксичных и пригодных для введения доступным интраназальным способом.

Синтез трипептида Ac-D-Met-Pro-Arg проводят последовательным присоединением N-оксисукцинимидных эфиров N -защищенных аминокислот к С-концевым фрагментам: аргинин конденсируют с Вос-Pro-OSu, полученный N -защищенный дипептид Вос-Pro-Arg деблокируют обработкой раствором НСl в этилацетате и пропускают через Амберлит IRA 743 в ОН^-форме, получая свободный дипептид, который конденсируют с Ас-D-Met-OSu, в результате чего получают трипептид Ac-D-Met-Pro-Arg.

Синтез тетрапептида Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ проводят с использованием в реакциях пептидной конденсации дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) в добавлением оксибензотриазола (ОБТ): Boc-Pro-Arg конденсируют с глициламидом, полученный трипептид Вос-Pro-Arg-Gly-NH₂ деблокируют обработкой НСl в этилацетате при взаимодействии Pro-Arg-Gly-NH₂ и N-ацетил-D-метионина в присутствии ДЦГК и ОБТ получают Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂.

В разработанных схемах синтеза защита гуанидиновой группы аргинина осуществляется протонированием, что позволяет получать соединения с минимальным количеством стадий синтеза за счет исключения стадий получения N^G-защищенных производных и отделения защитных групп.

Способ синтеза пептидов Ас-D-Met-Pro-Arg и Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ описан в примерах.

Однородность полученных соединений проверяли методом ТСХ на пластинках Silufol (ЧССР), используя следующие системы: н. бутанол-уксусная кислота-вода, 4: 1: 1 (А); хлороформ-метанол - 25% аммиак 60: 45: 15 (Б); хлороформ-метанол-25% аммиак-уксусная кислота 60: 45: 15: 3 (В); этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 10: 10: 3: 6 (Г). Вещества обнаруживали на хроматограммах при помощи хлорбензидиновой пробы. Удельное вращение исследуемых соединений измеряли на спектрополяриметре J-20 "Jasco" (Япония).

П р и м е р 1. N -трет. бутилоксикарбонил-пролил-аргинин.

К раствору 1,74 г (10 ммоль) аргинина в 8,5 мл воды прибавляют раствор 4,36 г (14 ммоль) Вос-Pro-OSu в 9,0 мл диоксана. Реакционную смесь перемешивают при 20^оС в течение 4 ч после окончания реакции охлаждают до 5^оС, отфильтровывают осадок Вос-Pro-Arg, промывают его на фильтре водой, охлажденной до 3-5^оС (2х2 мл), а затем этилацетатом (3х4 мл), сушат в вакуум-эксикаторе до постоянной массы. Выход Вос-Pro-Arg 2,93 г (79% ). Т. пл. 154-155^оС [ α ] _D²⁰ - 49^о (с 1, метанол), R_f 0,38 (А), 0,71 (Б).

П р и м е р 2. Пролил-аргинин. Суспензию 0,93 г (2,5 ммоль) Вос-Pro-Arg в 7 мл 3,4 н. раствора HCl в этилацетате (ЭА) перемешивают 60 мин, осадок отделяют фильтрованием, промывают ЭА. Высушенный в вакууме Рro-Arg 2HCl ЭА, растворяют в воде и наносят на колонку с Амберлитом IRA 743 (ОН)^- анионит промывают водой. Фракции с рН больше 8 объединяют и упаривают, осадок высушивают над Р₂О₅. Выход Pro-Arg 0,57 г (84% ). Т. пл. 91-93^оС, [ α ] _D²⁰ - 29^оС (с 10 метанол), R_f 0,27 (В), 0,39 (Г).

П р и м е р 3. N-Ацетил-D-метионил-пролил-аргинин,
К раствору 0,41 г (1,5 ммоль) Pro-Arg в 2,5 мл воды прибавляют раствор 0,61 г (2,1 ммоль) N-Ac-D-Met-OSu в 4 мл диоксана, перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 3 ч, растворители отгоняют в вакууме, остаток переосаждают из метанола этилацетатом, выпавший осадок трипептида N-Ac-D-Met-Pro-Arg отделяют фильтрованием. Очистку его проводят колоночной хроматографией на сефадексе ZH-20, используя в качестве элюента смесь растворителей этилацетат-этанол - 0,5 Н-уксусная кислота 2: 3: 1. Фракции, содержащие трипептид, объединяют и упаривают. После сушки в вакууме над Р₂О₅ получают 0,42 г (62% ) N-Ac-D-Met-Pro-Arg. Т. пл. 203-205^о [ α ] _D²⁰ - 25^о (с, 1 метанол). R_f 0,43 (В), 0,56 (Г). П р и м е р 4. N -трет. бутилоксикарбонил-пролил-аргинил-глициламида хлоргидрат.

Смесь 1,11 г (3,0 ммоль) Вос-Pro-Arg и 0,33 г (3,0 ммоль) хлоргидрата глициламида в 7 мл ДМФ перемешивают 2 ч при 20^оС, охлаждают до -5^оС и прибавляют 0,45 г (3,3 ммоль) оксибензотриазола (ОБТ), затем 0,68 г (3,3 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК). Реакционную смесь перемешивают 1 ч при (-5^оС) - 0^оС и 6 ч при 20^oC. Осадок дициклогексилмочевины (ДЦГМ) отделяют фильтрованием, промывают 1 мл ДМФ. К объединенному диметилформамидному раствору прибавляют 25 мл эфира, после уплотнения осадка декантируют слой растворителей, осадок переосаждают из метанола эфиром и сушат в вакууме над Р₂О₅.

Выход Boc-Pro-Arg-Gly-NH₂ HCl 1,28 г (92% ). Т. пл. 85-87^оС, [ α ] _D²⁰ - 51^оС (с 1, метанол). R_f 0,39 (В), 0,51 (Г).

П р и м е р 5. Пролил-аргинил-глициламида дихлоргидрат.

Суспензию 0,93 г (2,0 ммоль) Вос-Pro-Arg-Gly-NH2 HCl в 6 мл 3,4 н. раствора HCl в этилацетате перемешивают в течение 50 мин, затем разбавляют 7 мл эфира. Осадок Pro-Arg-Gly-NH₂ 2HCl ЭA отделяют фильтрованием, промывают его этилацетатом, эфиром, сушат в вакууме над КОН. Получают 0,94 г (96% ) Pro-Arg-Gly-NH₂ 2HCl в виде сольвата с одной молекулой этилацетата [ α ] _D²⁰ - 38^о (с 1, метанол), R_f 0,31 (В), 0,34 (Г).

П р и м е р 6. N-Ацетил-D-метионил-пролил-аргинил-глициламид.

К охлажденному до 3^оС раствору 0,49 г (1,0 ммоль) Pro-Arg-Gly-NH₂ 2HCl ЭА в 3-х мл ДМФ прибавляют 0,135 мл (1,2 ммоль) N-метил-морфолина, через 10 мин - 0,23 г (1,2 ммоль) N-ацетил-D-метионина, 0,16 г (1,2 ммоль) ОБТ, 0,23 г (1,1 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивают при 3-5^оС в течение 1 ч и 3 ч при 20^оС, затем отделяют фильтрованием осадок ДЦГМ, промывают его 0,5 мл ДМФ. К объединенному диметилформамидному раствору прибавляют 15 мл эфира, после уплотнения осадка декантируют надосадочную жидкость, осадок подсушивают в вакууме над Р₂O₅, переосаждают из хлороформа эфиром и из метанола этилацетатом. Осадок отделяют фильтрованием, сушат в вакууме над Р₂О₅.

Выход N-Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ 0,42 г (83% ). Т. пл. 109-110^оС, [ α ] _D²⁰ - 44^о (с 1, метанол). R_f 0,64 (В), 0,42 (Г).

Для подтверждения структуры пептидов был проведен аминокислотный анализ из гидролизатов. Аминокислотный гидролиз пептидов проводили инкубированием образцов в 6 н. растворе HCl при 110^оС в течение 20 ч в запаянных и вакуумированных ампулах. Количественное определение аминокислот в гидролизатах осуществляли при помощи автоматического аминокислотного анализатора ZKV (Швеция).

Аминокислотный состав Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ : D-Met 0,89 (1), Pro 1,00 (1), Arg 0,94 (1), Gly 1,10 (1).

Аминокислотный состав Ac-D-Met-Pro-Arg : D-Met 0,87 (1); Pro 1,00 (1), Arg 0,96 (1).

Эксперименты по изучению влияния пептидов на процессы памяти и другие поведенческие реакции выполнены на самцах белых беспородных крыс массой 180±30 г. Исследуемые пептиды вводили интраназально в водном растворе ежедневно после сеанса обучения. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в эквивалентном объеме (0,02 мл). Выработку условий односторонней реакции активного избегания осуществляли в течение четырех последовательных дней.

Трипептид Ac-D-Met-Pro-Arg в дозах 1 ˙ 10^-3; 1 ˙ 10^-4 и 1 ˙ 10^-5 мг/кг массы животных достоверно (Р < 0,01) усиливал выработку условной реакции активного избегания. Эффект проявлялся тем быстрее, чем выше была применяемая доза пептида. При дозе 1 ˙ 10^-3 и 1 ˙ 10^-4 мг/кг максимальная выраженность эффекта была на второй день, а при дозе 1 ˙ 10^-5 мг/кг - на четвертый день.

Таким образом, трипептид Ас-D-Met-Pro-Arg обладает выраженным стимулирующим влиянием на формирование приобретенного поведения и по активности превосходит в этом отношении вазопрессин в 10-100 раз. В еще большей степени активность этого трипептида превосходит активность известных фрагментов везопрессина - Сys-Pro-Arg-Gly-NH₂ Cys-Pro-Arg.

Тетрапептид Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ в дозах 1 ˙ 10^-5 и 1 ˙ 10^-4 мг/кг массы животного при ежедневном введении после сеанса обучения значительно и достоверно (Р < 0,01) ускорял выработку условной реакции. Наиболее отчетливо отличие от контрольных животных было выражено во второй день обучения. Введение пептида в дозе 1 ˙ 10^-3 мг/кг было менее эффективным. Пептид в дозах 1 ˙ 10^-6 и 5 ˙ 10^-3 мг/кг не оказывал влияния на обучаемость.

Изучали также влияние пептида Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ на двигательную активность животных. Показано, что в дозе 1 ˙ 10^-4 мг/кг через час после введения пептид достоверно увеличивал горизонтальный (Р < 0,01) и вертикальный (Р < 0,05) компоненты двигательной активности и снижал эмоциональную реактивность, оцениваемую по числу актов груминга.

При введении пептида в дозах 1 ˙ 10^-2 мг/кг не было обнаружено аберрации поведения и других патологических изменений.

Таким образом, исследованный тетрапептид Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ обладает выраженным стимулирующим влиянием на формирование приобретенного поведения и по активности превосходит в этом отношении вазопрессии приблизительно во сто раз. В еще большей степени активность изученного тетрапептида превосходит активность известных фрагментов вазопрессина, например Gys-Pro-Arg-Gly-NH₂, Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH₂.

Кроме того, исследованный тетрапептид стимулирует ориентировочно исследовательское поведение. Действие его проявляется при интраназальном введении.

Пептиды - аналоги С-концевого фрагмента аргинил-вазопрессина Ас-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ и D-Met-Pro-Arg не оказывают токсического действия на животных (белых беспородных крыс) в дозах превышающих эффективные соответственно в тысячу и в сто раз. Эксперименты были выполнены на самцах беспородных белых крыс массой 180 ± 30 г при интраназальном введении исследуемых пептидов в дозе 10^-2 мг на килограмм массы. Эффективные дозы, оказывающие положительный эффект на выработку условной реакции избегания болевого раздражителя, составляли для Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH₂ - 10^-5 мг на килограмм массы, а для Ac-D-Met -Pro-Arg - 10^-4 мг на килограмм массы.

В дозе 10^-2 мг/кг оба пептида не оказывали влияния на выработку условной реакции избегания, двигательную, исследовательскую и эмоциональную активность животных. При ежедневном введении пептидов в течение трех дней не было отмечено нарушений в поведении и внешнем виде животных.

Таким образом, при использовании обоих пептидов в высоких дозах не было обнаружено их токсического действия, они могут быть отнесены к категории практически нетоксичных соединений.

Проведенные испытания показали, что описываемые соединения практически нетоксичны: превосходят по активности известный поведенческий активный пептид - вазопрессин и его концевые фрагменты, оказывают свое действие в дозах, в 10-100 раз меньших при широко доступном способе введения. (56) Голубович В. П. и др. Синтез и биологическая активность С-концевых фрагментов вазопрессина. Хим. фарм. журнал, 1988, N 6, с. 675-679.

Мартинович В. П. и др. Синтез и исследование биологической активности концевых фрагментов вазопрессина АВП_5-9 и АВП_4-9. Хим. фарм. журнал, 1989, в печати.

Изобретение касается пептидов, в частности нейропептидов общей ф-лы: N-ацетил-D-Met-Pro-Arg-R, где R = H или Gly-NH₂, обладающих поведенческой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных и менее токсичных веществ указанного класса. Синтез, например, тетрапептида, ведут с использованием в реакциях пептидной конденсации дициклогексилкарбодиимида с добавлением оксибензотриазола. Boc-Pro-Arg конденсируют с глициламидом, и полученный трипептид деблокируют обработкой HCl в этилацетате. При реакции N-ацетил-D-метионина с Pro-Arg-Gly-NH₂ в присутствии указанных веществ получают соответствующий тетрапептид. Эти пептиды обладают более выраженным стимулирующим действием на процессы памяти, двигательной активности при дозах в 10 - 100 раз меньших, чем для вазопрессина, и доступном методе введения, а также меньшей токсичности.

Нейропептиды общей формулы
N-ацетил-D-Met-Pro-Arg-R,
где R = H или Gl_yNH₂,
обладающие поведенческой активностью.