ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus licheniformis, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННЫХ КОРМОВ, ПОВЫШАЮЩИХ ПРОДУКТИВНОСТЬ И СНИЖАЮЩИХ РИСК ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦЫ И РЫБ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23K1/165 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.

Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis № 31 (Институт микробиологии и вирусологии им. академика Д.З.Заболотного НАН Украины), используемый в качестве одного из компонентов препарата биоспорин, предназначенного для лечения гнойно-септических заболеваний (SU 1722502, 30.03.1992).

Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038, используемый в качестве компонента кормовой добавки, обладающего широким спектром антивирусной и антибактериальной активности (RU 2142287, 10.12.1999).

Однако недостатком данного штамма можно считать особенности проявления его активности в составе комплексной бактериальной кормовой добавки, поскольку из-за наличия рекомбинантных свойств его применение в комбикормовом производстве требует получения специальных разрешений.

Известен штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2252Д, предназначенный для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыб (RU 2203947, 10.05.2003). Однако этот штамм не имеет достаточной активности, что ограничивает его применение в качестве компонента кормовой добавки.

Задачей изобретения является выделение нового штамма Bacillus licheniformis, обладающего антибактериальной активностью по отношению к широкому спектру Гр+ и Гр- микроорганизмов, продуцирующего антибиотические вещества широкого спектра действия, для использования его в качестве компонента пробиотической кормовой добавки.

Технический результат, достигаемый при реализации изобретения, заключается в повышении продуктивности и снижении риска желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыб.

Указанный технический результат достигается в штамме бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д, используемом для получения компонента пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis BL-03 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. К.С.Скрябина РАН, рег. номер ВКМ В-2414Д.

Штамм получен из природного изолята (почва). Подвергался селекции на подавление роста патогенных штаммов: стафилококка, синегнойной палочки, сальмонелл, трихофитов, протея, эпидермисов, кандидамикозов и др.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штамма Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д.

Грамположительная палочка, способная образовывать споры. Размеры вегетативных клеток 3-5 мкм. Споры одиночные, центральные или овальные, подвижные. Жгутикование - перитрих.

Вегетативные клетки Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д хорошо растут на богатых питательных средах - мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон (МПБ) и полужидкий агар (ПЖА) при температурах 50°С, рН 5,0-8,0. На МПА образует колонии белого цвета. Пигмент в среду не выделяет. Наблюдается рост до 8% NaCl.

Гидролизует глюкозу, мальтозу, сахарозу, оксидазо- и каталазоположителен.

Не сбраживаемые соединения углерода: лактоза, маннит, сахароза.

Утилизирует ацетат и цитрат при аэробном выращивании.

Штамм нетоксичен для животных, человека и растений.

Штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д продуцирует антибиотик широкого спектра действия, подавляющий стафилококки, грибки и синегнойную палочку.

Характеризуется показателями задержки роста тест-культуры, мм (метод перпендикулярных штрихов), представленными в Таблице.

Для культивирования штамма Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д используют жидкую питательную среду на основе 0,3% ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), рН 6,0, содержащую 0,2% глюкозу (по сухому веществу), 0,005% аминопептид или 0,02% сыворотку крови.

Сухую биомассу микроорганизмов предварительно высевают в пробирку с МПБ. При появлении видимого роста колонии пересевают на мясо пептонный агар в пробирки.

Отбирают типичные колонии и пересевают их на жидкую среду М во флаконах. Через сутки выросшую биомассу переносят в 15-литровую бутыль с 9-ю литрами питательной среды и культивируют 22 часа при 37-40°С, получая посевной материал.

Питательную среду на основе ФГМС помещают в биореактор, стерилизуют, охлаждают и засевают полученным материалом. Проводят аэробное культивирование при рН 6,8-7,2 с поддержкой 40% раствором глюкозы.

При достижении концентрации 20 млрд. бактериальных клеток прекращают подачу глюкозы и отключают подачу воздуха при достижении рН 4,6. Полученную культуральную жидкость с биомассой охлаждают до 20°С, перекачивают в емкости или расфасовывают во флаконы.

При указанном способе культивирования получают штамм для компонента кормовой добавки, названной «Проваген», с содержанием 85-90% спор бактерий Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д.

Кормовая добавка с компонентом на основе предлагаемого штамма безвредна и не содержит посторонней микрофлоры. Безвредность проверена на белых мышах массой тела 18-20 г и на годовиках карпах, которым перорально вводили 1,0 мл кормовой добавки.

Пробиотическая активность кормовой добавки «Проваген» в одной дозе (10-12) млрд. клеток/мл.

Предлагаемый штамм Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д может быть использован как производственный в качестве компонента кормовой добавки пробиотического действия, рекомендуемой для получения высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Бактериальная геморрагическая септицемия карпа.

В прудовом хозяйстве заболела рыба с клиническими признаками (краснухи) бактериальной геморрагической септицемии. Лабораторный анализ патматериала показал наличие патогенной микрофлоры во внутренних органах рыб. Количество больных рыб (двухлетки карпа) достигало 25% от общего количества. Назначено лечение с добавлением в корм путем его смачивания 3,0 млн. микробных клеток (спор) «Провагена» на 1 кг живой массы тела рыбы. Корм с «Провагеном» давали рыбе 1 раз в день в течение 7 дней. Через 14 дней после окончания курса лечения установлено, что количество больных рыб уменьшилось до 9%, а признаки острого воспаления остались лишь у отдельных экземпляров.

Пример 2. Сохранность цыплят.

Проведены производственные испытания «Провагена» на сохранность цыплят в первые две недели после их посадки. «Проваген» применялся перорально в жидком виде путем выпаивания с 5% раствором глюкозы и в лиофильно высушенном виде путем добавления в корм. Отход цыплят контрольной группы составил 3,8%. Усредненный отход в опытных группах при введении в корм сухого «Провагена» - 2,1%, при выпаивании жидкого «Провагена» - 0,5%. В опытных группах цыплята более интенсивно набирали вес: после первых трех дней для контрольной группы средний вес составил 57 г, для опытной - 71 г.

Пример 3. Сохранность поросят.

В хозяйстве наблюдался значительный отход поросят в связи с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Проведенные микробиологические и патологоанатомические исследования выявили несколько видов заболеваний ЖКТ поросят бактериальной этиологии. Назначен курс лечения: применение «Провагена» перорально сразу после рождения из расчета 1 доза на 3-х поросят на 8% глюкозе в течение 5 дней. Курс профилактики: применение «Провагена» внутрь из расчета 1 доза на 10 новорожденных поросят на 8% глюкозе в течение 3-х дней. Сохранность поросят поднялась на 65% и достигла стабилизации на уровне 95%, который поддерживается на этом уровне профилактикой.

Проведенные исследования показали эффективность кормовой добавки «Проваген» с компонентом на основе предложенного штамма Bacillus licheniformis BКM В-2414Д.

Спектр антагонистической активности штамма Bacillus licheniformis BКM В-2414Д.

Таблица Тест культуры Зоны задержки роста, мм Staphylococcus aureus 30-35 Pseudomonas aeragenose 15-16 Salmonella typhimarium 28-33 S.stenly 20-25 S.derby 20-24 Klebsiella pneumoniae 14-18 Proteus vulgaris 18-22 Candida albicans 31-35 C.tropicalis 28-31 Shigella sonnei 25-29

Штамм бактерий Bacillus licheniformis BКM В-2414Д выделен из почвы. Клетки грамположительны, способны образовывать споры, тип дыхания аэробный. Гидролизует глюкозу, мальтозу, сахарозу, оксидазо- и каталазоположительны. При аэробном выращивании утилизирует ацетат и цитрат. Подавляет рост стафилококков, сальмонелл, протея, кандидомикозов, синегнойной палочки и других патогенных микроорганизмов. Штамм используют как производственный для получения компонента пробиотической кормовой добавки, названной авторами «Проваген». Это обеспечивает повышение продуктивности и снижение риска желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыб. 1 табл.

Штамм бактерий Bacillus licheniformis BKM В-2414Д, используемый для получения компонента пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.