Способ получения нонапептидных или декапептидных производных гормона LH - RH или их фармацевтически приемлемых солей Советский патент 1991 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к способу получения нонапептидных и декапептидных производных гормонов LH-RH или их фармацевтически приемлемых солей - новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения - получение новых производных пептидов - малотоксичных соединений, обладающих высокой способностью стимулировать овуляцию.

Пример 1. В реакционный сосуд пептидного синтезатора Бекмана 990 помещают 0,8 г (0,8 ммоль) бензгидриламино-по- листирол-дивинилбензольной смолы (фирмы Лаб системз. Инк.). К данной смоле последовательно добавляют аминокислоты

в соответствии с программой синтеза, заключающейся в следующем. Стадия 1.

CH2CI2 промывка 1 раз 1,5 мин 2.50% CFsCCteH/CteCk-снятие защиты 1 раз 1,5 мин

3.50% СРзО32Н/СН2С12 - снятие защиты 1 раз 30 мин

4.СНгС 2 промывка 3 раза 1,5 мин

5.10% триэтиламин/СН2С 22 раза 1,5 мин

6.CH2CI2 промывка 3 раза 1,5 мин

7. - аминокислота раствор 1 раз добавление

8.М.М дициклогексилкарбодиимир раствор 1 раз добавление

9.CH2CI2 полоскание и выдерживание сочетание 1 раз реакция сочетания 2 ч

10.CH2CI2 - полоскание добавление

1раз 1,5 мин

11.CH2CI2-промывка Зраза 1,5 мин

12.Этанол - промывка Зраза 1,5 мин

13.CH2CI2 промывка Зраза 1,5 мин Стадии 1-13 завершают цикл сочетания

для одной аминокислоты, и завершение реакции проверяют с помощью нингидрино- вого метода.

Смолу сочетают последовательно с 2,5-молярным избытком каждой защищенной аминокислоты и ДСС. Так, смолу обрабатывают во время последовательных циклов сочетания с -0,433 г Boc-Gly-OH, 0,432 г Вос-Рго-ОН, 0,857 г Boc-Arg (то- , 0,462 г Boc-Lei-OH, 0,504 г Вос- 3-(2 нафтил)-0-аланина и 0,272 г 1-оксибензотриазола, 0,724 г N-Boc, 0-2- бромбензоилоксикарбонил-сИгирозина, 0,59 г Boc-Ser (бензил ОН, 0,608 г Вос-Тгр-ОН, 0,654 г Boc-Hls (тозил)-ОН, и 0,524 г пиро- глютаминовой кислоты.

Смолу удаляют из реакционного сосуда, промывают метиленхлоридом и сушат в вакууме, получая 2,0 г защищенной полипеп- тидной смолы.

Полипептидный продукт одновременно удаляют из смолы и полностью деблокируют с помощью обработки безводным жидким фтористым водородом. Смесь 2,0 г защищенной полипептидной смолы и 2 мл анизола (акцептор) в реакционном сосуде Kel-F обрабатывают 20 мл повторно перегнанного (из СоРз) безводного жидкого HF при 0°С в течение 30 мин. Н F упаривают под вакуумом, и остаток (nnpo)-Glu-Hls-Trp-Ser- Туг-3-(2-нафтил)-0-аланил-с111-Агд-Рго-С1у- NH2B виде его НРсоли промывают простым эфиром. Остаток затем экстрагируют ледяной уксусной кислотой. Экстракт в уксусной кислоте лиофилизируют, получая 0,8 г неочищенного вещества.

Неочищенный полипептид помещают на колонку Амберлит ХАД-4 размером 4x40 см (полистирол - 4%-ный дивинил- бензольный сополимер) и элюируют вогнутым градиентом от воды (0,5 л) до этанола

2(1 л). Пробирки, содержащие фракции от вытекающего потока объемом 690 мл до

1,470 мл, сливают и отпаривают досуха, пол- учая 490 мг частично очищенного полипептида.

Образец в 150 мг частично очищенного продукта подвергают распределительной хроматографии на колонке размером 3x50 см из Сефадекса - С-25 с использованием системы растворителей 1-бутанол(то- луол)уксусная кислота/вода, содержащей 1,5% пиридина в соотношении 10:15:12:18. Чистые фракции сливают на основе данных

тонкослойной хроматографии (силикагель, BuOH(H20)HOAc (EtOAc, 1:1:1:1) и HPLC/5 микрон, обратная фаза, октадецилсилиль- ная насадка, 40% 0,03 М NH4 ОАс/60% аце- тонитрил). Желаемый продукт выходит с колонки в фракциях вытекающего потока объемом от 1000 мл до 1400 мл (Rf 0.1). Чистые фракции объединяют, отпаривают досуха, берут в воду и лиофилизируют, получают 57 мг чистого пиро-глютамил-гисти- дил-триптофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил) -D- аланил-лейцил-аригинилпролил-гли- цинамида в виде его аддитивной соли уксусной кислоты D - 27,4° (с 0,9, НОАс), Т. пл. 185-193°С(разл.).

Данные аминокислотного анализа:

D-Nal(2)6J LHRH

Ser0.82 (1)

Glu0,97

Pro0,93

Gly0,97

Leu0,99

Tyr1,10

His1,06

NHa0,95

Trp0,95

Arg0,99

Nal (2)0,96

Пример 2. Для синтеза аналогов с С-концевым Ргс-МН-СНаСНз используют программу синтеза, идентичную программе, описанной в примере 1. Реакционный сосуд синтезатора Бекмана 990 загружают 2,13 г BOc-Pro-0-смолы, приготовленной по реакции эквимолярных соотношений сухой цезиевой соли Вос-Рго-ОН с хлорме- тил-полистирол/1% дивинилбензолом(Лаб. Системз. Инк,). Взятое количество Вос-Рго- 0-смолы содержит 1,4 ммоль пролина.

Смолу сочетают последовательно с 2,5- молярным избытком каждой защищенной аминокислоты и ДСС. Смолу вводят в реакцию во время последовательных циклов со- .четания с 1,61 г Boc-Arg (тозил)-ОН, 0.93 г Boc-Lei-OH H20. 0,94 г Вос-3-{2-нафтил}-0- аланина и 0,49 г 1-оксибензотриазола, 1,75 г М-Вос-0-2-бромбензилоксикарбонил - титрозина и 1,11 г Boc-Ser (бензил)-ОН.

В данный момент синтеза количество защищенной полипептидной смолы делят пополам, и одну половину обрабатывают до завершения процесса с помощью последовательной реакции с 0,57 г Вос-Тгр-ОН, 0,77 г Boc-Hls (тозил ОН, 0,21 г пироглюта- миновой кислоты.

Смолу удаляют из реакционного сосуда, промывают метиленхлоридом и сушат в вакууме, получая 2,26 г защищенной полипептидной смолы.

Повторяя вышеописанную процедуру и заменяя уксусную кислоту другими кислотами во время уравновешивания смолы, получают, например, соответствующие соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной, азотной, бензойной кислот и аналогичных.

Аналогично получают аддитивные соли кислот других соединений формулы 1.

B.В случае, если соли обладают низкой растворимостью в воде, их получают с помощью осаждения водой с использованием нужной кислоты. Например: цинковая соль дубильной кислоты - раствор 10 мг уксуснокислой соли (пиро)глютамил-гистидил-трип- тофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил)-0-ала- нил- лейцил-аргинил)пролил-глицин-МН2 в 0,1 мл воды обрабатывают раствором 8 мг дубильной кислоты в 0,08 мл 0,25 М раствора гидроокиси натрия. Раствор 5 мг сульфата цинка в виде гептагидрата в 0,1 мл воды немедленно добавляют к раствору LN- RH-аналога.

Полученную в результате суспензию разбавляют 1 мл воды и осадок центрифугируют. Поверхностный слой декантируют и остаток промывают дважды 1 мл порциями воды при центрифугировании осадка и декантировании поверхностного слоя. Осадок сушат в вакууме, получая 15 мг смешанной цинковой соли дубильной кислоты и вышеназванного LH-RH-аналога.

Соль памовой кислоты - к раствору 50 мл уксуснокислой соли (пиро)глютамил-гисти- дил-триптофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил) -D-аланил- лейцил-аргинил-пролил-глицил- NH2 в смеси 1,6 мл этанола и 0,1 мл 0,25 М гидроокиси натрия добавляют раствор 11 мг памовой кислоты в 0,3 мл 0,25 М гидроокиси натрия. Растворители удаляют при пониженном давлении и остаток суспендируют в 2 мл воды, центрифугируют и поверхностный слой декантируют. Остаток промывают 1,5 мг воды, центрифугируют и поверхностный слой декантируют. Осадок сушат в вакууме, получая 54 мг соли памовой кислоты вышеназванного LH-RH-аналога.

Аналогичным образом получают другие соли с низкой растворимостью в воде.

C.Приготовление аддитивной соли кислоты из свободного пептида.

К раствору 50 мг (пиро)глютамил-гисти- дил-триптофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил) -D-аланил- лейцил-аргинил-пролил-гли- цилЧМНа в виде свободного основания добавляют 30 мл 1 н. уксусной кислоты. Полученный в результате раствор лиофи- лизируют, получая 50 мг уксуснокислой соли вышеназванного LH-RH аналога.

Аналогично, заменяя уксусную кислоту другими кислотами (в стехиометрически эквивалентных количествах по отношению к пептиду), получают другие аддитивные

соли кислот соединений формулы (1), например соли с соляной кислотой, бромистоводородной, серной, фосфорной, азотной кислотой.

D. Приготовление соли с катионом ме0 талла, например, соли цинка.

К раствору 50 мг уксуснокислой соли (пиро)глютамил-гистидил-триптофил-серил -тирозил-3-(2-нафтил}-Ь аланил- лейцил-ар- гинил-пропил-глицил NH2 в смеси 0,4 мл

5 0,25 М гидроокиси натрия 0,3 мл воды и 1 мл этанола добавляют раствор 15 мг сульфата цинка в виде гептагидрата в 0,2 мл воды. Осадок центрифугируют и поверхностный слой декантируют. Осадок промыва0 ют 1 мл воды при центрифугировании и декантировании поверхностного слоя. Осадок сушат в вакууме, получая 48 мг цинковой соли вышеназванного LH-RH аналога.

Аналогичным образом получают соли с

5 другими многовалентными катионами, например соль кальция, висмута, бария, магния, алюминия, меди, кобальта, никеля, кадмия и аналогичные.

Пример 5. Раствор 50 мг уксуснокис0 лой соли (пиро)глютамил-гистидил-трипто- фил-серил-тирозил-3-(2-нафтил)-6- аланил-лейцил-аргинил-пролил-глицил-МНа в 25 мл воды пропускают через колонку с 50 г Дауэкс 1 (сильно основная, четвер5 тично-аммониевая анионообменная смола), которая предварительно была уравновешена гидроокисью натрия рас- твором ее для получения счетчика гидрок- сидного иона. Колонка элюируется 15015 л

0 воды, элюент лиофилизируют, получая 45 мг соответствующего полипептида в виде свободного основания.

Аналогично превращают в свободные основания другие аддитивные соли кислот

5 соединений формулы (1), например, соли, упомянутые в примере 4.

Пример 6. Биологические испытания описываемых соединений. Подавление течки у крыс.

0 Процедура: Самки крыс (Hilltop. Sprague Dawley) приблизительно 200 г с открытыми влагалищами взвешиваются сгруппированными по 5 на клетку и 2 клетки на группу. Крыс инъекцируют подкожно, два

5 раза в день (за исключением указанного ниже) в течение 14 дней. Ежедневно берутся мазки из влагалища для определения стадии цикла течки, и регистрировался вес тела в 0,1 и 2 недели. Регистрируют процент самок, показывающих частичное подавление

Защищенный полипептид отделяют от смолы с помощью аминолиза 25 мл этила- мина в течение 18 ч при 2°С. Этиламину дают возможность испаряться, и смолу экстрагируют метанолом. Метанол упаривают, получая 1,39 г пиро-Clu -Hls тозил - Тгр-8ег-(бензил)-Туг(2-бромбензилоксикар- бонил)-3-2-нафтил -0-аланил -1 е1-Агд-(то- зил)-Рго-МН-СН2СНз.

Неочищенный полипептид деброкиру- ют обработкой смесью 3 мл анизола и 30 мл повторно перегнанного (из СоРз) безводного жидкого HF при 0°С в течение 30 мин в реакционном сосуде Kel-F. HF упаривают под вакуумом и остаток промывают простым эфиром. Остаток растворяют в 2М уксусной кислоте и лиофилизируют, получая 0,82 г неочищенного (пиро) Glu-Hls-Trp- 8ег-Туг-3-(2-нафтил)0-аланин-1 е1-Агд-Рго МН-СНа-СНз в виде его уксуснокислой аддитивной соли. Конечную очистку достигают с помощью препаративной жидкостной хроматографии с высокими рабочими характеристиками образца в 20 мг на колонке размером 0.9x550 мм из 40-50 мк октаде- цилсилилированного крепнезема (Мерк, Ликропреп Сш). Элюентом служит смесь 64% 0,03 М NH40Ac/36% ацетонитрила. За четыре лиофилиэации очищают всего 61 мг неочищенного вещества. После трех лиофи- лизаций из воды получают 15 мг чистого этил амида п и ро-гл ютамил-О-ал анил-лей- цил-аргинил-пролина в виде его аддитивной соли уксусной кислоты, Т. пл. 180-190°С. apD-ST td.l.HoAc).

Повторяя вышеописанную процедуру отщепления и заменяя этиламин стехио- метрическим количеством н-бутиламина, цикло пропил амина, циклогексиламина, трифторметиламина, пентафторэтиламина. и 2,2,2-трифторэтиламина, получают соответствующий н-бутиламид, циклопропила- мид, циклогексиламид, трифторметиламид, пентафторэтиламид и 2,2,2-трифторэтила- мид вышеупомянутого нонапептида.

Данные аминокислотного анализа:

Des Gly16 D-Nal (2)6 ProNHEt9 LHRH

Ser0,91 (1)

Glu 1,01

Pro0,99

Leu1,02

Tyr1,00

His0,97

ЫНз1.06

Trp1,06

Arg1,00

Nal(2) . 1,08

ПримерЗ. (Пиро)С1и-Н18-Тгр-8ер-Туг- 3-(2-нафтил)-О-А1ё-1-еи-Агд-Рго-А2а Gly NHa.

Соединения формулы I, в которой Z представляет собой-NH-C(0 NH-R2, получают с помощью классического синтеза раствора.

Например, может быть использован следующий путь, где AzaGlyNH2 представляет собой NH-NH-C(0)-NH2.

Сочетание индивидуальных фрагментов может протекать по методу ацилазида, по

методу сочетания ДСС/НВТ или с помощью других приемов рацемизационного сочетания свободных фрагментов. Соединения (1) и (2) известны. Соединение (3) приготавливают из (2) путем удаления Свз и нитрогрупп

с помощью гидрогенолиза с последующим сочетанием с Ы-Вос-3-(2-нафтил)-0-алами- ном с использованием ДСС/НВТ или другого агента сочетания, известного в данной области: af5D - -34,3 (С 0,34 НОАс). Аминокислотный анализ; Сер 0,74 (1); Глу 0,89 (1), Про 0,94 (1), Лай 0,98 (1), Тир 1,00 (1), Гис 1,03 (1), МНз 1,13(1),Трп 1.01(1), АргО,99(1), Мал (2), 1,08(1).

Tyr-Оме CdL-Leu-Arg-Pro-AlaGlyNH2 (1) JN02 (2)

(pyro)G u-Hls-Trp- Boc-3-(2-naphthyl-D- Ser-Tyr-NaAla-Leu-Arg-Pro-AzaGly

NH2H+

35

Мз-(2- naphthyl)-D-Ala- Leu-Arg-Pro-A2aGly-NH2

(3)

г } I 4- 5 (pyro) GlM-H s Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D789 °

Ala-Leu Arg-Pro-Ala-Gly-NH2

Схема синтеза соединения 1, где Z - NH(NHC(0)NH2.

П р и м е р 4. А. Раствор 0,1 г фтористоводородной соли (nHpo}Glu-Hls-Trp-Ser-Tyr- Зн(2-нафтил)-0-А1а-Lel:Arg-prfr-Gly-NH2 (см. пример 1) растворяют в 50 мл воды и пропускают через колонку, наполненную

50 г анионообменной смолы Дауэкс 3. которая предварительно была уравновешена уксусной кислотой и промыта деионизиро- ванной водой. Колонка элюируется деио- низированной водой, и вытекающий поток

лиофилизируют, получая соответствующую уксуснокислую соль (пиро)глютамил-гисти- дилтриптофил-серил-тирозил-3-(2-нафтил) -D-аланил- лейцил-аргинил-пропил-глицил- МН2. -27.5° (с 0,9, НОАс).

течки (т.е. только диэструс, но не эструс) с 4-го дня и процент самок, показывающих полное подавление эструса (т.е. только диэструс) с 4-го дня. Величины ЕДво выводятся из прямой линии зависимости процентных данных подавления эструса. LHRH-аналоги назначались в виде их ацетатных солей в физиологическом солевом растворе, содержащем 0,1% альбумина бычьей сыворотки. Объем инъекции со- став,лял 0,2 мл, аналог присутствовал в дозе 0,05, 0,1, 0,2 или 0,4 мкг.

Контрольная группа (физиологический раствор) не показывала никакого подавления эструса. Величины ЕДю для объединен- ных групп с частичным и полным подавлением эструса следующие:

СоединениеЕДзо (мкг/инъекц)

1. (Пиро)глютамил-гистидилтриптофил-серил-тирозил3-{2-нафтил)-0-аланиллейцил-аргинил-глицил-МНа 0,08

2.(Пиро)глютамил-гистидилтриптофил-серил-тирозил3-{2-нафтил)-0-аланиллейцил-аргинил-пролил-NHEt 0,11

3.(Пиро)глютамил-гистидил- триптофил-серил-тирозил- 3-(2-нафтил)-0-ананил- лейцил-аргинил-пролил- азаглицил-МНа0,04

4.Соединение для сравнения:

. D-Trp/6-LHRH0.08

Проведенные испытания.показали, что соединения, полученные в условиях описываемого способа, малотоксичны и обладают высокой способностью стимулировать овуляцию.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения нонапептидных или декапептидных производных гормона LH- RH общей формулы

(пиро)С1у-Н18-Тгр-5ег-Туг-3-{2-нафтил}- dAla-Leu-Arg-Pro-Z,

где Z GlyNHz, NHNHC(0)NH2, или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что соединения общей формулы II:

20

(пиро)С1и-Н18-Тгр-8ег-Туг-3-(2-нафтил - RlR2 R3

dAla-Leu-Arg-Pro-Z -(S)d .

где RI - тозил; R2 - бензил;

Рз - 0-бромбензилоксикарбонил; Z - Gly или отсутствует, d 1 или 0;

S - сополимерная подложка на основе

замещенного стирола или сополимера стирола с дивинилбензолом, обрабатывают фтористым водородом и целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли.

Изобретение касается нонапептидных или декапептидных производных гормона /H-RH, в частности соединений общей ф-лы I: (пиро) С1и-Н18-Тгр-8ег-Туг-3-(2-нафTMj-d-Ala-Leu-Arg-Pro-Z, где Z - Gly-NHz или NH-NH-C(0)-NH2, или их фармацевтически приемлемых солей, способных стимулировать овуляцию, что может быть использовано в медицине. Цель изобретения - создание новых более активных и менее токсичных пептидов. Их синтез ведут обработкой фтористым водородом соединения ф-лы II: (nHpo)Gly-Hls-Trp-Ser-Tyr3-(2-нафтил)-а -А1а-1 еи-Агд-Рго-г1-(5)с1, где RI - тозил; R2 - бензил; Ra - 0-бромбен- зилоксикарбонил; Z - Gly или отсутствует, d 0 или 1,5- сополимерная подложка на основе замещенного стирола или сополимера стирола с дивинилбензолом. Целевой продукт выделяют в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли. .Новые пептиды активны в дозе 0,04-011 мкг и малотоксичны.