Способ выделения бактерий BacILLUS масеRаNS из почвы Советский патент 1992 года по МПК C12N1/02 

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии в частности к селекции микроорганизмов, может быть использовано при выделении новых штаммов Bacillus macerans.

Известен способ выделения В.macerans. предложенный F.Schardingem более подробно разработанный J.H.Northrop 1.2. Способ заключается в том. накопительную культуру получают путем инкубирования в течение 4-6 дней проб, взятых с поверхности клубней картофеля и помещенных в пробирки, содержащие ломтики стерильного картофеля. Выращивание накопительной культуры проводят при 37°С. Чистую культуру получают высевом пробы из накопительной культуры методом Коха на глюкозный агар и инкубацией в течение 2 сут при 37°С.

Данный способ не обеспечивает селективности выделения Вас.macerans. так как на картофельной среде хорошо развиваются Bac.subtilis, Bac.polimyxa. Bac.cereus, Bac.licheniformis. Bac.circulans и другие представители рода Bacillus, причем наиболее сильно доминируют виды Bac.subtilis и Bac.polymyxa, что очень сильно затрудняет выделение Вас.macerans на стадии чистой культуры.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения микроорганизмов вида Вас.macerans, включающий получение накопительной культуры путем 10-дневного инкубирования в анаэробных условиях, атмосфере N2. влажного образца почвы с периодическим (3 раза) добавлением к нему ШОз. Чистую культуру получают

о

со о

00

следующим образом. По окончании инкубации 1 г образца почвы суспендируют в стерильной воде и рассевают методом Коха на чашки Петри, содержащие глицериновый агар. Засеянные чашки Петри инкубируют при 28°С в течение 3-4 сут 3.

К недостаткам способа относится то. что он длителен по времени и трудоемок, особенно на стадии получения накопительной культуры. Трудоемкость заключается в необходимости дискретного добавления КМОз в образец почвы с последующим созданием анаэробных условий и поддержания определенной влажности образца почвы на протяжении 10 сут. Существенным недостатком является также то. что в накопительной культуре кроме Bac.macerans хорошо развиваются Bac.polymyxa и Bac.lichemiformis, что снижает селективность процесса выделения. Кроме того, способ неэффективен со многими образцами почв.

Целью изобретения является ускорение процесса выделения, а также повышение его селективности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения микроорганизмов вида Bac.macerans из почвы, включающему получение накопительной культуры из образца почвы в анаэробных условиях в атмосфере азота с последующим пересевом на агаровую среду, культивированием бактерий и отбором типичных колоний по культура л ьно-морфологичес ким признакам, получение накопительной культуры осуществляют путем посева суспензии, приготовленной из образца почвы на питательную среду, содержащую г/л:

Альфа-циклодекстрин3-10 Кукурузный экстракт 0.19-0,21 К2НРСм 0,19-0,21 (NH4bHPCU 0,19-0,21 Вода До 1 л из агаровых сред используют картофельно- глюкозный агар (КГА). при этом получение накопительной культуры и культивирование на агаровой среде осуществляют при 48- 49°С в течение 48-50 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензии образца почвы в селективную среду особого состава с содержанием компонентов, г/л: Альфа-циклодекстрин3-10 Кукурузный экстракт 0.19-0,21 К2НРСм 0,19-0,21 (NHofcHPCU 0,19-0,21 Вода До 1 л и выращиванием в атмосфере N2 при 48- 49°С в течение 48-50 ч. Чистую культуру

выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на КГА и инкубированием при 48 49°С в течение 48 50 ч. Полученные на КГА изолированные колонии микроорганизмов одного морфологического типа пересевают на мясо-пептонный агар (МПЛ) и идентифицируют известными методами Пример (прототип). К каждому из десяти образцов почвы,

0 произвольно отобранных в лесопарковой зоне г.Уфы (диаметр образца 11 см, высота 7 см), добавляют по 2,1 г КМОз и помещают в анаэростат. Инкубирование проводят при 28°С, в атмосфере N2, при постоянной влаж5 ности образца, равной 55%. Через 3 и 6 сут к каждому образцу почвы добавляют повторно 2.1 г KNOa. Время инкубации 10 сут. Чистую культуру выделяют следующим образом: 1 г из каждого образца почвы по оконча0 нии .инкубации суспендируют в 100 мл стерильной воды и полученную суспензию высевают методом Коха на чашки Петри с глицериновым агаром, состава, г/л: Глицерин1.0

5Пептон 1,0 Дрожжевой экстракт 0,1 КМОз 3,0 Агар 10,0 Вода До 1 л

0Инкубируют засеянные чашки Петри при 28°С в течение 4 сут. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии различных морфологических типов (изоляты). Их пересевают на

5 косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4. Результаты идентификации и количество колоний, высеянных с каждого образца почвы, приведены в табл. 1.

Пример 2. 1г почвы из образцов.

0 отобранных при тех же условиях, что и в примере 1, суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильной среды, состава, г/л:

5 Альфа-циклодекстрин5,0 Кукурузный экстракт 0,2 К2НРСМ 0.2 (МН4)2НР04 0,2 Вода До 1 л

0Пробирки помещают в анаэростат и инкубируют при 48°С в течение 48 ч в атмосфере N2. По окончании выращивания пробы из каждой пробирки рассевают методом Коха на чашки Петри со стерильным КГА. За- 5 сеянные чашки Петри инкубируют при 48°С в течение 48 ч. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4. Результаты

идентификации и количество изолятов. высеянных с каждою образца почвы, приведены в табл. 2.

П р и м е р 3. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0.5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильных сред, состав которых приведен в табл. 4. Инокулированные пробирки помещают в анаэростат и выращивают первую повторность при 48°С. вторую - при 49°С в течение 48 ч в атмосфере N2. По окончании выращивания пробы из каждой пробирки пересевают методом Коха на чашки Петри с КГА. Засеянные чашки инкубируют при 48°С в течение 48 ч, По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3.4. Результаты идентификации и количество изолятов. выросших из пробирок со средами 1-17. при 48 и 49°С. представлены в табл. 3.

Пример 4. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильной среды 2 (см. табл. 4). Инокулированные пробирки помещают в анаэростат и выращивают при 48°С в атмосфере N2. Время инкубирования одной пробирки составляет 24 ч, второй - 36 ч. третьей - 45 ч. четвертой - 48 ч. пятой - 50 ч, шестой 72 ч. По окончании инкубации пробы из каждой пробирки пересевают методом Коха на чашки Петри с КГА. Засеянные чашки инкубируют 48 ч при 48°С. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4. Результаты идентификации и количество изолятов. выросших на КГА. представлены в табл. 5,

Пример 5. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вводят в пробирки с 5 мл стерильной среды 2 (см табл. 4). Инокулированные пробирки выращивают в атмосфере No Одну пробирку при 50°С вторую при 49°С. третью при 48°С. четвертую при 45°С, пятую при 40°С. Время инкубации составляет 48 ч. По окончании инкубации пробы из каждой пробирки высевают методом Коха на чашки Петри с КГА Засеянные чашки Петри инкубир,ют при 48°С в течение 48 ч. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолировэнные колонии, которые пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3.4. Результаты идентификации и количество изолятов, полученных на КГА. представлены в табл. 6.

Использование для выращивания накопительной культуры жидкой среды с а/.ьфа- циклодекстрином позволяет ускорить процесс выделения микроорганизмов вида B.macerans. Процесс выделения поданному

способу осуществляется в течение 4 дней, в прототипе за 14 дней. Кроме этого, использование альфа-циклодекстрина в качестве единственного источника углерода и высокой температуры выращивания (48-49°С)

обеспечивает практически 100% селективность процесса выделения Bac.macerans из-за того, что представители этого вида наиболее хорошо приспособлены к потреблению этого углевода в анаэробных

условиях, при высокой температуре (48- 49°С). нежели другие виды микроорганизмов.

Формула изобретения

Способ выделения бактерий Bacillus macerans из почвы, включающий получение накопительной культуры из образца почвы в анаэробных условиях в атмосфере азота с последующим пересевом на агаровую среду. и культивированием бактерий и отбором типичных колоний по культурально-морфо- логическим признакам, отличающий- с я тем. что. с целью ускорения процесса выделения и повышения его селективности.

получение накопительной культуры осуществляют путем посева суспензии, приготовленной из образца почвы, на питательную среду, содержащую, г/л:

Альфа-циклодекстрин3-10

Кукурузный экстракт 0.19-0.21 КаНРСМ 0,19-0.21 (МН4)НР04 0,19-0.21 Вода До 1 л. из агаровых сред используют картофельноглюкозный агар, при этом получение накопительной культуры и культивирование на агаровой среде осуществляют при 48-49°С в течение 48-50 ч.

Таблица 1

Продолжение табл.3

Изобретение относится к микробиологии, в частности к селекции микроорганизмов, и может быть использовано при выделении новых штаммов Bacillus macerans. Целью изобретения является ускорение процесса выделения, а также повышение его селективности. Способ осуществляют следующим образом. Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензии образца почвы в селективную среду, содержащую, г/л: альфа-декстрин 3- 10; кукурузный экстракт 0.19-0.21; К2НР04 0.19-0.21; (МН4)2НР04 0,19-0.21; вода до 1 л. и инкубированием ее в атмосфере N2 при 48-49°С в течение 48-50 ч. Чистую культуру выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на картофельно-глюкоз- ном агаре (КГА) и инкубировзнием npt- 48-49°С в течение 48-50 ч. Полученные на КГА изолированные однотипные по морфологии колонии микроорганизмов пересевают намясо-пептонныйагар(МПА)и идентифицируют. Способ способствует 100% выделению бактерий Bacillus macerans. 6 табл. (/) С

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6