ШТАММ BACILLUS SPECIES, СПОСОБНЫЙ К РОСТУ В СРЕДЕ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ БУТАНОЛА Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, в частности к способам микробиологического производства н-бутилового спирта (н-бутанола, бутанола), используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленно-ценных органических соединений.

Известны как химические ((Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6.sup.th edition, 2003), так и микробиологические (Trends in Biotechnology 16:11-16, 1998) способы производства бутанола.

Наиболее известным продуцентом бутанола являются бактерии вида Clostridium acetobutylicum, в результате брожения которых образуется смесь ацетон-бутанол-этанол (ABE-процесс) (Trends in Biotechnology 16: 11-16, 1998). Известны также рекомбинантные продуценты бутанола (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2000) 24, 153-160).

Существенно, что в процессе ацетоново-бутилового брожения образуется только первичный бутиловый спирт (СН₃-СН₂-СН₂-СНОН), тогда как химическая промышленность производит н-бутанол, содержащий примеси вторичного бутилового спирта (СН₃-СНОН-СН₂-СН₃), что ограничивает его применение в ряде отраслей промышленности (лакокрасочной, фармацевтической и др.).

Однако использование микробиологического синтеза для производства бутанола осложнено тем, что даже небольшие концентрации бутанола (2%) токсичны для большинства обычно используемых микроорганизмов (Adv. Microbial. Physiol. 25:253-300 (1984)).

Поэтому важной задачей является выделение или создание штаммов микроогранизмов, устойчивых к более высоким концентрациям бутанола, которые потенциально могут быть использованы для биопродукции высоких концентраций бутанола.

Известен (Biotechnol. Lett. 19:487-490 (1997)) штамм, относящийся к роду Lactobacillus, обладающий повышенной устойчивостью к спиртам, однако его использование ограничено тем, что он способен к росту только на богатых средах.

В работе (US 2008/0138870 А1) описаны штаммы Pediococcus pentosaceus и Pediococcus acidilactici, способные к росту в средах, содержащих повышенные концентрации бутанола, однако рост данных микроорганизмов выявляется при концентрациях бутанола не более чем 3,0%.

Информации о бутанолустойчивых штаммах, относящихся к роду Bacillus, нами не обнаружено.

Задача изобретения - расширить арсенал штаммов микроорганизмов, способных к росту при повышенных концентрациях бутанола.

Задача решена путем получения штамма Bacillus species, способного к росту на средах, содержащих до 4 об.% (объемных процентов) бутанола, а также к сохранению жизнеспособности при культивировании в средах, содержащих до 9 об.% бутанола или до 40 об.% этанола.

Заявляемый штамм выделен из почвы Московской области и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-10383.

Культурально-морфологические признаки заявляемого штамма

При росте на агаризованной LB среде (мас.%: дрожжевой экстракт 0,5, триптон 1, NaCl 1, агар 2, вода остальное) в течение 20 часов при 30°С образует шероховатые колонии диаметром 3-5 мм белого или светло-кремового цвета с неровными краями.

После культивирования в течение 20 часов при 30°С в жидкой среде LB (мас.%: дрожжевой экстракт 0,5, триптон 1, NaCl 1, вода остальное) образует палочковидные клетки размером 3-4 мкм с элипсовидной проспорой, имеющей центральное расположение. Клетки как одиночные, так и собранные в цепочки по 2-10 клеток. Зрелые споры образуются после культивирования в течение более 72 часов.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных и микроаэробных условиях.

В качестве единственного источника углерода способен использовать глюкозу, мальтозу, арабинозу, а также этанол, бутанол, глицерин, не способен ассимилировать ксилозу.

При культивировании в среде Г1 (мас.%: KH₂PO₄ 0,15, Na₂HPO₄×12H₂O 0,9, NH₄Cl 0,05, MgSO₄ 0,012, глюкоза 1, вода остальное) в течение 72 часов при температуре 30°С штамм способен синтезировать полигидроксибутираты.

В качестве молекулярно-биологической характеристики штамма Bacillus species ВКПМ В-10383 могут быть использованы также результаты ПЦР-фингерпринтинта (Applied and Environmental Microbiology, Oct, 1999, 4351-4356), представленные на фиг.1.

Фингерпринт проводили методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 1) и 1254 (линия 3).

Праймер М13 GAGGGTGGCGGTTCT

Праймер 1254 CCGCAGCCAA

Режим реакции ПЦР:

95°С - 3 мин - 1 цикл

35 циклов:

95°С - 30 сек.

54°С - 30 сек.

72°С - 60 сек.

72°С - 5 мин - 1 цикл.

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) (линия 2, размер фрагментов снизу вверх - 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).

Штамм Bacillus species ВКПМ В-10383 способен к росту в средах, содержащих до 4 об.% бутанола. Вегетативные клетки штамма способны сохранять жизнеспособность после суточного культивирования в средах, содержащих либо до 9 об.% бутанола, либо до 40 об.% этанола.

Изобретение проиллюстрировано следующими чертежами.

Фиг.1. Фингерпринт штамма Bacillus species ВКПМ В-10383.

Фиг.2. Изменение оптической плотности культуральной жидкости при культивировании штамма Bacillus species ВКПМ В-10383 в зависимости от концентрации бутанола в среде.

Пример 1.

Для получения посевного материала штамм Bacillus species ВКПМ В-10383 выращивают в жидкой среде LB при 30°С в условиях аэрации на качалке в течение 18 часов. Затем посевной материал из расчета 30% от рабочего объема переносят в пробирки со средой LB (объем 40 мл, рабочий объем 10 мл), содержащие бутанол в концентрации 0, 2, 3, 4 и 4,5 об.%.

Пробирки герметично укупоривают и измеряют начальную оптическая плотность культуры на спектрофотометре Thermo Spectronic Genesys 10UV при длине волны 600 нм. Культивирование проводят при перемешивании на качалке при 30°С в течение 48 часов. Через каждые 12 часа отбирают пробы и измеряют оптическую плотность бактериальной культуры.

На фиг.2 приведено изменение оптической плотности бактериальной культуры в процессе культивирования штамма Bacillus species ВКПМ В-10383 для концентраций бутанола в среде, составляющих 0; 2; 3; 4 и 4,5 об.%.

Из результатов видно, что заявляемый штамм способен к росту в среде, содержащей бутанол вплоть до 4 об.%.

Пример 2.

Посевной материал заявляемого штамма получают, как в примере 1. Затем в две пробирки помещают по 1 мл посевного материала и в одну из них добавляют бутанол (0,10 мл) до конечной концентрации 9 об.% (максимально возможная концентрация бутанола в воде), а в другую - этанол (0,67 мл) до конечной концентрации 40 об.% (максимальная концентрация этанола, при которой клетки выживают).

Клетки, находящиеся в стадии вегетативного развития (отсутствие спор контролировали методом микроскопирования), инкубируют в закрытых пробирках без перемешивания в течение 24 часов при 30°С.

После инкубации бактериальную культуру высеивают на агаризованную LB среду и культивируют при 30°С в термостате. Через 24 часа на поверхности агаризованной среды в обоих случаях наблюдают рост колоний штамма ВКПМ В-10383.

Таким образом, клетки штамма Bacillus species ВКПМ В-10383 сохраняют жизнеспособность после инкубировния в средах, содержащих до 9 об.% бутанола или до 40 об.% этанола.

Таким образом, полученный штамм Bacillus species ВКПМ В-10383 способен к росту на средах, содержащих до 4% бутанола, а также сохранению жизнеспособности при культивировании в средах, содержащих до 9% бутанола или до 40% этанола, т.е. обладает повышенной устойчивостью к спиртам и в перспективе может быть использован для создания продуцентов бутанола и других спиртов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам микробиологического производства н-бутилового спирта, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленно-ценных органических соединений, и может быть использовано для создания продуцентов бутанола и других спиртов. Штамм Bacillus species ВКПМ В-10383 способен к росту на средах, содержащих до 4% бутанола, а также к сохранению жизнеспособности при культивировании в средах, содержащих до 9% бутанола или до 40% этанола. Изобретение позволяет получить штамм, обладающий повышенной устойчивостью к спиртам. 2 ил.

Штамм Bacillus species ВКПМ В-10383, способный к росту в среде с повышенным содержанием бутанола.