РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pL-ASP-08 И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli XL1-blue/pL-ASP-08 - ПРОДУЦЕНТ L-АСПАРАГИНАЗЫ Российский патент 2010 года по МПК C12N15/00 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается новой плазмиды pL-ASP-08 и нового штамма бактерий Escherichia coli XL1-blue/ pL-ASP-08, который может быть использован для получения высокоочищенной генно-инженерной L-аспарагиназы, применяемой для изготовления лекарственных препаратов при лечении лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулосарком в комбинированной химиотерапии.

L-аспарагиназа (L-аспарагинамидогидролаза, ЕС3.5.1.1), относящаяся к треониновым амидогидролазам, катализирует гидролитическое расщепление L-аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и аммиака и является одним из ключевых ферментов, осуществляющих взаимосвязь азотистого и углеродного обмена у про- и эукариотических организмов. В быстроделящихся лейкозных клетках гидролиз аспарагина, катализируемый L-аспарагиназой, приводит к нарушению биосинтеза белков и гибели опухолевых клеток, подавлению роста опухоли (Biochem. Pharmacol. 1985, 34, 559-565; Keefer JF, Moraga DA, Schuster SM et al). Таким действием обладает L-аспарагиназа из Escherichia coli, Ervinia caratovora, Ervinia chrysanthemi и некоторых других микроорганизмов (ж-л «Вопросы медицинской химии», 2000, №6, 3-18). При наличии нескольких изоферментов L-аспарагиназы в E. coli противоопухолевое действие оказывает лишь один из них - изоформа ЕсА2, кодируемая геном ansB (UniProtKB/Swiss-Prot, ASPG2_ECOLI, Accession number P00805).

Известны рекомбинантная плазмидная ДНК pBADLANS для получения штамма-продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы и штамм E.coli TCAR-LANS - продуцент рекомбинантной L-аспарагиназы. (Пат. РФ №2221868, МКИ C12N, опубл. 2004).

Недостатком известного технического решения является невысокая экспрессия L-аспарагиназы - не выше 10%.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения рекомбинантной L-аспарагиназы, включающий создание рекомбинантной плазмидной ДНК pACYCLANS, содержащей ген L-аспарагиназы Erwina carotovora и культивирование штамма E. coli, трансформированного рекомбинантной плазмидной ДНК pACYCLANS с последующим выделением L-аспарагиназы (Патент РФ №2224797, МКИ C12N, опубл.2004). Недостатком известного способа является невысокое содержание рекомбинантной L-аспарагиназы - не более 12% от общего белка клеток.

Изобретение решает задачу создания рекомбинантного штамма - продуцента L-аспарагиназы с высоким содержанием фермента.

Поставленная задача решается за счет создания рекомбинантной плазмидной ДНК pL-ASP-08 длиной 4471 п.о. с молекулярной массой 2,9 МДа, кодирующей аминокислотную последовательность L-аспарагиназы, и состоящей из BamH1/HindIII фрагмента плазмиды pL-ASP-08 длиной 3425 п.о., содержащего участок ori инициации репликации плазмиды, гибридный промотор транскрипции lac О, терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli Stop codons, ген β-лактамазы bla, определяющий устойчивость к ампициллину, уникальный сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазой Xho I; и искусственной последовательности ДНК - фрагмента BamH1/HindIII длиной 1046 п.о., включающего синтетический ген L-аспарагиназы и содержащего уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами BamHI и HindIII.

А также поставленная задача решается за счет штамма бактерий Escherichia coli XL-blue/pL-ASP-08 - продуцента рекомбинантной L-аспарагиназы, содержащего плазмидную ДНК pL-ASP-08.

Исходной плазмидой для конструирования нового гена, кодирующего фермент L-аспарагиназу, служит плазмида pQE-30 (QIAGEN, Cat. No 33203). Для получения синтетической ДНК (1046 п.о.), содержащей фрагмент, кодирующий аминокислотную последовательность фермента L-аспарагиназы, проводят полимеразную цепную реакцию на матрице суммарной ДНК Е. Coli H42. Встраивание полученной синтетической ДНК в исходную плазмиду с помощью реакции лигирования приводит к получению искомой плазмиды pL-ASP-08.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pL-ASP-08, кодирующая L-аспарагиназу с аминокислотной последовательностью L-аспарагиназы, характеризуется следующими признаками:

Имеет молекулярную массу 2,9 МДа (4471 п.о.);

кодирует L-аспарагиназу;

состоит из BamH1/HindIII фрагмента плазмиды pL-ASP-08 длиной 3425 п.о., содержащего участок ori инициации репликации плазмиды, гибридный промотор транскрипции lac О, терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli Stop codons, ген β-лактамазы bla, определяющий устойчивость к ампициллину, уникальный сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазой Xho I, и искусственной последовательности ДНК - фрагмента BamH1/HindIII длиной 1046 п.о., включающего синтетический ген L-аспарагиназы и содержащего уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами BamH1 и Hind III.

Для получения штамма-продуцента L-аспарагиназы трансформируют компетентные клетки Escherichia coli XLl-blue (rec A1 end A1 gyr A96 thi-1 hsdR17 sup E44 rREl F1 lac [F' proAB lac I^qZ^ΔM 15 Tn10 (Tet^R)]) плазмидной ДНК pL-ASP-08.

Полученный штамм, названный Е. coli XL1-blue/pL-ASP-08, характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки

Клетки мелкие, палочковидной формы, грамотрицательные, 1^x3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии округлые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки

Клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Генетические признаки

Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости к антибиотику в ДНК рекомбинантной плазмиды pL-ASP-08.

Условия хранения

Штамм бактерий E. coli XL-blue/pL-ASP-08 хранят на чашках и косяках при 4°С. Пересевы на свежие среды проводят один раз в месяц. Может храниться не менее одного года в среде LB, содержащей 15% глицерина, при -70°С.

Устойчивость к антибиотикам

Клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pL-ASP-08.

Предлагаемое изобретение обеспечивает синтез L-аспарагиназы в изоформе ЕсА2 с уровнем экспрессии не ниже 30-35% и активностью фермента 240-250 МЕ/мл культуральной жидкости.

Изобретение иллюстрирует чертеж, на котором показана физическая карта рекомбинантной плазмиды pL-Asp-08. Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: Xho I - 1, BamHI -148, Hind III - 1194

ori - участок инициации репликации плазмиды,

lac О - гибридный промотор транскрипции,

Stop codons - терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli,

L-asparaginase - область, кодирующая L-аспарагиназу.

bla - ген β-лактамазы.

Изобретение иллюстрируют примеры

Пример 1.

Получение плазмиды pL-Asp-08.

Получение плазмиды pL-Asp-08 проводят в три этапа.

1. Наращивают культуру клеток природного штамма Е. Coli H42 в 200 мл культуральной среды, содержащей кукурузный экстракт и минеральные соли, в течение 16 часов. Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием 10 мин при 6000 об/мин. Клетки 1 г биомассы ресуспендируют в 20 мл Трис-HCl буфера, рН 7,5 и разрушают ультразвуковой обработкой (10 импульсов по 30 с при +4°С). Из полученной суспензии выделяют тотальную ДНК клеток стандартным методом щелочного лизиса (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press). Полученная ДНК является матрицей в полимеразной цепной реакции (ПЦР) получения фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность L-аспарагиназы.

2. На основании нуклеотидной последовательности гена ansB, приведенной в базе UniProtKB/Swiss-Prot:P00805 для L-аспарагиназы формы ЕсА2, синтезируют праймеры (прямой - GGATCCGAGTTTTTCAAAAAG…, и обратный - TGACCGCAGCTGATAAAGCCT…) для наработки фрагмента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность L-аспарагиназы, с помощью ПЦР. Полимеразную цепную реакцию проводят в стандартных условиях (Mullis K.B., Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction, Ann Biol Clin (Paris). 1990,48(8):579-82), в результате получают искусственную последовательность ДНК, фрагмент BamH1/HindIII длиной 1046 п.о., кодирующий аминокислотную последовательность L-аспарагиназы.

3. Исходную плазмиду pQE-30 (QIAGEN, Cat. No 33203) обрабатывают рестрикционными эндонклеазами BamH1 и HindIII и с помощью фермента ДНК-лигазы проводят встраивание в нее полученного синтетического фрагмента BamH1/HindIII длиной 1046 п.о., кодирующего аминокислотную последовательность L-аспарагиназы по стандартной методике (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sambrook,, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Sping Harbor Laboratory Press).

Правильность нуклеотидной последовательности созданной плазмиды pL-Asp-08 подтверждают рестриктным анализом по уникальным сайтам узнавания рестрикционными эндонуклеазами Xho I, BamHI и Hind III, а также установлением нуклеотидной последовательности области клонирования фрагмента (координаты 1-1210 п.о. по физической карте плазмиды pL-Asp-08) секвенированием.

Плазмиду хранят в 10 мМ Трис-HCl буфере рН 8,0, содержащем 1 мМ ЭДТА, при - 70°С неограниченное время.

Физическая карта плазмиды приведена на чертеже.

Пример 2.

Получение штамма E.coli XLl-blue/pL-ASP-08.

Получение штамма и проверку активности синтезируемой L-аспарагиназы проводят в три этапа.

1. Штамм E. coli XLl-blue/pL-ASP-08 получают путем введения плазмиды pL-ASP-08 в компетентные клетки Escherichia coli XL1-blue с помощью электропорации. Для получения компетентных клеток бактериальные клетки исходного штамма Escherichia coli XL1-blue-(rec A1 end A1 gyr А96 thi-1 hsdR17 sup E44 rREl F1 lac [F' proAB lac I^qZ^ΔM 15 Tn10 (Tet^R)]), (STRATAGENE: кат. номер: 200268) выращивают в 10 мл жидкой среды LB в течение ночи при 37°С и пересевают в 1 литр той же среды. Наращивание продолжают еще 2,5 часа при 37°С на качалке при интенсивной аэрации, а затем быстро охлаждают во льду. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 8000 об/мин при +4°С на центрифуге JA21 (Beckman, США). Осадок один раз промывают в равном объеме, т.е. в 1 л деионизированной воды. Осажденные клетки ресуспендируют 1/2 объема 10% глицерина, после осаждения клетки ресуспендируют 1/4 объема 10% глицерина и снова центрифугируют, полученный осадок ресуспендируют в 3 мл 10% глицерина, разливают в охлажденные пробирки «Эппендорф» по 40 мкл, быстро замораживают и хранят при -70°С.

2. Введение плазмиды pL-ASP-08 в компетентные клетки E. coli XL1-blue проводят в стандартном режиме метода электропорации. Полученные клетки штамма Е coli XL1-blue/pL-ASP-08 вносят в 10 мл среды LB и выращивают при 37°С в течение ночи. Полученная культура клеток является инокулятом для наращивания культуры при определении продуктивности штамма E. coli XL1-blue/pL-ASP-08.

3. Для определение продуктивности штамма-продуцента L-аспарагиназы E. coli XL1-blue/pL-ASP-08 в 15 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, вносят 1% инокулята и выращивают при 37°С на качалке при 180 об/мин в течение 2 ч. Затем добавляют индуктор изопропилтиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжают наращивание в тех же условиях еще 2,0 ч. Из культуральной жидкости отбирают пробу 1 мл и центрифугируют 6 мин при 12000 об/мин, после чего клетки ресуспендируют в 100 мкл деионизированной воды, добавляют 33 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 3% додецилсульфата натрия, 3% меркаптоэтанола и 0,01% бромфенолового синего и прогревают 10 мин при 100°С. Отбирают аликвоту (3 мкл) и анализируют электрофорезом в 12% полиакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия. Гель окрашивают Кумаси R250 и проводят цифровую обработку геля с помощью программы TotalLab. Продуктивность штамма E. coli XL1-blue/pL-ASP-08 составляет 35% фермента от суммарного клеточного белка, а содержание L-аспарагиназы в 1 мл культуральной жидкости составляет 165 мкг.

В) Определение активности L-аспарагиназы в культуре клеток E. coli XL1-blue/pL-ASP-08.

Активность L-аспарагиназы в культуре клеток E. coli XL1-blue/pL-ASP-08 определяют по ее способности к расщеплению L-аспарагина с последующим спектрофотометрическим тестированием образовавшегося иона аммония (Worthington Enzyme Manual, 1993 Edition). Для этого 1 мл культуры клеток вносят в 39 мл дистиллированной воды. Из разбавленной суспензии в реакцию берут 100 мкл. После остановки реакции трихлоруксусной кислотой пробу центрифугируют 10 мин при 7000 об/мин и отбирают супернатант для спектрофотометрического определения иона аммония с реактивом Несслера. Активность L-аспарагиназы составляет 42,1 МЕ/мл, или в перерасчете на белок - 255 МЕ/мг.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается новой плазмиды pL-ASP-08 и нового штамма бактерий Escherichia coli XL1-blue/pL-ASP-08, содержащего данную плазмиду. Рекомбинантная плазмидная ДНК pL-ASP-08 имеет молекулярную массу 2,9 МДа (4471 п.о.) и предназначена для синтеза L-аспарагиназы. Изобретение позволяет получать высокоочищенную генно-инженерную L-аспарагиназу для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулосарком в комбинированной химиотерапии. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pL-ASP-08, имеющая молекулярную массу 2,9 МДа (4471 п.о.), предназначенная для синтеза L-аспарагиназы, состоящая из: BamH1/HindIII фрагмента плазмиды pL-ASP-08 длиной 3425 п.о., содержащего участок ori инициации репликации плазмиды, гибридный промотор транскрипции lac О, терминатор транскрипции рибосомного оперона Е. coli Stop codons, ген β-лактамазы bla, определяющий устойчивость к ампициллину, уникальный сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазой Xho I; и искусственной последовательности ДНК-фрагмента BamH1/HindIII длиной 1046 п.о., включающего ген L-аспарагиназы из E.coli Н42, и содержащего уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами BamHI и HindIII, имеющие следующие координаты: BamH1 - 148, HindIII - 1194.

2. Штамм бактерий Escherichia coli XL1-blue/pL-ASP-08 - продуцент рекомбинантной L-аспарагиназы, содержащий плазмидную ДНК pL-ASP-08 по п.1.