КОМПОЗИЦИИ ТРАНСПЛАНТАТА ДЛЯ ПЕРЕСАДКИ КЛЕТОК Российский патент 2024 года по МПК A61K47/00 A61L27/52 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка в соответствии с § 119 (е) раздела 35 Кодекса США претендует на приоритет заявки США № 62/518380, поданной 12 июня 2017 года и заявки США № 62/664694, поданной 30 апреля 2018 года, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном их объеме.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к области трансплантации клеток или пересадки тканей. Более конкретно, из солидных органов или тканей в солидные органы или ткани, особенно во внутренние органы. Настоящее изобретение относится к композициям и способам, предусматривающим стратегии для быстрой трансплантации, пересадки и интеграции клеток в солидные органы и ткани для лечения заболеваний или состояний солидных органов или тканей или для создания модельных систем заболевания. Иллюстративными примерами этого возможного применения являются клеточные терапии для лечения заболеваний печени или заболеваний поджелудочной железы.

Предшествующий уровень техники

Длительное время имелась потребность в стратегиях осуществления пересадки клеток из солидных органов, стратегиях, отличных от стратегий, используемых для трансплантации гематопоэтических клеток или мезенхимальных клеток/клеток-предшественников. Turner, R., et al. Transplantation 90, 807-810 (2010); Gattinoni, L. et al. Nature Medicine 23, 18-27 (2017); Trounson A. et al. Cell Stem Cell 17, 11-22 (2015); Sun B.K. et al. Science 346, 941-945 (2014); Lainas, P. et al. J Hepatol 49, 354-362 (2008). Трансплантация гематопоэтических клеток и мезенхимальных клеток выполняется стандартным образом путем доставки клеток через канал сосуда и зависит от активации молекул адгезии в трансплантированных клетках при попадании в соответствующие целевые участки вследствие передачи сигналов в микроокружении - процессе, который называется «хоуминг». В способах, применяемых для кожи (аналогично способам для мишеней в глазах), используются методы трансплантации, при которых клетки наносятся непосредственно на целевые участки. Sun B.K. et al. Science 346, 941-945 (2014). Многие способы пересадки кожи применимы для клеток из солидных внутренних органов, но требуют значительных модификаций для адаптации к микроокружению этих внутренних органов. Трансплантаты должны выдерживать механические силы, оказываемые в результате взаимодействий тканей и органов друг с другом; примеры включают воздействие легких во время дыхания, или давление на печень со стороны диафрагмы, или временные эффекты механических воздействий, оказываемых кишечным трактом на соседние ткани во время обработки пищи. Трансплантаты, особенно трансплантаты для внутренних органов, являются сложными для разработки вследствие проблем, связанных с размером, формой и сложностью структуры органов в дополнение к очевидным динамическим механическим силам.

В течение десятилетий предпринимались попытки применить в рамках клеточной терапии клетки из солидных органов, отличных от кожи с использованием трансплантации через сосуды или путем прямой инъекции в ткань. Большинство трансплантированных клеток при доставке с помощью любой из этих стратегий либо погибают, либо транспортируются в эктопические участки, где они могут существовать в течение нескольких месяцев и приводить к образованию тканей в неподходящих участках, потенциально приводя к побочным эффектам в клинике Turner, R., et al. Transplantation 90, 807-810 (2010); Lanzoni, G. et al. Stem Cells 31, 2047-2060 (2013). Пересадка в печень может быть усовершенствована с помощью покрытия клеток гиалуронанами и доставки их в печень по сосудам; повышенная эффективность пересадки связана с естественным процессом выведения гиалуронанов печенью. Nevi et al. Stem Cell Research & Therapy 8, 68, 2017. В то же время это усовершенствование по-прежнему является менее эффективным, чем использование стратегий трансплантации, и, что важно, по-прежнему способствует доставке клеток в эктопические участки.

Остается потребность в улучшенных способах пересадки клеток в солидные органы. Настоящее изобретение удовлетворяет данную потребность и обеспечивает соответствующие преимущества.

Краткое описание изобретения

Долгое время существовала потребность в стратегиях пересадки клеток из солидных органов (Turner, R., et al. Transplantation 90, 807-810 (2010), стратегиях, отличных от стратегий, используемых для трансплантации гематопоэтических клеток, мезенхимальных клеток или кожи. Трансплантация гематопоэтических клеток и мезенхимальных клеток осуществляется стандартным образом через канал сосуда и зависит от активации молекул адгезии в соответствующих целевых участках вследствие передачи сигналов в микроокружении, - процессе, который называется «хоуминг». В способах, применяемых для кожи, используются способы пересадки клеток непосредственно в целевые участки.

При трансплантации клеток из солидных органов, отличных от кожи, длительное время применяли доставку через сосуды. Это лишено смысла, поскольку адгезивные молекулы на этих клетках всегда активируются и приводят к быстрой (в течение нескольких секунд) агрегации клеток, которая может приводить к образованию опасных для жизни эмбол. Даже если для минимизации риска для здоровья принимаются успешные меры в отношении эмбол, эффективность пересадки клеток является низкой, составляя лишь ~20% для зрелых клеток и даже меньше (< 5%) для стволовых клеток/клеток-предшественников. Большинство трансплантированных клеток либо погибают, либо транспортируются в эктопические участки, где они могут существовать в течение нескольких месяцев, образуя ткани в неподходящих местах, приводя к возможным побочным эффектам в клинике. Небольшой процент клеток, которые пересаживают в целевые места, интегрируются медленно, при этом требуется от нескольких недель до нескольких месяцев для того, чтобы они стали значительной частью ткани. Можно добиться улучшения при пересадке в печени, если клетки покрыть гиалуронанами и доставить через сосуды, поскольку выведения гиалуронанов из ткани (например, печени) (Nevi et al. Stem Cell Research & Therapy 8, 68, 2017).

Авторы данной заявки предлагают радикально иной подход, который, как обнаружено, является даже более успешным, чем покрытие клеток гиалуронанами: помещение трансплантатов непосредственно на поверхность целевого участка и применение трансплантируемых биоматериалов и уникальных фенотипических признаков определенных клеток, когда они находятся в условиях биоматериалов для трансплантации с целью улучшения трансплантации. Это соответствует некоторым аспектам стратегий видов клеточной терапии для кожи, однако требует значительных модификаций при применении для внутренних органов с учетом механических эффектов, трения или давления органов, расположенных близко друг к другу, и с учетом уникальных жидкостных микроокружений вокруг определенных органов, а также размера, структуры и сложности органов.

В данном документе описаны новые композиции трансплантата-заплаты и способы трансплантации клеток в ткань и солидные органы. В некоторых воплощениях способы и трансплантаты адаптированы для внутренних органов, причем конструктивные особенности зависят от уровня зрелости клеток, особенно от того, являются ли клетки стволовыми клетками или зрелыми клетками. В некоторых воплощениях в данном документе раскрыты донорские клетки (необязательно аутологичные или аллогенные) для трансплантатов в виде заплаты, включенные в биоматериалы для трансплантации необязательно в виде смеси клеток или в форме органоидов, агрегатов эпителиальных стволовых клеток и их нативных партнеров, находящихся на стадии дифференцировки соответствующих мезенхимальных клеток, например, мезенхимальных стволовых клеток/клеток-предшественников, таких как мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). В некоторых воплощениях донорские клетки представляют собой зрелые клетки, включенные в материалы для трансплантации в виде клеточных суспензий из зрелых клеток эпителия с мезенхимальными стволовыми клетками/клетками-предшественниками, необязательно ELSMC, в соотношениях, предназначенных для оптимизации экспрессии ими мембраноассоциированных и/или секретируемых матриксных металлопротеиназ (MMP). В некоторых воплощениях другими значимыми переменными являются трансплантируемые биоматериалы и материал подложки, при этом необходимо, чтобы оба они были нейтральными в отношении эффектов, оказываемых на дифференцировку донорских клеток.

Аспекты настоящего изобретения относятся к трансплантату в виде заплаты для поддержания и сохранения популяции из одиночных клеток или смешанной популяции клеток, содержащему: (a) один тип клеток или смешанную популяцию, характеризующуюся двумя или более типами клеток, по меньшей мере один из которых находится на ранней стадии дифференцировки, при которой он способен экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), или который содержит MMP из другого источника (например, очищенные или рекомбинантные MMP), при этом указанная клеточная популяция или смешанная популяция, поддерживаемая в среде, присутствующей в гидрогелевом матриксе, характеризуется вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной клеточной популяции, необязательно в пределах или за пределы указанного гидрогеля и/или в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты; (b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной клеточной популяции в указанную подложку; и необязательно (c) гидрогель, накладываемый на серозную (т.е. наружную) поверхность указанной подложки, которая находится на стороне подложки, противоположной стороне для контакта с указанной смешанной популяцией, и в воплощениях вариантах осуществления, в которых трансплантат в виде заплаты связан с целевым участком, находится на стороне, противоположной стороне для контакта с целевым участком (например, органом или тканью). В некоторых воплощениях указанный слой предупреждает или подавляет проявления адгезии к другим тканям или органам или адгезии со стороны от других органов и тканей. В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты выполнен с возможностью поддержания и сохранения указанной смешанной популяции, при этом обеспечивается подавление дифференцировки или дальнейшего созревания указанного по меньшей мере одного типа клеток, находящегося на ранней стадии дифференцировки, до более поздней стадии дифференцировки, при которой он более не способен экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые MMP. Трансплантат в виде заплаты может представлять собой один слой плюс подложку или несколько слоев.

В некоторых воплощениях указанная подложка является пористой или непористой. В некоторых воплощениях подложка содержит пористую сетку, каркас или мембрану. В некоторых воплощениях подложка содержит шелк; синтетическую ткань или природный материал, такой как амнион, плацента или сальник; или их комбинацию. В некоторых воплощениях указанная подложка содержит пористую сетку, заполненную гидрогелем. В воплощениях дополнительных воплощениях такая инфузия приводит к предупреждению миграции клеток за пределы целевого органа или ткани. В некоторых воплощениях указанная подложка содержит твердый материал.

В некоторых воплощениях один или более из указанных гидрогелей содержат гиалуронаны.

В некоторых воплощениях указанная среда представляет собой среду Кубота или другую среду, поддерживающую стволовые клетки и способную поддерживать стволовость.

В некоторых воплощениях указанная смешанная популяция содержит мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки. В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки могут быть эктодермальными, эндодермальными или мезодермальными. В некоторых воплощениях указанные мезенхимальные клетки предусматривают мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). В некоторых воплощениях указанные ELSMC представляют собой одно или более из ангиобластов, предшественников клеток эндотелия, предшественников звездчатых клеток и мезенхимальных стволовых клеток (MSC). В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки предусматривают эпителиальные стволовые клетки. В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки предусматривают стволовые клетки желчных протоков (BTSC). В некоторых воплощениях указанные стволовые клетки предусматривают коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки. В некоторых воплощениях указанные коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки предусматривают зрелые паренхимные клетки. В некоторых воплощениях указанные зрелые паренхимные клетки предусматривают одно или более из гепатоцитов, холангиоцитов и островковых клеток. В некоторых воплощениях указанные как мезенхимальные клетки, так и эпителиальные клетки содержат стволовые клетки.

В некоторых воплощениях указанная смешанная популяция содержит аутологичные и/или аллогенные клетки.

В некоторых воплощениях один или более типов клеток являются генетически модифицированными.

Дополнительные аспекты связаны со способами, в которых применяют раскрытые композиции трансплантатов в виде заплаты. Соответственно, в данном документе предусмотрены способы пересадки клеток в целевую ткань, предусматривающие, включающие или по сути включающие приведение в контакт целевой ткани с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше.

В некоторых воплощениях способов целевая ткань выбрана из группы, состоящей из ткани печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, желудочно-кишечного тракта, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, спинного мозга, кожи и подлежащих дермальных тканей, ткани матки, почки, мышцы, кровеносного сосуда, сердца, хряща, сухожилий и кости. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань печени. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань поджелудочной железы. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань желчных протоков. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань желудочно-кишечного тракта. В некоторых воплощениях ткань является патологической, поврежденной или имеет нарушение. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань почки.

В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой орган. В некоторых воплощениях способов орган представляет собой орган скелетно-мышечной системы, пищеварительной системы, дыхательной системы, мочевыделительной системы, женской репродуктивной системы, мужской репродуктивной системы, эндокринной системы, кровеносной системы, лимфатической системы, нервной системы или покровной системы. В некоторых воплощениях способов орган выбран из группы, состоящей из печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, желудка, кишечника, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, спинного мозга, кожи и подлежащих дермальных тканей, матки, почки, мышцы, кровеносного сосуда, сердца, хряща, сухожилия и кости. В некоторых воплощениях орган является патологическим, поврежденным или имеет нарушение.

Также в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением печени, при этом способы предусматривают, включают или по сути включают приведение в контакт печени субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях способов заболевание или нарушение печени представляет собой фиброз печени, цирроз печени, гематохроматоз, рак печени, атрезию желчных протоков, неалкогольную жировую болезнь печени, гепатит, вирусный гепатит, аутоиммунный гепатит, фасциолез, алкогольную болезнь печени, недостаточность альфа-1-антитрипсина, болезнь накопления гликогена II типа, наследственный амилоидоз, связанный с транстиретином, синдром Жильбера, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, синдром Бадда-Киари, повреждение печени или болезнь Вильсона.

В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением поджелудочной железы, при этом способы предусматривают, включают или по сути включают приведение в контакт поджелудочной железы субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях способов заболевание или нарушение поджелудочной железы представляет собой сахарный диабет, экзокринную недостаточность поджелудочной железы, панкреатит, рак поджелудочной железы, дисфункцию сфинктера Одди, кистозный фиброз, разделенную поджелудочную железу, кольцевидную поджелудочную железу, повреждение поджелудочной железы или кровотечение из протока поджелудочной железы (hemosuccus pancreaticus).

В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением желудочно-кишечного тракта, при этом способ предусматривает, включает или по сути включает приведение в контакт одной или более из частей кишечника субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях заболевание или нарушение желудочно-кишечного тракта представляет собой гастроэнтерит, рак желудочно-кишечного тракта, илеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, пептическую язвенную болезнь, целиакию, фиброз, ангиодисплазию, болезнь Гиршпрунга, псевдомембранозный колит или повреждение желудочно-кишечного тракта.

В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением почки, при этом способы предусматривают, включают или по сути включают приведение в контакт одной или более из почек субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях способов заболевание или нарушение почки представляет собой нефрит, нефроз, нефритический синдром, нефротический синдром, хроническое заболевание почки, острую почечную недостаточность, повреждение почки, кистозную болезнь почки, поликистозное заболевание почки, гломерулонефрит, IgA-нефропатию, волчаночный нефрит, рак почки, синдром Альпорта, амилоидоз, синдром Гудпасчера или гранулематоз Вегенера.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1A-1D представлена информация о донорных клетках свиньи для трансплантатов в виде заплаты. На фиг. 1A представлена схема процесса и оценки времени, требуемого для получения органоидов, сборки трансплантатов в виде заплаты и осуществления хирургических вмешательств. На фиг. 1B донорские клетки для трансплантатов стволовых клеток в виде заплаты выделяли из клеточных суспензий ткани желчных протоков от трансгенных свиней; клетки получали в виде органоидов в бессывороточной среде Кубота и в чашках для культивирования со слабым прикреплением. Органоиды из стволовых клеток желчных протоков (BTSC) и их партнеров на ранней стадии дифференцировки мезенхимальных клеток- (ELSMC), ангиобласты и предшественники клеток эндотелия и звездчатых клеток. Они показаны на микрофотографии, полученной с помощью фазово-контрастного микроскопа, для сравнения с микрофотографией, на которой продемонстрирована экспрессия трансгена, зеленого флуоресцентного белка (GFP). Все клетки агрегата представлены в зеленом цвете, поскольку трансген находится как в эпителиальных клетках, так и в мезенхимальных клетках. Трансген был связан с локусом гистона (H-2B). Гистологический анализ органоидов стволовых клеток, которые были залиты в парафин, разделены на срезы и окрашены гематоксилином/эозином. (d) Увеличенное изображение органоида BTSC и ELSMC. На фиг. 1C показан иммуногистохимический анализ (IHC), на котором продемонстрирована экспрессия маркеров стволовых клеток, печеночных и поджелудочных, что указывает на то, что эти клетки представляют собой предшественники как печени, так и поджелудочной железы. Анализы IHC показывают наружные слои с маркерами стволовых клеток на промежуточной стадии дифференцировки, такими как EpCAM, и внутренние клетки, экспрессирующие наиболее примитивные гены, такие как гены плюрипотентности и эндодермальные факторы транскрипции (например, SOX17, SOX9, PDX1). На фиг. 1D представлен иллюстративный анализ qRT-PCR, в котором оценивают экспрессию различных генов в органоидах и показывают, что клетки представляют собой стволовые клетки или ранние предшественники. В качестве контролей использовали зрелые гепатоциты из печени подсвинков.

На фиг. 2A-2F представлена информация об основных компонентах трансплантатов в виде заплаты. На фиг. 2A представлена схема трансплантата в виде заплаты, прикрепленного к печени свиньи, а справа композиция трансплантатов. Клетки на ранней стадии дифференцировки, как клетки эпителия, так и мезенхимальные клетки, представляют собой источники матриксных металлопротеиназ (MMP), - ключевых регуляторов пересадки. Компоненты матрикса биоматериалов для трансплантации, в которые помещают донорские клетки, являются мягкими (~100 Па), без сульфатирования (или с минимальным), например, представляют собой гиалуронановые гидрогели. Структура трансплантата состоит из слоев биоматериалов и клеток, связанных с целевым участком. Компоненты среды не содержат сыворотки, факторов роста и цитокинов, влияющих на дифференцировку донорских клеток, и представляют собой компоненты, предназначенные специально для выживания и экспансии клеток на ранней стадии дифференцировки, таких как стволовые клетки/клетки-предшественники. Подложка характеризуется достаточной прочностью на растяжение для применения в хирургических процедурах, однако является нейтральной в своих эффектах в отношении дифференцировки донорских клеток (например, необходимо избегать применения клеток с коллагеном I типа). Подложку пропитывают или покрывают более прочным 10-кратным гидрогелем (~700 Па) с тем, чтобы она выступала в качестве барьера ориентации миграции донорских клеток в направлении целевой ткани и минимизации адгезии. После прикрепления к целевому участку гидрогель 2X HA, достаточно жидкий, чтобы его можно было нанести или нанести на серозную поверхность, добавляют и применяют для дополнительной минимизации проявлений адгезии. На фиг. 2B представлен трансплантат, прикрепленный к печени или поджелудочной железе хозяина. На фиг. 2C представлена схема трансплантата, демонстрирующая слои, составляющие композицию трансплантата. На фиг. 2D представлены результаты анализов, в которых эмпирически определяют реологические или вязкоупругие свойства (сдвиговые воздействия и сжимающие механические силы) конкретных слоев гидрогеля. На фиг. 2E представлен состав и вязкоупругие свойства 3 слоев гидрогелей. На фиг. 2F представлено увеличенное изображение трансплантата в виде заплаты, сшитого с поверхностью печени свиньи.

На фиг. 3A-3D представлен результат иммуногистохимического анализа (IHC) и гистологического анализа трансплантатов печени в виде заплаты. На фиг. 3A показаны результаты трихромного окрашивания трансплантата в виде заплаты через одну неделю. С помощью трихрома определяют коллагены (синий), цитоплазму (красный) и ядра (черный), а также применяют его для определения капсулы Глиссона (обычно прилегающей к поверхности долек печени) и проявления адгезии (на серозной поверхности трансплантатов). Имеет место высокий уровень окрашивания синим в слоях на серозной поверхности и соответствующих проявлениях адгезии к трансплантату. Кроме того, трансплантат отделялся от ткани хозяина на поверхности раздела между подложкой и хозяином; это часто встречалось вследствие большого количества MMP, продуцируемых на поверхности раздела. Участки ремоделирования представляют собой доказательство потери классической структуры долек печени; они приводят к образованию области, в которой донорские клетки мигрируют в ткань и одновременно приводят к изменению структуры ткани хозяина. На изображениях с небольшим увеличением (a) трихромное окрашивание трансплантатов, помещенных на печень, подтвердило, что происходило значительное ремоделирование капсулы Глиссона и это часто приводило к разделению трансплантата и печени хозяина. На изображениях с более высоким увеличением (b) участок ремоделирования является заметно более широким и состоит из участков (c) возле трансплантата, где структура долек печени в целом утрачена, и (d) областей в оставшихся дольках печени, которые подвергаются разрушению в процессе ремоделирования. На фиг. 3В показаны результаты трихромного окрашивания трансплантата в виде заплаты через три недели. Гиалуронаны в трансплантате были резорбированы, при этом оставалась лишь подложка (a). При резорбции HA капсула Глиссона образуется повторно (b), и дольки печени возле трансплантата снова стабилизируются в свои типичные гистологические паттерны, такие как дольки и ацинусы в случае печени. Стрелка на (b) означает повторное образование коллагенов при перестройке капсулы Глиссона. На фиг. 3C и фиг. 3D показаны результаты окрашивания гематоксилином/эозином среза из трансплантатов через одну неделю после осуществления пересадки (C) и через две недели после осуществления пересадки (D). Фигуры вверху представлены при 40-кратном увеличении. В участках в пределах фигуры (a, b, c) представлены виды в увеличенном масштабе, которые увеличены в сто раз; прямоугольное изображение ниже каждой из них увеличено в двести раз. Показаны 3 участка трансплантата: (a) участок в пределах подложки и ассоциированные биоматериалы для трансплантации; (b) участок на поверхности раздела между трансплантатом и тканью хозяина; и (c) участок в пределах долек печени. Окрашивание гематоксилином/эозином приводит к получению изображений, которые способствуют оценке процесса приживления и миграции, который включает признаки воспалительных процессов.

На фиг. 4A-4C показаны пересадка, миграция и быстрое созревание в направлениях дифференцировки зрелых клеток в течение недели. На фиг. 4A представлено изображение при небольшом увеличении трансплантата в виде заплаты на поверхности печени свиньи через одну неделю. Пунктирная линия обозначает поверхность раздела трансплантата и печени хозяина. Донорские GFP+ клетки (с розовыми ядрами; белые стрелки обозначают области с большими количествами донорских GFP+ стволовых клеток) визуализировали с помощью мечения антителом к GFP и во вторую очередь антителом, связанным с Novo Red, красным флуорозондом. Ядра окрашивали синим цветом с помощью 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), дающего возможность распознавать клетки-хозяева, имеющие только синие ядра, и донорские клетки, имеющие розовые ядра (слияние DAPI и Novo Red). Ткань хозяина (a) переходит в гиалуронаны (HA, фон черного цвета) трансплантата; ткань подложки содержит единичные органоиды (вставка), но большинство донорных клеток рассеяны на отдельные клетки; большое количество диспергированных донорных GFP+ стволовых клеток (b) наблюдаются во всей ткани хозяина. Отсутствует факт доказательства наличия капсулы Глиссона в этом участке, который составляет область ремоделирования. На фиг. 4B продемонстрировано, что пересадка и миграция донорских клеток была быстрой; в течение недели все донорские клетки находились в пределах печени хозяина; донорские клетки находились как возле участка трансплантата, а также на противоположной стороне доли печени (по оценкам, расстояние составляет по меньшей мере 1,5 см от трансплантата). В текущих исследованиях проводится анализ областей печени подсвинков на больших расстояниях (т.е. другие доли печени) для более точного определения того, насколько далеко может осуществляться миграция донорных клеток в течение определенного периода времени. Показаны донорские клетки (розовые ядра) возле долек из зрелых гепатоцитов хозяина (травянисто-зеленый цвет в результате аутофлуоресценции липофусцинов) на отдаленной по отношению к участку трансплантата стороне доли печени. На фиг. 4C показано, что созревание донорских клеток в направлениях дифференцировки зрелых клеток происходило одновременно с резорбцией HA. Пересадка области, содержащей донорские GFP+ клетки (одиночные клетки с розовыми ядрами) возле гепатоцитов хозяина (a), травянисто-зеленого цвета (аутофлуоресценция липофусцинов), и легко отличимые от зрелых происходящих от донорских (b) гепатоцитов, которые имеют лавандовый цвет (слияние розового GFP, синего DAPI и зеленых липофусцинов), которые ограничивали в дифференцировке, из GFP+ стволовых клеток. В случае других анализов IHC (данные не показаны), клетки яркого-зеленого цвета в планшетах как с гепатоцитами хозяина, так и донорскими гепатоцитами представляли собой клетки эндотелия и звездчатые клетки.

На фиг. 5A-5C показано сравнение пересадки и созревания клеток в трансплантатах печени в виде заплаты через одну и две недели после трансплантации. На фиг. 5A представлено исследование свиной печени через 1 неделю после осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты. Применяли краситель сириус красный, азокраситель, окрашивающий коллагены, и иммуногистохимический анализ для пан-цитокератина (pCK) и Sox9; и иммунофлуоресцентные (IF) окрашивания осуществляли на последовательных срезах в 3-мкм. В участке трансплантата в виде заплаты трансплантируемые донорские клетки сливали с дольками печени. В верхних панелях (исходное 5-кратное увеличение), трансплантаты в виде заплаты состояли из мезенхимальных и эпителиальных клеток рСК+ (стрелки). В средних панелях более высокое увеличение (20-кратное). Эпителиальные клетки демонстрируют иммунофенотип, который является типичным для стволовых клеток желчных протоков (BTSC), экспрессирующих билиарные цитокератины (pCK) и маркер эндодермальных стволовых клеток Sox9. BTSC в пределах трансплантата в виде заплаты упорядочены в нити из клеток, повторно организующие желчные протоки (стрелки), и находятся в непосредственной связи с гепатоцитарными пластинками прилегающей дольки печени (указатели стрелок). Гепатоциты хозяина в дольках являются pCK- и Sox9-отрицательными. В нижних панелях (исходное 20-кратное увеличение) иммунофлуоресценция GFP обеспечивает определение отдельных пересаженных клеток и их потомства. Гепатоциты в дольках, прилегающих к трансплантату в виде заплаты, были GFP-положительными, что означает то, что они представляли собой клетки донорского происхождения, которые слились с паренхимой печени хозяина. На поверхности раздела, между трансплантатом в виде заплаты и дольками печени протоки pCK⁺/GFP⁺ (которые представляют собой холангиоциты донорского происхождения) находились в непосредственной связи с клетками GFP+/pCK (гепатоциты донорского происхождения) в пределах долек (стрелки-указатели), что указывает на созревание пересаженных клеток в направлении дифференцировки гепатоцитов. На фиг. 5В представлено исследование свиной печени через 2 недели после осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты. IF-окрашивания показывают, что клетки GFP⁺ присутствуют в дольках, отдаленных от места трансплантации. Они рассеиваются однородно и, таким образом, находятся в смеси с клетками-хозяевами (клетки с синими ядрами из DAPI) и донорскими клетками (розовые/фиолетовые ядра в результате слияния синего от DAPI и красного из метки GFP). Они коэкспрессируют маркеры зрелых гепатоцитов, такие как ядерный фактор гепатоцитов (HNF) 4α (смесь зеленых и розовых/фиолетовых ядер) и альбумин (зеленая цитоплазма и розовые/фиолетовые ядра). Были включены отдельные и слитые каналы. Ядра были отображены синим (DAPI). Исходное увеличение: 40-кратное. На фиг. 5C представлена оценка свиной печени через неделю после осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты и демонстрация широкой области ремоделирования, которая образуется на поверхности раздела между трансплантатом в виде заплаты и тканью хозяина. Срез на изображении при небольшом увеличении и на увеличенном изображении 1 представляет собой окрашивание гематоксилином/эозином (слабо окрашенный); срез на изображении 2 окрашен Vector-SG, придающим синий/серый цвет; срез на изображении 3 окрашен на наличие альфа-фетопротеина на фоне гематоксилина/эозина. Определенные участки на 5C пронумерованы и коррелируют с видами в увеличенном масштабе, которые указывают на изменения, происходящие в пределах долек. Дольки и ацинусы печени хозяина разрушаются вследствие избытка MMP, наполняющих участок наряду с донорскими клетками. Донорские клетки наблюдаются в пограничных областях долек, участках, которые также демонстрируют специфичные для печени маркеры, такие как HNF4-a и α-фетопротеин, что означает то, что клетки созревают в направлении дифференцировки клеток печени. Эти признаки не демонстрируются BTSC и, таким образом, они являются показателями того, что донорские клетки подвергаются созреванию в направлении дифференцировки печеночных клеток.

На фиг. 6A-6D представлена информация о трансплантатах в виде заплаты из стволовых клеток органоидов, связанных с поджелудочной железой. На фиг. 6A представлено изображение при небольшом увеличении (панорамная развертка) донорских клеток GFP+, которые прививались по большей части к поджелудочной железе и в подслизистую оболочку двенадцатиперстной кишки (область, содержащая бруннеровы железы). Иммунофлуоресцентное окрашивание поджелудочной железы, печени и двенадцатиперстной кишки свиньи в участке трансплантата в виде заплаты. GFP (зеленый), инсулин (красный), DAPI (синий). Клетки донорского происхождения GFP+ встречаются вблизи от участка, где был установлен трансплантат в виде заплаты, и, по-видимому, интегрируются в паренхиму поджелудочной железы. Шелковая сетка хирургического каркаса SERI наблюдается между поджелудочной железой, печенью и двенадцатиперстной кишкой. На фиг. 6B показано, что донорские клетки созревают до функциональных островковых клеток. При более высоком увеличении GFP+/инсулин+ бета-клетки донорского происхождения (желтые от с GFP и красные от окрашивания инсулина) наблюдают смешанными с GFP-/инсулин+ (красными) бета-клетками хозяина в паренхиме поджелудочной железы. Островковые клетки окружены большим количеством GFP+ клеток, характеризующихся морфологией, характерной для экзокринных клеток поджелудочной железы, в том числе ациноцитов и проточных клеток. Подтверждением данной интерпретации являются результаты на C и D того, что фактически эти клетки продуцируют амилазу, классический ацинарный маркер. На фиг. 6C и фиг. 6D показаны доказательства происхождения функциональных ациноцитов из донорских стволовых клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание последовательного среза из одного и того же тканевого блока в участке трансплантата в виде заплаты и с акцентом на область пересаженных GFP+ донорских клеток. Амилаза (зеленый), инсулин (красный), глюкагон (белый, невидимый в панорамной развертке на C, однако заметный при более высоком увеличении на D), DAPI (синий). Амилаза+ ациноциты представляют собой подавляющее большинство экзокринной ткани поджелудочной железы. В результате сравнения окрашивания, представленного в последовательных срезах при небольших и больших увеличениях, сделан вывод о том, что большинство GFP+ клеток донорского происхождения приобрели направление дифференцировки в амилаза+ ациноциты.

На фиг. 7A-7H предложена характеристика матриксных металлопротеиназ (MMP). MMP состоят из большого семейства генов кальцийзависимых цинксодержащих ферментов, которые растворяют компоненты внеклеточного матрикса. У свиней известно по меньшей мере 24 изоформы, часть из которых представлена секретируемыми факторами (например, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9) и подгруппа представлена мембраноассоциированными факторами (например, MMP14, MMP15). MMP1 определяли с помощью IHC, особенно в участках ремоделирования, однако не с помощью секвенирования РНК, поскольку еще отсутствовала аннотированная форма свиного MMP1, доступная для анализов секвенирования РНК. На фиг. 7A, фиг. 7B, фиг. 7C и фиг. 7D показаны изоформы секретируемых и мембраноассоциированных категорий, которые экспрессировались как стволовыми клетками/клетками-предшественниками, так и зрелыми клетками. Количественная оценка уровней экспрессии указывала на то, что мембраноассоциированные формы были аналогичными как в случае стволовых клеток/клеток-предшественников, так и в случае зрелых клеток (следует отметить сравнения на фиг. 7D). В отличие от этого, секретируемые формы экспрессировались при очень высоких уровнях в столовых клетках/клетках-предшественниках и при низких или ничтожно низких уровнях в различных типах зрелых клеток. Клеточные популяции анализируемых зрелых клеток выделяли из суспензий печени и ткани желчных протоков подсвинков, и они состояли из CD45+ клеток (гематопоэтические клетки), CD146+ клеток (звездчатые клетки), CD31+ клеток (клетки эндотелия), EpCAM+/CD45- клеток (зрелые диплоидные гепатоциты и холангиоциты). Эти EpCAM+/CD45- клетки представляют собой зрелые паренхимальные клетки, встречающиеся в печени подсвинков. BTSC выделяли из желчных протоков с помощью протоколов, приведенных в примерах. На фиг. 7E показана иллюстративная экспрессия MMP в областях ремоделирования с использованием трансплантата BTSC/ELSMC. На срезе, прилегающем к трансплантату в виде заплаты из BTSC/ELSMC, наблюдали окрашивание трихромом, указывающее на область (скобка) ремоделирования. Область представлена в виде красных и синих линейных полос, являющихся клетками и компонентами матрикса, подвергающимися растворению «множеством» MMP. Полосы заканчиваются по краям долек, которые все еще являются главным образом интактными, однако начинают «изнашиваться» на своих границах вследствие эффектов MMP, происходящих из инвазивных клеток. На фиг. 7F показаны иллюстративные изображения IHC-анализов в случае MMP1 (Novo-red+). Метиловый зеленый представляет собой фоновый краситель. Дольчатая/ацинарная структура печени растворялась до ундулирующих завитков и отмечалась выраженной экспрессией MMP1, секретируемой изоформой MMP. На фиг. 7G показан срез, окрашиваемый на наличие MMP2 (Novo-red+). Гематоксилин представляет собой фоновый краситель. Дольчатая/ацинарная структура печени исчезала и замещалась смесью клеток с сильным окрашиванием в случае MMP2 (цвет бурой ржавчины). На фиг. 7H показан процесс ремоделирования, продолжающийся в дольках печени. Дольки печени превращались в полосы из клеток с рассеянными между ними инвазивными клетками; экспрессия MMP2+ (окрашено в цвет ржавчины) является очень высокой и способствует потере дольчатых/ацинарных структур. По мере выведения гиалуронанов (через 2-3 недели) дольчатые структуры образовывались повторно.

На фиг. 8 представлена схематическая демонстрация явления пересадки и интеграции в печени и в поджелудочной железе.

На фиг. 9A-9E представлена информация о трансплантатах в виде заплаты зрелых гепатоцитов, объединенных со зрелыми мезенхимальными клетками (MMC), такими как клетки эндотелия или звездчатые клетки. Эти трансплантаты в виде заплаты были неспособны к пересадке. Пересадка достигалась, если бы гепатоциты объединяли с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), которые в данном случае представляли собой свиные мезенхимальные стволовые клетки (MSC). В присутствии ELSMC пересадка происходила, однако с ограничением в областях, расположенных возле трансплантата. На фиг. 9A показано трихромное окрашивание нормальной печени свиньи. Столбец составляет 200 мкм для изображения при небольшом увеличении (a) и 50 мкм для изображения при более высоком увеличении (b). Следует отметить коллагены в капсуле Глиссона и границах между печеночными ацинусами. На фиг. 9B показано трихромное окрашивание трансплантата в виде заплаты нормальных зрелых гепатоцитов, объединенных со зрелыми мезенхимальными клетками (MMC), клетками эндотелия и звездчатыми клетками, которые не пересаживались. На изображении при низком увеличении (a) следует отметить, что капсула Глиссона является интактной и клетки остаются сверху капсулы; (b) при более высоком увеличении имеется доказательство некоторого ремоделирования (явление пластичности) клеток в дольке рядом с трансплантатом (красный цвет в виде пятен в пределах гепатоцитов). Эта пластичность предположительно связана с мембраноассоциированными MMP, которые, как известно, присутствуют как на стволовых клетках, так и на зрелых клетках. На фиг. 9C показаны IHC-анализы трансплантата в виде заплаты нормальных зрелых гепатоцитов, объединенных со зрелыми мезенхимальными клетками (MMC). Срез окрашивали антителом к RBMY-1 и гематоксилином в качестве контрастного красителя. Капсула Глиссона является интактной и, таким образом, представлены граничные зоны между дольками. При более высоком увеличении (b) очевидно, что пересадка не произошла; (d) отрицательный контроль предназначен (окрашивание без первичного антитела) для обозначения неспецифического окрашивания. На фиг. 9D показано трихромное окрашивание трансплантата в виде заплаты нормальных зрелых гепатоцитов, объединенных с ELSMC, которые в данном случае представляли собой свиные мезенхимальные стволовые клетки (MSC), выполняющие функцию клеточного источника MMP. Трансплантат отделяется на поверхности раздела между трансплантатом и тканью хозяина. Скобка обозначает область ремоделирования. Следует отметить, что дольки печени утратили матрикс, который обычно составляет граничные зоны между ними, и выглядят изношенными по краям. При более высоком увеличении (a) на всем изображении видны донорские клетки (бледно-красные клетки по сравнению с темно-красными клетками в центрах долек); на (b) представлен вид области в увеличенном масштабе, на котором показано, что капсула Глиссона является значительно более тонкой под трансплантатом (по сравнению с областью слева от прямоугольника) и на (c). Значительное ремоделирование было отчетливым в клетках, прилегающих к трансплантату (c). На фиг. 9E показан трансплантат в виде заплаты гепатоцитов, объединенных с ELSMC (свиные MSC), через одну неделю. Срез (a) окрашивали антителом к RBMY-1 (коричневый) и метиловым зеленым в качестве контрастного красителя. Донорские клетки, пересаженные (области цвета бурой ржавчины) и дозревшие до зрелых паренхимальных клеток в ацинусах возле трансплантата. На срезе (b) показан вид увеличенного в масштабе изображения возле остатков истонченной капсулы Глиссона, на котором показано, что донорские клетки (темно-коричневые ядра) были рассеяны однородно между клетками-хозяевами (ядра были окрашены метиловым зеленым). Срез (c) представляет собой отрицательный контроль для (b). Срез (d) окрашивали антителом к GFP (связанным с Novus red и приводящим к образованию цвета бурой ржавчины) с метиловым зеленым в качестве контрастного красителя. Большинство клеток пересаживались и образовывали полосу донорских (зрелых) темно-красных гепатоцитов в пределах ацинусов печени хозяина. Капсула Глиссона оставалась, но уменьшалась в толщине. Миграцию далеко за пределы области печени возле трансплантата не наблюдали в течение трехнедельного периода в рамках экспериментов.

На фиг. 10 представлена схема, на которой сравнивают пересадку стволовых клеток по сравнению со взрослыми клетками.

На фиг. 11 показано доказательство того, что способ пересадки включает миграцию клеток на значительные расстояния в ткань хозяина. В данном случае это продемонстрировано для трансплантатов органоидов из BTSC/ELSMC через одну неделю после трансплантации. Схема печени, разделенной на 8 различных зон, используется для обозначения областей, оцениваемых на наличие донорских клеток. Срезы получают из областей 1-8, а затем окрашивают для того, чтобы обеспечить идентификацию донорских клеток. В таблице представлены результаты, показывающие расстояния между трансплантатом и каждой областью и пропорцию обнаруженных GFP+ клеток. Изображения слева таблицы представляют собой развертки иллюстративного среза из каждой зоны. Окрашивание темно-коричневого цвета является наиболее сильным в зоне 6 возле трансплантата и ослабевает по мере возрастания расстояния от трансплантата, наиболее бледное окрашивание присутствует в зоне 1.

На фиг. 12A-12E представлены доказательства миграции донорских клеток во всей печени хозяина. GFP+ клетки, окрашенные Novo-red (цвет бурой ржавчины); клетки-хозяева окрашивали метиловым зеленым. На фиг. 12A представлено изображение при низком увеличении границы раздела трансплантата и печени хозяина. Часто наблюдали отделение трансплантата от печени хозяина (следует отметить это также на фиг. 3) и было показано, что оно коррелировало с чрезвычайно высокими уровнями секретируемых MMP. Вид в увеличенном масштабе областей (a) и (b) представлен ниже. Следует отметить участки на изображении при низком увеличении и на виде в увеличенном масштабе на (b), в которых окрашивание представлено в виде пятен, с участками, имеющими размытый вид, которые образовались из-за уровней гиалуронана в ткани. На фиг. 12B изображены промежуточные зоны, к которым мигрировали клетки. Донорские клетки находятся во всей ткани, как в желчных протоках, так и в паренхиме ацинусов. На фиг. 12C показаны отдаленные зоны, в которые мигрировали клетки. Следует отметить, что окрашиваются только желчные протоки. На фиг. 12D представлены виды в увеличенном масштабе, на которых показаны донорские клетки в желчных протоках. На фиг. 12E и фиг. 12F представлены виды в увеличенном масштабе в паренхиме с демонстрацией того, что донорские клетки характеризуются мечением GFP в ядрах.

На фиг. 13 показаны побочные состояния, полученные в случае трансплантатов в виде заплаты с определенными подложками (см. также таблицы 1 и 2). Они включали некроз, проявления адгезии и участки, которые, как обнаружено, появляются, когда трансплантаты помещали слишком близко к некоторым протокам таким образом, что набухание вызывало окклюзию протоков.

На фиг. 14 показана схема как стадий линии дифференцировки эпителиальных клеток (фиг. 14A) и мезенхимальных клеток (фиг. 14B), так и соответствующих профилей биомаркеров.

На фиг. 15 показаны органоиды трансплантата H2B-GFP+ BTSC/ELSMC, пересаженного на почку. Оценку выполняли через 1 неделю после осуществления пересадки. На панели A показано трихромное окрашивание пересаженной почки. Получали поперечный срез почки для того, чтобы подвергнуть воздействию более глубокий слой, который находился в трансплантате в виде формы «V». Нижняя половина «V» с окрашиванием ярко-синим представляет собой сторону трансплантата на почке; верхняя часть «V» на фигуре представляет собой более глубокий слой по отношению к пересаженному слою. На панели B показано окрашивание H&E для того же среза пересаженной почки. На панели C представлено более крупное увеличение почки с трансплантатом в виде заплаты. Капсула почки под трансплантатом была ослаблена (от растворения MMP) таким же образом, как у печени. На панели D показано IHC-окрашивание клеток GFP+ (темно-красный), которые были пересажены в почку в слой под заплатой. На панели E показана пересадка клеток GFP+ (темно-красный) в более глубоких слоях почки. Отчеты о вскрытии указывали на отсутствие некроза в пересаженной почке или в других участках организма животных, которые подвергались пересадке трансплантатов в виде заплаты.

Краткое описание таблиц

В таблице 1 представлена обобщенная информация о хирургических или других подходах для осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты.

В таблице 2 представлено сравнение подложек, исследуемых в отношении иллюстративных трансплантатов в виде заплаты.

В таблице 3 представлена обобщенная информация об антителах, применяемых для IHC и IF в примерах.

В таблице 4 представлена обобщенная информация о праймерах, применяемых для анализов qRT-PCR.

Подробное описание

Варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением более полно будут описаны в данном документе далее. Однако аспекты настоящего изобретения могут быть воплощены в других формах и не должны рассматриваться как ограниченные воплощениями, изложенными в данном документе. Наоборот, эти воплощения предоставлены предусмотрены для того, чтобы настоящее изобретение было обстоятельным и полным и полностью передавало объем настоящего изобретения специалистам в данной области техники. Терминология, применяемая в данном документе в описании, предназначена только для описания определенных воплощений и не подразумевает ограничение настоящего изобретения. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки в полном их объеме.

Если не указано иное, то все термины (в том числе технические и научные термины), используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Далее будет понятно, что термины, такие как термины, определенные в широко используемых словарях, следует интерпретировать как имеющие значение, которое соответствует их значению в контексте настоящей заявки и соответствующей области техники, и не следует интерпретировать в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если в данном документе явно не определено иное. Если явно не определено ниже, такие термины следует интерпретировать в соответствии с их обычным значением.

При практической реализации технологии по настоящему изобретению будут применяться, если не указано иное, стандартные методики культивирования тканей, иммунологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области. См., например, Sambrook and Russell eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2012) Current Protocols in Molecular Biology; серия Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual, 2d edition; Freshney (2011) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; патент США № 4683195; Hames and Higgins eds. (1985) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London) и Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology.

Если контекст не указывает на иное, то конкретно подразумевается, что различные признаки настоящего изобретения, описанные в данном документе, могут использоваться в любой комбинации. Более того, настоящее изобретение также предусматривает, что в некоторых воплощениях любой признак или комбинация признаков, изложенных в данном документе, могут быть исключены или пропущены. Для иллюстрации, если описание указывает, что комплекс содержит компоненты А, B и C, то конкретно предусмотрено, что любое из A, B или C или их комбинация могут быть пропущены и отклонены в индивидуальном порядке или в любой комбинации.

Все цифровые обозначения, например, pH, температура, время, концентрация и молекулярная масса, в том числе диапазоны, представляют собой приближенные величины, которые варьируются ( + ) или ( - ) с шагом 1,0 или 0,1, если требуется, или в качестве альтернативы путем вариации +/- 15%, или в качестве альтернативы 10%, или в качестве альтернативы 5%, или в качестве альтернативы 2%. Необходимо понимать, хотя это не всегда указано явно, что всем цифровым обозначениям предшествует термин «приблизительно». Также необходимо понимать, хотя это не всегда указано явно, что реагенты, описанные в данном документе, являются всего лишь иллюстративными, и что их эквиваленты известны из уровня техники.

Определения

Используемые в настоящем изобретении и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также предполагают включение форм множественного числа, если контекст явно не указывает на иное.

Термин «приблизительно», используемый в данном документе при ссылке на измеряемую величину, такую как количество или концентрация (например, процент коллагена во всех белках в каркасе биоматрикса) и т.п., означает включение вариаций, составляющих 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже 0,1% от определенного количества.

Термины «приемлемый», «эффективный» или «достаточный» при использовании для описания выбора любых компонентов, диапазонов, лекарственных форм и т.д., раскрытых в данном документе, предусматривают, что указанный компонент, диапазон, лекарственная форма и т.д. являются подходящими для раскрытой цели.

Кроме того, как используется в данном документе, «и/или» относится к любым и всем возможным комбинациям одного или более из соответствующих перечисленных пунктов, а также отсутствию комбинаций при интерпретации в качестве альтернативы («или»), и охватывает их.

Используемый в данном документе термин «содержащий» предполагает обозначение того, что композиции и способы включают упомянутые элементы, но не исключают другие. Используемая в данном документе переходная фраза «по сути включающий» (и грамматические варианты) должна интерпретироваться как охватывающая перечисленные материалы или стадии «и материалы и стадии, которые не оказывают существенного влияния на основную(-ые) и новую(-ые) характеристику(-и)» упомянутого варианта осуществления. См. In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (ключевые моменты в оригинале); см. также MPEP § 2111.03. Таким образом, термин «по сути включающий», используемый в данном документе, не следует интерпретировать как эквивалент термину «содержащий». Термин «состоящий из» будет означать исключение больше чем микроэлементов из других ингредиентов и значительных стадий способов для введения композиций, раскрытых в данном документе. Аспекты, определяемые с помощью каждого из этих переходных терминов, входят в объем настоящего изобретения.

Используемый в данном документе термин «трансплантат в виде заплаты» относится к композиции клеток, включенных в соответствующий биоматериал или содержащихся в нем, который дает возможность трансплантировать донорские клетки (аллогенные или аутологичные) хозяину. В некоторых воплощениях термин относится к композиции клеток, включенных в соответствующий биоматериал или содержащихся в нем, который дает возможность трансплантировать донорские клетки хозяину. Биоматериалы представляют собой биоматериалы, которые могут быть получены в определенных условиях (например, базальной среде, необязательно дополненной, и/или среде из питательных факторов, витаминов, аминокислот, углеводов, минеральных веществ, инсулина, трансферрина/Fe и/или липидов (очищенных свободных жирных кислот, образующих комплексы с очищенным альбумином совместно с молекулой липопротеинового носителя, такой как липопротеин высокой плотности)), и содержаться, необязательно затвердевшими, в мягком геле (при 200 Па, необязательно примерно 100 Па), и быть покрытыми подложкой, которая характеризуется достаточной прочностью на растяжение для того, чтобы обеспечить хирургическое прикрепление или иным образом связывание с тканью или органом, и при этом иметь химическую структуру, которая оказывает минимальные эффекты в отношении дифференцировки донорских клеток. Следует избегать добавок с факторами, которые могут вызывать дифференцировку клеток, особенно мезенхимальных клеток на ранней стадии дифференцировки (ELSMC); они включают сыворотку, факторы роста и цитокины, воздействующие на ELSMC, а также зрелые компоненты матрикса (например, коллаген I типа).

Термин «подложка», используемый в данном документе, относится к материалу, который выступает в качестве подложки или барьера на поверхности трансплантата в виде заплаты, способному связывать трансплантат с целевым участком, и/или облегчать миграцию клеток в нем к целевому участку, и/или предупреждать, и/или подавлять миграцию клеток в направлении подложки. Подложка представляет собой или содержит «биоразлагаемый биосовместимый материал», «биосовместимый биоразлагаемый материал» или любую их вариацию, относящуюся к материалу, который (i) является биосовместимым с субъектом, в организм которого он трансплантируется, (ii) характеризуется механической стойкостью, чтобы противостоять сдвиговым и сжимающим воздействиям, которые возникают в органах и тканях (особенно внутренних органах и тканях), что в свою очередь обеспечивает функционирование этого материала в качестве хирургической ткани, и (iii) оказывает нейтральный или минимальный эффект в отношении статуса дифференцировки клеток, которые вступают в контакт с материалом. В некоторых воплощениях подложка трансплантата в виде заплаты содержит такой материал. В некоторых воплощениях механическая стойкость (ii) должна быть такой, чтобы подложка могла связывать трансплантат с целевым участком. В дополнительных таких воплощениях подложка направляет миграцию клеток к целевому участку, например, с помощью воздействия на дифференцировку этих клеток, мигрирующих в направлениях за пределы целевого участка или с помощью физической блокады такой миграции. В данном отношении подходящие материалы включают без ограничения шелк Seri, необязательно контурный шелк Seri или их производные, амнионы или их экстракты (например, на стороне, обращенной к плоду, и/или заплату или ткань, состоящие из PGA и/или PLLA). Неограничивающие примеры подходящих заплат из синтетических материалов включают тканую заплату, состоящую из сополимера, содержащего 91% PGA и 9% PLLA, вязаную заплату, состоящую из сополимера, содержащего 91% PGA и 9% PLLA, или нетканую заплату, состоящую из 100% PGA. В более широком смысле подходящие подложки могут включать формы шелка шелкопряда, такого как каркасы из хирургического шелка Seri^R (Sofregen, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США), другие производные шелка шелкопряда, а также синтетические ткани, такие как формы сополимера полигликолевой кислоты и L-молочной кислоты (PGA/PLLA).

В некоторых воплощениях подложка также является биорассасываемой. Используемый в данном документе термин «биорассасываемый» относится к материалу, который может быть расщеплен организмом хозяина или реципиентом трансплантата и не требует механического удаления. В некоторых воплощениях биорассасываемая подложка подлежит биорассасыванию в течение периода, составляющего от приблизительно 2 до приблизительно 10 недель, от приблизительно 2 до приблизительно 20 недель, от приблизительно 2 до приблизительно 52 недель, от приблизительно 4 до приблизительно 16 недель, от приблизительно 4 до приблизительно 12 недель или от приблизительно 4 до приблизительно 8 недель. В некоторых воплощениях биорассасываемая подложка подлежит биорассасыванию в течение периода, составляющего от приблизительно 4 до приблизительно 8 недель, от приблизительно 4 до приблизительно 12 недель, от приблизительно 4 до приблизительно 16 недель, от приблизительно 4 до приблизительно 20 недель и от приблизительно 4 до приблизительно 52 недель.

Используемые в данном документе биоматериалы трансплантата, независимо от подложки могут включать биоматериалы, которые могут образовывать гидрогели. Термин «гель» относится к твердому гелеобразному материалу, который может характеризоваться свойствами, варьирующими от мягкого и жидкого до твердого и жесткого. Гели определяют как по сути разбавленную перекрестносшитую систему, которые характеризуется отсутствием потока при нахождении в стабильном состоянии. По весу, гели главным образом являются жидкими, при этом они все еще ведут себя как твердые вещества вследствие трехмерной перекрестносшитой сети в жидкости. Именно перекрестное связывание в жидкости придает гелю его структуру (твердость, жесткость, механические или вязкоупругие свойства) и способствует его адгезивной способности. В данном отношении гели представляют собой дисперсию из молекул жидкости в твердом веществе, в которой твердое вещество представляет собой непрерывную фазу, а жидкость представляет собой прерывную фазу. Термин «гидрогель», также обозначаемый в данном документе как «гидрогелевый матрикс», представляет собой неограничивающий пример геля, состоящего из макромолекулярного полимерного геля, состоящего из сети полимерных цепей. Гидрогели синтезируют из гидрофильных мономеров или гидрофильных димеров (например, в случае гиалуронана), как с помощью роста цепи, так и с помощью ступенчатого роста, наряду с образованием сети. Сетеобразная структура, наряду с незначительными нарушениями структуры, усиливают способность гидрогеля поглощать значительные количества воды посредством водородной связи. В результате этого гидрогели приобретают характерные прочные, но в то же время эластичные, механические свойства. Они способны к самопроизвольному образованию новых связей, в случае если в материале разрушаются старые связи. Наряду с силами электростатического притяжения структура гидрогелей активирует образование новых связей посредством нековалентной водородной связи.

Биоматериалы, применяемые для трансплантатов, характеризуются механическими свойствами, жесткостью, которые могут быть более строго определены как вязкоупругость биоматериалов. См https://en.wikipedia.org/wiki/Viscoelasticity. Биоматериалы для трансплантации, подходящие для пересадки, должны быть очень мягкими (например, приблизительно 100 Па), обеспечивать донорским клеткам условия, дающие возможность оставаться незрелыми (Lozoya et al. Biomaterials 2011; 32 (30): 7389-7402.), и, таким образом, способными продуцировать мембраноассоциированные и/или секретируемые формы MMP.

Используемый в данном документе термин «вязкоупругость» относится к свойству материалов проявлять как вязкие, так и упругие характеристики при перенесении деформации. Вязкие материалы, например мед, противостоят потоку со сдвигом и деформируются линейно со временем в случае приложения нагрузки. Эластичные материалы деформируются при растягивании и быстро возвращаются в свое исходное состояние сразу после устранения нагрузки. Вязкоупругие материалы имеют элементы обоих из этих свойств, и вследствие этого характеризуются зависимой от времени деформацией. В то время как эластичность представляет собой результат растягивания связей вдоль кристаллографических плоскостей в упорядоченном твердом веществе, вязкость представляет собой результат диффузии атомов или молекул внутри аморфного материала. Несмотря на то, что существует много инструментов для исследования механического и вязкоупругого ответа материалов, широкополосная вязкоупругая спектроскопия (BVS) и резонансная ультразвуковая спектроскопия (RUS) чаще всего применяются для исследования вязкоупругого поведения, поскольку они могут применяться при температурах выше и ниже температуры окружающей среды и являются более специфическими для исследования вязкоупругости. В этих двух инструментах применяется механизм подавления при различных частотах и временных диапазонах без обращения к температурно-временной суперпозиции. Применение BVS и RUS для исследования механических свойств материалов является важным для понимания того, как материал, характеризующийся вязкоупругостью, будет функционировать.

Используемый в данном документе термин «гиалуронан» или «гиалуроновая кислота» относится к полимеру из дисахаридных единиц, состоящих из глюкозамина и глюкуроновой кислоты [1-3], связанных с помощью β1-4, β1-3 связей, и их солей. Таким образом, термин гиалуронан относится как к природным, так и к синтетическим формам гиалуронанов. Встречающийся в природе гиалуронан (HA), водорастворимый полисахарид, содержит дисахаридные единицы D-глюкуроновой кислоты (GlcUA) и N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc), которые, поочередно связываясь, образуют линейные полимер. HA с высокой молекулярной массой может содержать от 100 до 10000 дисахаридных единиц. HA часто встречаются в природе в виде соли натрия, гиалуроната натрия. HA; гиалуронат натрия и препараты либо HA, либо гиалуроната натрия часто обозначаются как «гиалуронан». Неограничивающие примеры приемлемых солей гиалуроната включают гиалуронат калия, гиалуронат магния и гиалуронат кальция.

В гидрогеле можно применять также другие гликозаминогликаны (GAG). Они включают формы хондроитинсульфатов (CS) и дерматансульфатов (DSs), полимеры глюкуроновой кислоты и галактозамина, а также гепарансульфаты (HS) и гепарины (HP), полимеры глюкуроновой кислоты и глюкозамина. Степень и характер сульфатации этих GAG являются определяющими, поскольку различный характер сульфатации определяет образование комплексов с многими семействами белков (например, белками коагуляции, факторами роста, цитокинами, ферментами нейтрофилов). См., например, Powell AK, Yates EA, Fernig DG, Turnbull JE. Interactions of heparin/heparan sulfate with proteins: appraisal of structural factors and experimental approaches. Glycobiology. 2004 Apr;14(4):17R-30R]. Эти комплексы, подходящие для трансплантатов в виде заплаты, которые приводят к оптимизации пересадки, содержат гиалуронаны, несульфатированные GAG и комплексы с минимальным сульфатированием, такие как формы хондроитинсульфатов, встречающиеся в нишах для стволовых клеток, как показано в Karumbaiah L, et al. Chondroitin Sulfate Glycosaminoglycan Hydrogels Create Endogenous Niches for Neural Stem Cells. Bioconjug Chem. 2015 Dec 16;26(12):2336-49 и Hayes AJ, et al. Chondroitin sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 2008 Feb;56(2):125-38 (включены в данный документ посредством ссылки).

Используемый в данном документе термин «клетка» относится к одной или более клеткам в трансплантате. Клетки по настоящему изобретению являются эукариотическими. В некоторых воплощениях эта клетка имеет животное происхождение, необязательно происходит из человеческого органа и может представлять собой стволовую клетку, зрелую соматическую клетку, клетку-предшественника или посредники на стадиях дифференцировки от стволовых клеток до зрелых клеток. Термин «популяция клеток» или «клетки» относится к группе из одной или более клеток одинакового или разных типов клеток одинакового или разного происхождения; этот термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «донорские клетки», которые предполагают клетки, которые могут быть аутологичными или аллогенными. В некоторых воплощениях эта популяция клеток может происходить из линии клеток, из свежевыделенных клеток, или в некоторых воплощениях эта популяция клеток может происходить из участка органа или ткани, необязательно от донора или реципиента.

Термин «стволовая клетка» относится к клеточным популяциям, которые самовоспроизводятся (образуют дочерние клетки, идентичные исходной клетке) и которые являются мультипотентными, т.е. могут образовывать более чем один тип зрелых клеток. Термины «клетка-предшественница» или «предшественник», используемые в данном документе, в широком понимании включают потомство стволовых клеток и их потомков. Предшественники представляют собой клеточные популяции, которые могут быть мультипотентными, бипотентными или унипотентными, но характеризуются минимальной способностью к самовоспроизведению (или не имеют этой способности). Коммитированные предшественники представляют собой предшественников, которые являются унипотентными и могут дифференцироваться в определенную линию дифференцировки, приводя лишь к одному типу зрелых клеток. Неограничивающие примеры стволовых клеток включают без ограничения эмбриональные стволовые (ES) клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки, стволовые клетки зародышевых слоев, детерминированные стволовые клетки (эктодермальные, мезодермальные или эндодермальные), перинатальные стволовые клетки, стволовые клетки амниотического происхождения, мезенхимальные стволовые клетки (MSC), ангиобласты и клетки, происходящие из пуповины, вартонова студня и/или плаценты. Посредники между стволовыми клетками и коммитированными предшественниками включают в себя клеточные популяции, такие как гепатобласты и предшественники протоков поджелудочной железы и другие формы переходных амплифицированных клеток, которые могут быть мультипотентными, однако имеют значительный пролиферативный потенциал и более ограниченную способность к самовоспроизведению (или не имеют этой способности).

Термин «мезенхимальные клетки» относится к клеткам, происходящим из мезенхимы, в том числе без ограничения к ангиобластам, предшественникам клеток эндотелия, предшественникам звездчатых клеток, эндотелиям, звездчатым клеткам, стромальным клеткам, различным субпопуляциям зрелых клеток и клеток-предшественников и мезенхимальным стволовым клеткам (MSC), которые представляют собой мультипотентные стромальные клетки и различные субпопуляции зрелых мезенхимальных клеток и мезенхимальных клеток-предшественников. MSC представляют собой клеточные популяции, полученные с помощью способов отбора культур из тканей (Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015; PMID: 26273305. Существуют по меньшей мере две основные категории зрелых мезенхимальных клеток: (a) зрелые мезенхимальные клетки (звездчатые/стромальные клетки), которые продуцируют и окружены формами внеклеточного матрикса, которые включают фибриллярные коллагены (например, I, III, V типов), и ассоциированные компоненты (фибронектины, хондроитинсульфатные протеогликаны, дерматансульфатные протеогликаны), и связанные с ними сигналы (например, факторы роста, цитокины), которые образуют комплекс, и связанные с ними сигналы (например, факторы роста/цитокины), образующие комплекс, ассоциированный с клетками, которые обычно представляют собой линейные (нитеподобные) клеточные популяции. Неограничивающие примеры таких клеток включают звездчатые клетки, фибробласты сухожилий, стромы и миофибробласты (b). Зрелые мезенхимальные клетки, такие как клетки эндотелия, которые продуцируют и окружены формами внеклеточного матрикса, который содержит образующие сеть коллагены (например, IV типа, VI, VIII, X типов) и связанные с ними молекулы матрикса (ламинины, гепарансульфат протеогликаны, гепарин протеогликаны ассоциированных матриксных молекул (ламининов, гепарансульфатных протеогликанов, гепариновых протеогликанов) и связанных с ними сигналов (например, факторов роста, цитокинов), которые совместно ассоциированы с клетками, характеризующимися более плоской, или кубической, или валуноподобной морфологией. Неограничивающие примеры таких клеток включают клетки эндотелия и миоэпителиальные клетки.

Предшественники этих типов мезенхимальных клеток включают без ограничения указанным, ангиобласты, которые являются мультипотентными и которые могут дифференцироваться в линии клеток эндотелия (поздние стадии которых представляют собой фенестрированные клетки эндотелия) или звездчатые клетки (поздние стадии которых представляют собой миофибробласты (строму). Предшественники также включают мезенхимальные стволовые клетки (MSC), которые представляют собой мультипотентные клетки и могут дифференцироваться в фибробласты (строму), остеобласты (клетки кости), хондроциты (клетки хряща), миоциты (мышечные клетки) и адипоциты (жировые клетки)). MSC необязательно могут быть получены с помощью способов отбора культур (Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015; PMID: 26273305.

Термин «экспансия эпителиальных клеток» коррелирует с диаметром колонии эпителиальных клеток, которые обычно образуют колонии с кубической или валуноподобной морфологией, и с оценками роста, представляющими собой составное значение диаметров клеток колонии. В отличие от этого, оценки роста колоний мезенхимальных клеток коррелируют с плотностью колонии, поскольку мезенхимальные клетки являются более мигрирующими и подвижными, а плотность колонии представляет собой отражение совокупной суммы клеток, которые остаются в пределах границ колонии.

Термин «эпителиальные клетки» относится к клеткам, происходящим из эпителия, специализированным клеткам, которые обеспечивают разнообразные функции для ткани и/или системных потребностей хозяина. Их распознают в связи с их способностью мигрировать как предшественники или незрелые клетки; при созревании они становятся неподвижными и образуют слои плоских, или валуноподобных, или цилиндрических ориентированных клеток с апикальными, базальными и латеральными сторонами, которые связаны друг с другом с помощью совокупности соединений (коннексинов, плотных контактов, адгеренов). Их потенциал к экспансии определяют с помощью диаметра колонии (а не с помощью ее плотности). Зрелые эпителиальные клетки обеспечивают разнообразные функции, такие как секреция специализированных продуктов или составляющих метаболизма (гепатоциты, холангиоциты), детоксикация (гепатоциты), продуцирование ферментов (ациноциты), продуцирование эндокринных факторов (например, островковые или другие эндокринные клетки)), электрическая активность (нервные клетки) и всасывание (клетки кишечника).

Термин «стволовые клетки желчных протоков» (BTSC) относится к эпителиальным стволовым клеткам, встречающимся во всех желчных протоках и расположенных в перибилиарных железах (PBG), бруннеровых железах, как экстрамуральных, так и интрамуральных, а также в криптах ворсинок желчного пузыря. Они характеризуются способностью к переходу в коммитированные печеночные клетки-предшественники и/или клетки-предшественники поджелудочной железы. Потомки печеночных клеток проникают в синусоиды печени через канальцы Геринга; потомки клеток поджелудочной железы обнаружены в железах протоков поджелудочной железы (PDG), областях желчных протоков, расположенных в поджелудочной железе.

К настоящему времени были определены по меньшей мере 7 субпопуляций из популяций стволовых клеток с частично совпадающими свойствами и находящимися в диапазоне от крайне примитивных BTSC до популяций стволовых клеток, определяемых в виде печеночных столовых клеток или столовых клеток поджелудочной железы. Описание того, что известно в данном отношении, представлено ниже. Наиболее примитивные клетки обнаруживают как в экстрамуральных перибилиарных железах - железах, связанных с поверхностью желчных протоков, так и интрамуральных перибилиарных железах - железах, встречающихся в стенках желчных протоков. Интрамуральные перибилиарные железы (PBG) возле фиброзно-мышечного слоя в центрах стенок желчных протоков также могут считаться криптами (по аналогии с криптами кишечника), ниши в которых, как обнаружено, представляют собой популяции наиболее примитивных стволовых клеток. Наибольшие количества PBG в сети желчных протоков обнаруживают в общем гепатопанкреатическом протоке и в крупных внутрипеченочных желчных протоках. PBG не обнаруживают в желчном пузыре, а вместо этого ниши из стволовых клеток в желчном пузыре представляют собой нижние поверхности ворсинок желчного пузыря, которые содержат популяции стволовых клеток от промежуточной до поздней стадии дифференцировки, которые представляют собой предшественники печеночных стволовых клеток. BTSC представляют собой предшественники печени и поджелудочной железы. Они образуют печеночные стволовые клетки, предшественники печени, и стволовые клетки поджелудочной железы, предшественники поджелудочной железы, и они обнаруживаются по всем желчным протокам, но в количествах, зависящих от того, находятся ли они возле печени или возле поджелудочной железы. Таким образом, незначительные количества стволовых клеток поджелудочной железы и значительные количества печеночных стволовых клеток расположены в PBG крупных внутрипеченочных желчных протоков, в то время как незначительные количества печеночных стволовых клеток и значительные количества стволовых клеток поджелудочной железы расположены в PBG общего гепатопанкреатического протока.

Обобщенная информация о генетических сигнатурах представлена на фигурах. В целом все из субпопуляций BTSC экспрессируют типичные биомаркеры, которые включают в себя факторы транскрипции эндодермы как для печени, так и для поджелудочной железы (например, SOX9, SOX17, PDX1), гены плюрипотентности (например, OCT4, SOX2, NANOG, SALL4, KLF4/KLF5, BMI-1); одну или более из изоформ гиалуронанового рецептора (стандартные изоформы и/или варианты изоформ) CD44; CXCR4 и цитокератины 8 и 18. Субпопуляции стволовых клеток в желчных протоках и PBG включают (1) стволовые клетки бруннеровых желез в подслизистой оболочке двенадцатиперстной кишки, которые экспрессируют CK7, TRA-160 и 181 и характеризуются свойствами, отличными от свойств стволовых клеток в кишечнике; (2) интрамуральные стволовые клетки желчных протоков на ранней стадии дифференцировки (BTSC), которые экспрессируют натрий-йодидный симпортер (NIS) и CXCR4, OCT4, SOX2, NANOG, но не экспрессируют LGR5 или EpCAM; (3) интрамуральные BTSC на промежуточной стадии дифференцировки, которые экспрессируют меньше NIS, однако приобретают экспрессию LGR5, но не EpCAM; (4) интрамуральные BTSC поздней стадии дифференцировки (единственные BTSC, встречающиеся в желчном пузыре) и также встречающиеся в больших количествах в крупных внутрипеченочных желчных протоках и в общем гепатопанкреатическом протоке. Они экспрессируют как LGR5, так и EpCAM. Они представляют собой предшественники печеночных стволовых клеток (в печени и экспрессирующие SOX17, но не PDX1) и столовых клеток поджелудочной железы (в общем гепатопанкреатическом протоке и экспрессирующие PDX1, но не SOX17); (5) стволовые клетки печени могут встречаться в канальцах Геринга, в PBG крупных внутрипеченочных желчных протоков, в PBG во внепеченочных желчных протоках и в PBG общего гепатопанкреатического протока, однако самые большие количества обнаруживают во внутрипеченочных участках. Печеночные стволовые клетки сохраняют способность самовоспроизводиться и быть мультипотентными. Биомаркеры этих клеток включают SOX9, SOX17, HNF-4 альфа, ITGB1 (CD29), ONECUT 2, SALL4, LGR5, CD44, адгезивную молекулу эпителиальных клеток (EpCAM), обнаруживаемую в цитоплазме и на плазматической мембране, адгезивную молекулу нервных клеток (NCAM), CD133 (проминин), ничтожно малые уровни альбумина (или его отсутствие), полностью отсутствует альфа-фетопротеин (AFP), отсутствует P450 A7 и отсутствует секретиновый рецептор (SR). Печеночные стволовые клетки и гепатобласты экспрессируют цитокератины 8, 18 и 19; (6) стволовые клетки поджелудочной железы обнаруживают в небольших количествах во всех желчных протоках (даже в PBG в крупных внутрипеченочных желчных протоках), однако обнаруживают в значительных количествах в PBG общего гепатопанкреатического протока. Они содержат гены плюрипотентности и характеризуются экспрессией других генов, отмеченных для всех стволовых клеток популяций, однако они отличаются тем, что больше не содержат SOX17; субпопуляции, которые будут приводить к ограничению линии дифференцировки в островки, экспрессируют NGN3. Они экспрессируют EpCAM в клетках и на плазматической мембране и экспрессируют низкий уровень инсулина (или не экспрессируют его). Их созревание коррелирует с повышением экспрессии инсулина, а также с экспрессией других гормонов островков (например, глюкагона). Клетки, созревающие в ацинарные популяции, будут экспрессировать MUC6 и амилазу.

Отмечено, что печеночные стволовые клетки и клетки поджелудочной железы также могут встречаться в их соответствующих органах-источниках во время их раннего развития (например, в виде ESC или иным образом), и что любые из этих клеток, раскрытые в данном документе, в качестве альтернативы могут быть получены путем индукции (т.е. в виде iPSC).

Используемый в данном документе термин «вспомогательный» используется для описания клеток, которые способны содействовать размножению клеток из другой стадии дифференцировки или оказывать поддержку соседним клеткам посредством образования «паракринных сигналов», факторов, активных в своих эффектах в отношении близлежащих клеток с точки зрения выживания, экспансии, миграции, дифференцировки и созревания. Например, вспомогательные мезенхимальные клетки могут быть определены с помощью их способности влиять на эпителиальные клетки, необязательно с помощью секреции матриксных металлопротеиназ (MMP) и/или одного или более паракринных сигналов или факторов роста. Многие из них обобщены в последних обзорах. (Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015; PMID: 26273305.

Термин «партнеры по стадии дифферецировки» относится в данном документе к мезенхимальным клеткам и/или эпителиальным клеткам, которые находятся на стадии, подходящей для поддержания пересадки клеток. В случае печеночных стволовых клеток или клеток желчных протоков они состоят из ангиобластов (CD117+, CD133+, VEGFr+, CD31-отрицательных) и их непосредственных потомков, предшественников клеток эндотелия (CD133+, VEGFr+, CD31+, фактор фон Виллебранда (vWF+)) и предшественников звездчатых клеток (CD146+, ICAM-1+, альфа-гладкомышечный актин+ (ASMA), витамин A-отрицательных). Их можно имитировать, отчасти и/или до некоторой степени, с использованием мезенхимальных стволовых клеток (MSC), таких как без ограничения клетки, происходящие из костного мозга или жировой ткани. Не ограничиваясь теорией, считают, что такие клетки следует использовать непосредственно после выделения из ткани или после минимального пассирования, в идеале в бессывороточных условиях. Эти клетки обобщенно обозначаются в данном документе как мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC).

Посредники в сети линии дифференцировки обозначаются в данном документе как «переходные амплифицированные клетки», которые представляют собой клетки, которые могут быть бипотентными (или мультипотентными), характеризуются значительным пролиферативным потенциалом, однако демонстрируют незначительное фактическое самовоспроизведение (или его отсутствие), характеризуются низкой или умеренной экспрессией генов плюрипотентности (или даже ее отсутствием) и экспрессируют признаки, указывающие на детерминацию направления дифференцировки печеночных клеток (например, альбумин, альфа-фетопротеин) или клеток поджелудочной железы (например, инсулин, MUC6, амилаза). К ним относятся гепатобласты (сеть, приводящая к образованию печени) и предшественники протоков поджелудочной железы (сеть, приводящая к образованию поджелудочной железы).

Используемый в данном документе термин «предшественники протоков поджелудочной железы» относится к бипотентным клеткам, встречающимся в железах протоков поджелудочной железы (PDG), в поджелудочной железе и приводящим к образованию ациноцитов и островков. В исследованиях авторов изобретения было обнаружено, что они экспрессируют SOX9, PDX1, PTF1a, HNF1β, EpCAM, LGR5, ICAM-1, CD44, а субпопуляции экспрессируют NGN3, или MUC6, или амилазу. Они были подробно описаны другими авторами. См., например, Rezanejad H, Ouziel-Yahalom L, Keyzer CA, Sullivan BA, Hollister-Lock J, Li WC, Guo L, Deng S, Lei J, Markmann J, Bonner-Weir S. Heterogeneity of SOX9 and HNF1β is dynamic. Stem Cell Reports. 2018 Mar 13; 10(3):725-738.

Используемый в данном документе термин «гепатобласты» относится к бипотентным печеночным клеткам, которые приводят к образованию гепатоцитарных и холангиоцитарных линий дифференцировки и обнаруживают в канальцах Геринга или возле них, или в PBG в крупных внутрипеченочных желчных протоках. Они характеризуются исключительной способностью к пролиферации (т.е. экспансии), но с меньшей способностью к самовоспроизведению (или ее отсутствием) по сравнению с самовоспроизведением, наблюдаемым в печеночных стволовых клетках или BTSC. Эти клетки характеризуются биомаркерным профилем, который частично совпадает с печеночными стволовыми клетками и стволовыми клетками желчных протоков, но отличается от них. Они экспрессируют SOX9, низкие (или даже ничтожно малые) уровни SOX17, высокие уровни LGR5, HNF4-альфа и EpCAM, обнаруженные главным образом на плазматической мембране и экспрессирующие P450A7, цитокератин 7, секретиновый рецептор, характеризуются соответствующей экспрессией альбумина во всех гепатобластах, высокими уровнями альфа-фетопротеина (AFP), молекул межклеточной адгезии (ICAM-1), но отсутствием экспрессии NCAM и ничтожно малой экспрессией генов плюрипотентности (например, SALL4, KL4/KLF5, OCT4, SOX2, NANOG) или ее отсутствием, а также отсутствием экспрессии маркеров зрелых паренхимальных печеночных клеток (например, P450, таких как P4503A).

Используемый в данном документе термин «коммитированный предшественник» относится к унипотентной клетке-предшественнице, которая приводит к образованию одного типа клеток, например, коммитированной гепатоцитарной клетки-предшественника. В некоторых воплощениях они не экспрессируют генов плюрипотентности. Коммитированные предшественники гепатоцитов распознаются с помощью экспрессии альбумина, AFP, гликогена, ICAM-1, различных ферментов, участвующих в синтезе гликогена, и гена щелевых контактов - коннексина 28. Они приводят к образованию гепатоцитов. Коммитированный билиарный (или холангиоцитарный) предшественник приводит к образованию холангиоцитов и распознается с помощью экспрессии EpCAM, цитокератинов 7 и 19, аквапоринов, CFTR (муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) и мембранных насосов, ассоциированных с образованием желчи. В некоторых воплощениях коммитированный предшественник островков экспрессирует инсулин, глюкагон и другие гормоны островков, хотя и при низких уровнях; при созревании уровни экспрессии гормонов островков повышаются, но в случае конкретных клеток, экспрессирующих предпочтительно определенные гормоны.

Используемый в данном документе термин «агрегаты» относится к множеству клеток, которые скапливаются вместе. Агрегаты могут варьировать как по размеру, так и по форме, или могут быть по сути однородными по размеру и/или форме. Клеточные агрегаты, используемые в данном документе, могут быть, среди прочего, различных форм, таких как, например, сфера, цилиндр (предпочтительно с равной высотой и диаметром) или палочкообразной. Несмотря на то, что можно использовать агрегаты в виде других форм, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, как правило, предпочтительным является то, что клеточные агрегаты являются сферическими или цилиндрическими. Термин «неагрегированный» относится к отдельным или в виде одиночной клетки стволовым клеткам и/или клеткам-предшественницам или зрелым клеткам. В некоторых воплощениях композиции, предусмотренные в данном документе, могут содержать фактически агрегированные клетки, фактически неагрегированные клетки или их смесь.

Термин «органоид» относится в данном документе к определенному клеточному агрегату из донорских эпителиальных клеток с мезенхимальными клетками, который самособирается с помощью простых способов пэннинга, описанных в данном документе. В некоторых воплощениях мезенхимальные клетки представляют собой вспомогательные мезенхимальные клетки. В некоторых воплощениях органоиды образуются после культивирования в чашках Петри со слабым прикреплением и в определенных бессывороточных условиях, предназначенных специально для стадии(-й) дифференцировки агрегированных клеток в суспензии. Другие авторы получают органоиды с использованием определенных матриксных экстрактов, таких как Matrigel. В сущности, как известно, это вещество представляет собой промышленный стандарт. См. Hindley et al. Dev. Biology 2016; 420:251-261. PMID:27364469. Описанные условия, в которых эти органоиды поддерживаются, не будут успешно работать для применения этих органоидов в трансплантатах в виде заплаты, описанных в настоящем изобретении. Факторы, такие как факторы, обнаруженные в Matrigel, будут приводить к остановке или значительному снижению продуцированию MMP клетками, что требуется для успешного функционирования этих трансплантатов в виде заплаты. Более того, Matrigel не может обеспечивать компоненты условий для клеток, подлежащих клиническому применению у людей или для ветеринарных целей.

Термин «культивирование» или «культивирование клеток» означает поддержание клеток в искусственной, in vitro среде. Термин «система культивирования клеток» используется в данном документе для обозначения условий культивирования, в которых популяцию клеток можно выращивать ex vivo (за пределами организма).

Термин «среда для культивирования» используется в данном документе для обозначения раствора питательных веществ для культивирования, роста или пролиферации клеток. Среда для культивирования может быть охарактеризована с помощью функциональных свойств, таких как без ограничения способность поддерживать клетки в определенном состоянии (например, в плюрипотентном состоянии, пролиферативном состоянии, состоянии покоя и т.д.), приводить к созреванию клеток, в некоторых случаях, в частности, способствовать дифференцировке клеток-предшественников в клетки конкретной линии. Неограничивающими примерами сред для культивирования являются сывороточные среды (SSM), представляющие собой базальную среду с добавлением сыворотки при уровнях, которые обычно составляют от приблизительно 10% до приблизительно 20%. Сыворотка может быть аутологичной (того же вида, что и клетки) или более часто сывороткой от животных, которые стандартно забиваются для коммерческих целей (например, кур, коров, свиней и т.д.). Примечательно, что в воплощениях настоящего изобретения, включающих стволовые клетки, применяют среды, которые не допускают включение сыворотки и/или сывороточных компонентов, которые могут активировать дифференцировку. Среда Кубота, бессывороточная среда, разработанная для эндодермальных клеток/клеток-предшественников и состоящая из базальной среды (питательные вещества, аминокислоты, витамины, соли, углеводы) без меди, с низким содержанием кальция (< 0,5 мM) и с добавлением селена, цинка, инсулина, трансферрина, липидов, однако без цитокинов или факторов роста. Другие среды, которые, как обнаружено, поддерживают стволовые клетки, также могут быть пригодными, однако они должны исключать какие-либо факторы, которые вызывают дифференцировку клеток, поскольку процесс созревания будет приводить к образованию мембраноассоциированных и/или секретируемых MMP.

Базальные среды представляют собой буферы, используемые для культивирования клеток и состоят из аминокислот, сахаров, липидов, витаминов, минеральных веществ, солей, микроэлементов и различных питательных веществ в композициях, которые имитируют химические компоненты интерстициальной жидкости вокруг клеток. Кроме того, среды для культивирования клеток, как правило, состоят из базальных сред, дополненных небольшим процентом (обычно 2-10%) сыворотки. Для технологий осуществления пересадки, описанных в данном документе, применяют условия для поддержания клеток в виде стволовых клеток или ранних клеток-предшественников и, таким образом, имеет место избегание сыворотки или любой из типичных добавок, которые могут направлять развитие клеток к дифференцировке зрелых клеток. Кроме обычных базальных сред используют различные дополнения питательных веществ, липидов (смесь свободных жирных кислот в комплексе с альбумином и молекулами-переносчиками, такими как липопротеин высокой плотности). Добавляют лишь два гормона/фактора роста: инсулин, необходимый для углеводного метаболизма, и трансферрин, необходимый в качестве переносчика Fe для полимераз. Среда Кубота, бессывороточная среда, разработанная для эндодермальных клеток/клеток-предшественников, состоит из базальной среды (без меди с низким содержанием кальция (< 0,5 мM), с добавлением цинка, селена, инсулина, трансферрина, липидов, но не цитокинов или факторов роста. Необходимо избегать других факторов роста и цитокинов, а особенно сыворотки, поскольку они будут индуцировать дифференцировку донорских клеток и тем самым минимизировать образование MMP, которые требуются для процессов пересадки и миграции.

Термин «среда Кубота», используемый в данном документе, относится к любой среде, не содержащей меди, содержащей кальций (< 0,5 мM), селен, цинк, инсулин, трансферрин/Fe, смесь свободных жирных кислот, связанных с очищенным альбумином, и необязательно также липопротеин высокой плотности (HDL). В некоторых воплощениях среда Кубота представляет собой любую среду (например, RPMI 1640 или DMEM-F12) без меди, с низким содержанием кальция (например, 0,3 мM), с ~10-9 M селена, ~0,1% альбумина бычьей сыворотки или человеческого сывороточного альбумина (высокоочищенного и не содержащего жирных кислот), ~4,5 мM никотинамида, ~0,1 нM гептагидрата сульфата цинка, ~10-8 M гидрокортизона (необязательный компонент, используемый для печеночных предшественников, но не предшественников поджелудочной железы), ~5 мкг/мл трансферрина/Fe, ~5 мкг/мл инсулина, ~10 мкг/мл липопротеина высокой плотности и смесью очищенных свободных жирных кислот, которые добавляют после их связывания с очищенным сывороточным альбумином. Смесь свободных жирных кислот состоит из ~100 мM каждого из пальмитиновой кислоты, пальмитолеиновой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты и стеариновой кислоты. Неограничивающие иллюстративные способы получения этих сред были опубликованы в других документах, например, Kubota H, Reid LM, Proc. Nat. Acad. Scien. (USA) 2000; 97:12132-12137, раскрытие которого включено в данный документ в полном объеме посредством ссылки.

В некоторых воплощениях условия применения этих трансплантатов-заплат, следовательно, противоречат стандартному применению сред с добавлением небольшого процента (обычно 2-10%) сыворотки. Сыворотку длительное время добавляли для обеспечения требуемых сигнальных молекул (гормонов, факторов роста, цитокинов), необходимых для активации биологического процесса (например, пролиферации, дифференцировки). В некоторых воплощениях сыворотку не включают во избежание недопущения дифференцировки клеток и/или во избежание инактивации или подавления образования MMP, особенно в секретируемых формах.

Используемый в данном документе термин «количество, эффективное» или «эффективное количество» относится к количеству, которое является достаточным для лечения патологических или болезненных состояний (например, заболеваний печени или поджелудочной железы). Эффективное количество можно вводить с помощью одного или более введений, нанесений или доз. Такая доставка зависит от ряда переменных, в том числе периода времени, в течение которого отдельная единица дозирования подлежит применению, биоактивности композиции, пути введения и т.д. Однако следует понимать, что конкретное количество композиций для любого определенного пациента зависит от множества факторов, в том числе активности определенного применяемого средства, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола и питания пациента, времени введения, скорости экскреции, комбинации композиции, тяжести определенного заболевания (например, заболевания печени или поджелудочной железы), подлежащих лечению, и форме введения.

Термины «эквивалент» или «биологический эквивалент» используются взаимозаменяемо при обозначении определенной молекулы, биологического или клеточного материала, и подразумевают наличие минимальной гомологии, при этом поддерживается требуемая структура или функциональность.

Используемый в данном документе термин «экспрессия» относится к процессу, с помощью которого полинуклеотиды транскрибируются в мРНК, и/или процессу, с помощью которого транскрибируемая мРНК затем транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Если полинуклеотид происходит из геномной ДНК, то экспрессия может включать в себя сплайсинг мРНК в эукариотической клетке. Уровень экспрессии гена может быть определен с помощью измерения количества мРНК или белка в клетке или образце ткани; кроме того, уровень экспрессии множества генов может быть определен для установления профиля экспрессии для определенного образца.

Используемый в данном документе термин «функциональный» может использоваться для модификации любой молекулы, биологического или клеточного материала с предположением, что они приводят к определенному конкретному эффекту.

Термин «ген», используемый в данном документе, означает в широком смысле включение любой последовательности нуклеиновой кислоты, транскрибированной в молекулу РНК, независимо от того, является ли РНК кодирующей (например, мРНК) или некодирующей (например, ncRNA).

Используемый в данном документе термин «образовывать» и его эквиваленты (например, образование, образованный и т.д.) используются взаимозаменяемо с термином «продуцировать» и его эквивалентами при обозначении стадий способа, которые приводят к образованию органоида по настоящему изобретению.

Термин «выделенный», используемый в данном документе, относится к молекулам, или биологическим препаратам, или клеточным материалам, фактически не содержащим других материалов.

Термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидам, либо рибонуклеотидам или их аналогам. Полинуклеотиды могут характеризоваться любой трехмерной (3D) структурой и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Далее представлены неограничивающие примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена (например, зонд, праймер, метка EST или SAGE), экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, РНКи, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК из любой последовательности, выделенная РНК из любой последовательности, зонды и праймеры нуклеиновой кислоты.

Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги. Если модифицированные нуклеотиды присутствуют, то модификации структуры могут быть внесены в структуру нуклеотидов до или после сборки полинуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, с помощью конъюгации с метящим компонентом. Термин также относится как к двух-, так и к однонитевым молекулам. Если не указано или не требуется иное, то любой аспект этой технологии, который представляет собой полинуклеотид, охватывает двухнитевую форму и каждую из двух комплементарных однонитевых форм, которые, как известно или как предполагается, составляют двухнитевую форму.

Термин «белок», «пептид» и «полипептид» используются взаимозаменяемо и в их самом широком смысле для обозначения соединения из двух или более субъединиц аминокислот, аналогов аминокислот или пептидомиметиков. Субъединицы могут быть связаны с помощью пептидных связей. В другом аспекте субъединица может быть связана с помощью других связей, например, сложноэфирных, эфирных и т.д. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и при этом отсутствует ограничение на максимальное количество аминокислот, которые могут составлять последовательность белка или пептида. Используемый в данном документе термин «аминокислота» относится либо к природным и/или неприродным, либо к синтетическим аминокислотам, в том числе глицину, и как к D-, так и к L-оптическим изомерам, аналогам аминокислот и пептидомиметикам.

Используемый в данном документе термин «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо и предполагают обозначение любого животного. В некоторых воплощениях субъект может представлять собой млекопитающее. В некоторых воплощениях млекопитающее представляет собой крупный рогатый скот, представителя семейства лошадиных, представителя подотряда свинообразных, представителя семейства псовых, представителя семейства кошачьих, представителя обезьянообразных, представителя подсемейства мышиных, человека или крысу. В некоторых воплощениях субъект представляет собой человека.

Термин «ткань» используется в данном документе для обозначения ткани живого или умершего организма или любой ткани, происходящей из живого или умершего организма или разработанной для их имитации. Ткань может быть здоровой, патологической, пораженной в результате травмы, поврежденной и/или иметь генетические мутации. Термин «естественная ткань» или «биологическая ткань» и его вариации, используемые в данном документе, относится к биологической ткани, когда она существует в своем естественном состоянии или в состоянии, неизмененном по сравнению с тем, в котором она была получена из организма. Термин «микроорган» относится к сегменту «биоинженерной ткани», которая имитирует «естественную ткань».

Биологическая ткань может включать в себя любую одну ткань (например, совокупность клеток, которые могут быть взаимосвязаны) или группу тканей, составляющих орган или часть или область тела организма. Ткань может содержать гомогенный клеточный материал, или она может представлять собой сложную структуру, такую как структура, которая встречается в областях тела, в том числе грудная клетка, которая, например, может включать легочную ткань, скелетную ткань и/или мышечную ткань. Типичные ткани включают, без ограничения указанным, ткани, происходящие из печени, поджелудочной железы, желчных протоков, легкого, кишечника, щитовидной железы, тимуса, мочевого пузыря, почек, предстательной железы, матки, молочной железы, кожи и подлежащих дермальных тканей, головного мозга, спинного мозга, кровеносных сосудов (например, аорты, подвздошной вены), сердца, мышцы, в том числе любую их комбинацию.

Используемый в данном документе термин «лечить» или «лечение» заболевания у субъекта относится к (1) предупреждению симптомов или заболевания, возникающих у субъекта, который предрасположен или еще не имеет симптомов заболевания; (2) подавлению заболевания или остановке его развития; или (3) нормализации или обеспечению регрессии заболевания или симптомов заболевания. Как понятно из уровня техники, «лечение» представляет собой подход для получения полезных или требуемых результатов, в том числе клинических результатов. Для целей технологии по настоящему изобретению полезные или требуемые клинические результаты могут включать без ограничения облегчение или нормализацию одного или более симптомов, снижение выраженности состояния (в том числе заболевания), стабилизацию (т.е. не допущение ухудшения) статуса состояния (в том числе заболевания), задержку или замедление прогрессирования состояния (в том числе заболевания), нормализацию или облегчение стадий состояния (в том числе заболевания) и ремиссию (либо частичную, либо полную), либо выявляемую, либо не подлежащую выявлению.

Сокращения

AFP, α-фетопротеин; ALB, альбумин; BTSC, стволовые клетки желчных протоков; CD, общая детерминанта; CD44, гиалуронановые рецепторы; CD133, проминин; CFTR, муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости; CK, цитокератиновый белок; CXCR4, CXC-хемокиновый рецептор 4 (также называемый фузином или CD184; также называемый тромбоцитарным фактором 4; EGF, эпидермальный фактор роста; ELSMC, мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки, состоящие из ангиобластов и их потомков, предшественники клеток эндотелия и звездчатых клеток; EpCAM, адгезивная молекула эпителиальных клеток; FGF, фактор роста фибробластов; HB, гепатобласты; HGF, фактор роста гепатоцитов; HpSC, печеночные стволовые клетки; KM, среда Кубота, бессывороточная среда, разработанная для эндодермальных стволовых клеток; KRT, ген цитокератина; LGR5, рецептор 5, связанный с G-белком, содержащим богатые лейцином повторы, который связывается с R-спондином; MMP, матриксные металлопротеиназы, большое семейство протеиназ, ассоциированных с растворением внеклеточного матрикса, с миграцией клеток и с регенеративными ответами; NANOG, фактор транскрипции, имеющий определяющее значение в самообновлении; NCAM, молекула адгезии нервных клеток; NIS, натрий/йодидный симпортер; OCT4, (октамерсвязывающий фактор транскрипции 4) также известный как POU5F1 (домен POU, класс 5, фактор транскрипции 1), ген, экспрессируемый стволовыми клетками; PDX1, панкреатический и дуоденальный гомеобокс 1, фактор транскрипции, критически важный для развития поджелудочной железы; PBG, перибилиарные железы, ниши для стволовых клеток, предназначенные для стволовых клеток желчных протоков; SALL4, Sal-подобный белок 4, который, как обнаружено, является важным для самовоспроизведения стволовых клеток; SOX, Sry-связанный HMG бокс; SOX2, фактор транскрипции, который является необходимым для поддержания самообновления или плюрипотентности в эмбриональных и детерминированных стволовых клетках, SOX9, фактор транскрипции, ассоциированный с эндодермальными тканями (печенью, кишечником и поджелудочной железой; SOX17, фактор транскрипции, необходимый для дифференцировки печени; VEGF, фактор роста эндотелиальных клеток сосудов; vWF, фактор фон Виллебранда.

Способы практического применения настоящего изобретения

В примерах, предусмотренных в данном документе примерах заявители устанавливают трансплантат-заплату, новый способ трансплантации клеток во внутренние органы с зависящими от того, являются ли клетки стволовыми клетками или зрелыми клетками. Заявители демонстрируют эти способы в данном документе с использованием трансплантатов стволовых клеток желчных протоков (BTSC), предшественников как печени, так и поджелудочной железы, трансплантируемых в печень или поджелудочную железу. Хозяева, применяемые для разработки этих способов, представляют собой породы свиней Sus scrofa domestics. Они представляют собой основной вид животных, используемых в трансляционном исследовании, хирургических моделях и обучении выполнения процедур, и все чаще применяются в качестве альтернатив обезьянам в доклинических исследованиях.

Иллюстративное успешное осуществление достигалось с использованием органоидов стволовых клеток желчных протоков (BTSC), предшественников печени и поджелудочной железы, объединенных с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), и содержащихся в мягких (~100 Па) гиалуронановых (HA) гидрогелях. HA-гидрогели, содержащие органоиды, помещали на подложки шелка Seri (сетчатый материал), пропитанные на их серозных сторонах более жестким HA-гидрогелем (~700 Па), и хирургически или иным образом прикрепляли к поверхности печени или поджелудочной железы. В течение недели трансплантаты вызывали ремоделирование капсул органов и прилегающей ткани и, необязательно, отдаленной паренхимальной ткани с последующим слиянием донорских клеток и клеток-хозяев. Через две недели донорские клетки созревали до функциональных зрелых клеток, таких как гепатоциты (альбумин) или островковые клетки (клетки с инсулином β). Через три недели после выведения HA капсулы органов и нормальная ткань восстанавливались. Способы пересадки/миграции/интеграции оказались зависимыми от многочисленных ассоциированных с плазматической мембраной и секретируемых матриксных металлопротеиназ, экспрессируемых клетками.

Результаты этих примеров противоречат результатам прошлых попыток трансплантации клеток из солидных органов во внутренние органы, в которых трансплантацию осуществляли либо с помощью непосредственной инъекции, либо с помощью доставки клеток через сосудистый путь (см. обзоры Bhatia et al., Lanzoni et al., Weber и др.). Предшествующие способы трансплантации приводят к небольшим количествам пересаженных клеток, при этом имеются риски эмбол, которые могут быть опасными для жизни, и к значительным уровням эктопического распределения клеток. Эти проблемы привели к тому, что применение видов клеточной терапии для внутренних солидных органов было минимальным или вообще отсутствовало.

Стратегия трансплантата в виде заплаты предлагает альтернативный способ клеточной терапии, который может способствовать доставке соответствующих количеств клеток и их интеграции в ткань с целью значительного восстановления функции(-й). Примеры демонстрируют безопасность при условии, что биоматериалы и используемая подложка способствуют поддержанию некоторых или всех донорских клеток незрелыми и, таким образом, способными продуцировать соответствующий репертуар MMP. Распространенным источником отсутствия результата был(-и) любой(-ые) фактор(-ы), приводящий(-е) к дифференцировке донорских клеток. Не ограничиваясь теорией, в данном документе подразумевается, что очищенные MMP могут быть включены в биоматериалы для трансплантации, и/или клетки могут быть трансформированы для секреции MMP с использованием системы рекомбинантной экспрессии или другой методики генетической модификации, в качестве альтернативы получения клеток в трансплантате, которые естественным образом продуцируют соответствующие MMP. В таких воплощениях комбинация MMP, включенных или трансдуцированных посредством конструкции, должна включать MMP, определенные в профилях экспрессии, предусмотренных в примерах ниже.

Композиция трансплантата в виде заплаты

Аспекты, раскрытые в данном документе, относятся к трансплантату в виде заплаты, содержащему слой, который содержит одну популяцию или две или более популяции клеток (например, донорских клеток, которые могут быть аутологичными или аллогенными), а также источник MMP и подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, который может использоваться для связывания трансплантата с целевым участком. В некоторых воплощениях популяция или популяции клеток включают популяцию эпителиальных клеток и популяцию мезенхимальных клеток. В некоторых воплощениях популяции клеток должны поддерживаться в определенном состоянии или «стадии дифференцировки» в виде части трансплантата, что означает то, что они не дифференцируются или не созревают далее до включения в орган. Этого можно достичь путем балансировки переменных, связанных с источником клеток, содержанием MMP, используемой средой и качествами подложки. Каждый из этих аспектов описан более подробно в данном документе ниже.

Не ограничиваясь теорией, считается, что трансплантаты в виде заплат могут успешно функционировать в случае (1) оптимальной клеточной популяции или смеси клеток, например, донорских эпителиальных клеток и популяции вспомогательных мезенхимальных стволовых клеток/клеток-предшественников, которая образует мембраноассоциированные и/или секретируемые MMP в среде и гидрогеле, которые не приводят к дифференцировке популяции вспомогательных мезенхимальных стволовых клеток/клеток-предшественников, или которая иным образом содержит соответствующие MMP, и (2) подложки, подходящей для связывания трансплантата с целевым участком и предупреждения миграции клеток трансплантата в направлении подложки за пределы целевого участка.

Примерные клетки

Не ограничиваясь теорией, клетки могут находиться на любой стадии созревания, в том числе эмбриональных стволовых (ES) клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, детерминированных стволовых клеток, коммитированных предшественников, переходных амплифицированных клеток или зрелых клеток. Однако в определенных воплощениях источник MMP должен присутствовать в трансплантате в виде заплаты. Таким образом, в данном документе предусмотрены клеточные источники MMP для применения в трансплантатах в виде заплаты. Такие клеточные источники должны находиться на ранней стадии дифференцировки, при которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы. Неограничивающим примером такой ранней стадии дифференцировки являются мезенхимальные стволовые клетки на ранней стадии дифференцировки (ESMLC).

В некоторых воплощениях клетки, подлежащие трансплантации, представляют собой эпителиальные клетки, объединенные с мезенхимальными клетками. В некоторых воплощениях эпителиальные клетки предусматривают эпителиальные стволовые клетки. В некоторых воплощениях стволовые клетки предусматривают коммитированные и/или зрелые стволовые клетки. В некоторых воплощениях коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки предусматривают зрелые паренхимальные клетки. В некоторых воплощениях зрелые паренхимальные клеткивоплощениях предусматривают одно или более из гепатоцитов, холангиоцитов или островковых клеток. В некоторых воплощениях мезенхимальные клетки предусматривают ELSMC. В некоторых воплощениях ELSMC представляют собой одно или более из ангиобластов, предшественников эндотелия, предшественников звездчатых клеток и MSC. В некоторых воплощениях эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки являются партнерами друг друга по стадии дифференцировки. В некоторых воплощениях эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки не являются партнерами друг друга по стадии дифференцировки, например, не находятся примерно на одной и той же стадии дифференцировки или стадии созревания, соответственно. В некоторых воплощениях эпителиальные клетки представляют собой зрелые клетки. В некоторых воплощениях мезенхимальные клетки представляют собой ELSMC.

В некоторых воплощениях по меньшей мере одно из эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток происходит от донора. В некоторых воплощениях донор представляет собой субъекта, нуждающегося в тканевом трансплантате. В некоторых воплощениях донор представляет собой источник здоровых клеток для тканевого трансплантата. В некоторых воплощениях по меньшей мере одно из эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток является аутологичным по отношению к предполагаемому реципиенту трансплантата в виде заплаты. В некоторых воплощениях все клетки (т.е. эпителиальные и мезенхимальные) являются аутологичными по отношению к предполагаемому реципиенту трансплантата. В некоторых воплощениях донор клеток может представлять собой донора, отличного от реципиента (аллотрансплантат), или может также представлять собой субъекта (аутологичного), имеющего внутренний орган в пораженном или дисфункциональном состоянии, где необязательно их получают из части внутреннего органа, который не является пораженным или дисфункциональным, и/или клетки которого были генетически модифицированы для восстановления функции.

В другом аспекте мезенхимальные клетки являются партнерами донорских клеток по стадии дифференцировки, например, на сопоставимой или соответствующей стадии дифференцировки. В другом аспекте мезенхимальные клетки не являются подходящими партнерами донорских клеток по стадии дифференцировки. Мезенхимальные клетки на стадии дифференцировки могут представлять собой ангиобласты, предшественники ранней стадии дифференцировки клеток эндотелия и/или звездчатых клеток, мезенхимальные стволовые клетки, клетки эндотелия или звездчатые клетки или производные этих клеточных популяций.

В случае трансплантатов на основе стволовых клеток эпителиальные клетки должны объединяться со своими нативными мезенхимальными клетками, являющимися партнерами по стадии дифференцировки (англиобластами и/или предшественниками клеток эндотелия или звездчатых клеток). В случае зрелых эпителиальных клеток подходящие партнеры включают в себя мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), которые состоят из ангиобластов и/или предшественников звездчатых клеток и эндотелиальных клеток. Авторы данной заявки показали, что для достижения пересадки можно применять препараты мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в комбинации со зрелыми клетками. В некоторых воплощениях определенные MSC могут быть более предпочтительными, чем другие. Не ограничиваясь теорией, считаем, что трансплантаты могут быть оптимизированы путем выбора комбинаций клеток, которые требуют минимального, если вообще требуют, культивирование клеток, и это позволит избежать компонентов сыворотки и матрикса, которые могли бы активировать дифференцировку клеток. Не ограничиваясь теорией, также понятно, что эпителиально-мезенхимальная связь является важной, поскольку паракринная передача сигналов поддерживает образование MMP. В то же время зрелые эпителиальные клетки, объединенные со зрелыми клетками эндотелия, будут выживать в трансплантате и будут представлять собой функциональные клетки, однако не будут трансплантироваться. Таким образом, если зрелые эпителиальные клетки объединяют со зрелой стромой для образования трансплантата, то образующиеся в результате трансплантаты, вероятно, становятся фиброзными.

В случае лечения пораженного или дисфункционального органа, клетки могут происходить от донора, отличного от реципиента (аллотрансплантаты), или могут также представлять собой аутологичные трансплантаты и, таким образом, происходить от субъекта, имеющего внутренний орган в пораженном или дисфункциональном состоянии, где необязательно их получают из части внутреннего органа, который не является пораженным или дисфункциональным, и/или клетки которого были генетически модифицированы для восстановления функции.

Для определения модельной системы для изучения заболевания клетки могут представлять собой клетки, у которых имеется заболевание, и которые трансплантируют на/в нормальную ткань в экспериментальном хозяине.

В некоторых воплощениях эпителиальные клетки могут представлять собой стволовые клетки, объединенные с вспомогательными мезенхимальными клетками, необязательно ELSMC, для образования органоидов, которые необязательно самособираются. Эти органоиды могут быть включены в гиалуронановый гидрогель или содержаться в нем. Стволовые клетки и/или клетки-предшественники по настоящему изобретению могут предусматривать любую стволовую клетку и/или клетку-предшественника, известную из уровня техники, в том числе, например, эмбриональную стволовую клетку (ESC), эмбриональную зародышевую клетку (EGC), индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPSC), стволовую клетку поджелудочной железы (PSC), печеночную стволовую клетку (HpSC), стволовую клетку желчных протоков (BTSC), гепатобласт, предшественник протоков поджелудочной железы, коммитированную клетку-предшественника поджелудочной железы или коммитированную печеночную клетку-предшественника. В некоторых воплощениях клеточные популяции содержат только стволовые клетки, такие как стволовые клетки поджелудочной железы, печеночные стволовые клетки, стволовые клетки желчных протоков (BTSC) или стволовые клетки бруннеровых желез. В других воплощениях клетки предусматривают только субпопуляции мультипотентных предшественников, таких как гепатобласты или клетки-предшественники протоков поджелудочной железы, или трансплантат может содержать коммитированные унипотентные предшественники (например, гепатоцитарные, или билиарные, или островковые, или ацинарные коммитированные клетки-предшественники). В других воплощениях клетки содержат смесь стволовых клеток и предшественников.

Если используют зрелые эпителиальные клетки, то их можно смешивать в соответствующих отношениях с ELSMC в трансплантируемых биоматериалах. Отношения клеточной смеси могут быть определены таким образом, чтобы имитировать целевую ткань. В качестве альтернативы или в качестве дополнения отношения могут быть определены путем самосборки органоидов. Органоиды или клеточные смеси включены в мягкие трансплантируемые биоматериалы, такие как мягкий гиалуронановый гидрогель. При применении трансплантата стволовых клеток стволовые клетки и/или клетки-предшественники по настоящему изобретению могут предусматривать любую стволовую клетку и/или клетку-предшественника, известные из уровня техники, в том числе, например, эмбриональную стволовую клетку (ESC), эмбриональную зародышевую клетку (EGC), индуцированную плюрипотентную клетку (iPSC), стволовые клетки бруннеровых желез (BGSC), стволовую клетку желчных протоков (BTSC), стволовую клетку поджелудочной железы (PSC), печеночную стволовую клетку (HpSC), переходные амплифицированные клетки (например, гепатобласты или предшественники протоков поджелудочной железы) и коммитированные унипотентные предшественники (например, коммитированные предшественники поджелудочной железы, или гепатоцитарный, или холангиоцитарный предшественник). В некоторых воплощениях клеточные популяции содержат только стволовые клетки. В других воплощениях клетки содержат только субпопуляции предшественников. В других воплощениях клетки содержат смесь стволовых клеток и предшественников или смесь стволовых клеток/клеток-предшественников и более зрелых клеток. В других случаях воплощений может существовать химерная смесь взрослых клеток (например, гепатоцитов, холангиоцитов, энтероцитов, островковых клеток) и ELSMC.

Стволовые клетки и/или клетки-предшественники могут быть определены с помощью любого способа, известного специалисту в данной области. Неограничивающие примеры включают применение комбинации анализов, определяющих способность к самовоспроизведению, и анализов, демонстрирующих мультипотентность с помощью морфологического анализа, с помощью экспрессии генов и/или белков, маркеров клеточной поверхности и т.п. В некоторых воплощениях стволовые клетки и/или клетки-предшественники экспрессируют по меньшей мере один маркер, указывающий на линию дифференцировки клеток печени на ранней стадии (например, SOX 17, HNF-4-альфа, HNF6, HES1, CK19), и по меньшей мере один маркер, указывающий на линии дифференцировки клеток поджелудочной железы на ранней стадии (например, PDX1, PROX1, NGN3, HNFβ1). Например, стволовые клетки и/или клетки-предшественники, в частности BTSC, могут быть определены с помощью экспрессии SOX9, SOX17, PDX1, CD133, NCAM, звукового ежа (SHH), натрий-йодидного симпортера (NIS), LGR5, LGR6, EpCAM, различных изоформ CD44, CXCR4 и различных генов плюрипотентности (например, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, KLF5, SALL4, BMi-1) или любой их комбинации.

В некоторых воплощениях стволовые клетки и/или клетки-предшественники экспрессируют по меньшей мере один маркер, указывающий на линии дифференцировки исходных клеток на ранней стадии, таких как линии дифференцировки исходных клеток для печени и поджелудочной железы. Таким образом, они будут экспрессировать маркер(-ы), общий(-е) как для линии дифференцировки печеночных клеток, так и для линии дифференцировки клеток поджелудочной железы (например, SOX9, LGR5/LGR6, EpCAM, CD133, CK19), и маркер(-ы) для линий дифференцировки печеночных клеток (например, SOX 17, HNF-4-альфа, HNF6, HES1), и маркер(-ы) для линий дифференцировки клеток поджелудочной железы на ранней стадии (например, PDX1, PROX1, NGN3, HNFβ1). Например, стволовые клетки и/или клетки-предшественники, в частности BTSC, могут быть определены с помощью экспрессии SOX9, SOX17, PDX1, CD133, NCAM, звукового ежа (SHH), натрий-йодидного симпортера (NIS), LGR5, LGR6, EpCAM и различных генов плюрипотентности (например, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, KLF5, SALL4, BMi-1) или любой их комбинации.

Получение зрелых типов клеток

Стволовые клетки и/или клетки-предшественники также можно дифференцировать в более зрелый тип клеток, если такой тип требуется. Это можно выполнить in vitro с помощью спонтанной дифференцировки и/или с помощью направленной дифференцировки. Направленная дифференцировка может включать использование определенных сред, генетического модифицирования стволовых клеток и/или клеток-предшественников для экспрессии гена, представляющего интерес, или их комбинацию.

Неограничивающие примеры определенных сред для дифференцировки клеток включают гормонально определенные среды (HDM), используемые для дифференцировки эндодермальных стволовых клеток в направления дифференцировки зрелых клеток. К среде Кубота могут быть добавлены добавки для получения бессывороточной гормонально определенной среды (HDM), которая будет способствовать дифференцировке нормальных печеночных стволовых клеток или стволовых клеток желчных протоков в определенные направления дифференцировки зрелых клеток. Они предусматривают добавление кальция с достижением концентрации, составляющей 0,6 мM или выше, 1 нM трийодтиронина (T3), 10^-12 М меди, 10 нM гидрокортизона и 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Условия среды, в дополнение или свыше условий, необходимых для избирательного получения гепатоцитов (HDM-H), по сравнению с холангиоцитами (HDM-C) и по сравнению с островками поджелудочной железы (HDM-P), являются следующими.

1) HDM-H: дополнительное добавление 7 мкг/л глюкагона, 2 г/л галактозы, 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) и 20 нг/мл фактора роста гепатоцитов (HGF);

2) HDM-C: дополнительное добавление 20 нг/мл фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) и 10 нг/мл HGF; и

3) HDM-P: получение без глюкокортикоидов и дополнительное добавление 1% B27, 0,1 мM аскорбиновой кислоты, 0,25 мкM циклопамина, 1 мкM ретиноевой кислоты, 20 нг/мл FGF-7 в течение 4 дней, затем замена средой с добавлением 50 нг/мл эксендина-4 и 20 нг/мл HGF еще в течение 6 дней индукции.

HDM, предусмотренная в данном документе, может быть дополнена дополнительными факторами роста, в том числе без ограничения сигналами Wnt, эпидермальными факторами роста (EGF), факторами роста фибробластов (FGF), факторами роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобными факторами роста (IGF), трансформирующими факторами роста (TGF), факторами роста нервов (NGF), нейротрофическими факторами, различными интерлейкинами, факторами, подавляющими лейкоз (LIF), факторами роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), факторами роста тромбоцитов (PDGF), факторами роста стволовых клеток (SCF), колониестимулирующими факторами (CSF), GM-CSF, эритропоэтином, тромбопоэтином, гепаринсвязывающими факторами роста, IGF-связывающими белками и/или плацентарными факторами роста.

HDM, предусмотренная в данном документе, может быть дополнена цитокинами, в том числе без ограничения интерлейкинами, лимфокинами, монокинами, колониестимулирующими факторами, хемокинами, интерферонами и фактором некроза опухоли (TNF).

Авторы данной заявки показали, что гиалуронаны могут заставлять стволовые клетки и/или клетки-предшественники экспрессировать факторы, которые регулируют критически важные молекулы клеточной адгезии, необходимые для прикрепления клеток и межклеточных контактов и для предупреждения интернализации таких факторов прикрепления стволовыми клетками и/или клетками-предшественниками после получения препаратов клеточных суспензий, криоконсервации или при трансплантации. Неограничивающие примеры таких факторов прикрепления включают интегрины. Интегрины представляют собой большое семейство гетеродимерных трансмембранных гликопротеинов, которые выполняют функцию прикрепления клеток к белкам внеклеточного матрикса базальной мембраны, лигандам на других клетках и растворимым лигандам. Интегрины содержат большую и малую субъединицы, обозначаемые соответственно как α и β. Эти субъединицы образуют αβ гетеродимеры и по меньшей мере 18 α и восемь β субъединиц, которые известны у людей, приводя к образованию 24 гетеродимеров. В некоторых воплощениях стволовые клетки и/или клетки-предшественники экспрессируют более высокие уровни субъединиц интегрина, например, ITGα1, ITGα2, ITGα2B, ITGα3, ITGα4, ITGα5, ITGα6, ITGα7, ITGα8, ITGα9, ITGα10, ITGα11, ITGαD, ITGαE, ITGαL, ITGαM, ITGαV, ITGαX, ITGβ1, ITGβ2, ITGβ3, ITGβ4, ITGβ5, ITGβ6, ITGβ7 и ITGβ8. В одном предпочтительном воплощении стволовые клетки и/или клетки-предшественники экспрессируют более высокие уровни субъединицы интегрина бета 1 (ITGβ1) и/или субъединицы интегрина бета 4 (ITGβ4). Takada Y. et al. (2007) Genome Biol. 8(5): 215.

В некоторых воплощениях стволовые клетки и/или клетки-предшественники по настоящему изобретению отличаются от встречающихся в природе стволовых клеток и/или клеток-предшественников, по меньшей мере, тем, что они экспрессируют субъединицу интегрина в количестве, которое составляет по меньшей мере 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200% больше, чем количество субъединицы интегрина в немодифицированных стволовых клетках и/или клетках-предшественниках. Считается, что повышение количества субъединицы интегрина может способствовать тому, чтобы стволовые клетки и/или клетки-предшественники прикреплялись, образовывали межклеточные взаимодействия, а также тому, чтобы предупреждать интернализацию столовых клеток и/или клеток-предшественников, если требуется.

MMP

MMP представляют собой один из основных факторов, облегчающих пересадку и интеграцию. MMP состоят из многих изоформ (по меньшей мере 28; у свиней известны 24 изоформы), из которых некоторые секретируются (например, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9) и некоторые ассоциируются с плазматической мембраной (например, MMP14, MMP15). Не ограничиваясь теорией, считают, что их смесь требуется для пересадки, особенно смесь секретируемых форм. Все исследуемые клетки образуют различные количества как секретируемых, так и мембраноассоциированных форм, однако стволовые клетки/клетки-предшественники продуцируют очень высокие уровни секретируемых форм. Пересадка зависит от этих секретируемых MMP (и при этом существует некоторые известные виды синергии с мембраноассоциированными формами). Их клеточный источник представляет собой практический способ обеспечить необходимые MMP для достижения приживления. В качестве альтернативного подхода авторы данной заявки предусматривают включение очищенных/рекомбинантных форм MMP в биоматериалы для трансплантации и/или генетическую инженерию клеток в трансплантате для получения соответствующих MMP.

Клетки, которые успешно пересаживаются, при условии если они являются источниками, представляют собой идеальные клеточные источники многочисленных матриксных металлопротеиназ (MMP), необязательно одной или обеих секретируемых и мембраноассоциированных металлопротеиназ. MMP продуцируются всеми типами клеток, как незрелыми, так и зрелыми клетками, однако они могут варьировать в отношении того, какие изоформы образуются и при каком уровне экспрессии конкретных MMP. Иллюстративные секретируемые MMP включают MMP1, MMP2, MMP7 и MMP9. Иллюстративные мембраноассоциированные MMP включают MMP14 и MMP15. Эмпирически было обнаружено, что наиболее высокое продуцирование секретируемых MMP осуществляется клетками на ранней стадии дифференцировки, стволовыми клетками и предшественниками. Биоматериалы трансплантата обеспечивают способность как эпителиальных, так и мезенхимальных клеток продуцировать эти многочисленные формы матриксных металлопротеиназ (MMP), которые растворяют капсулы вокруг органов или тканей и обеспечивают возможность миграции клеток путем растворения многочисленных форм компонентов внеклеточного матрикса.

В более общем плане матриксные металлопротеиназы (MMP) представляют собой большое семейство цинк-зависимых протеиназ, которые участвуют в разрушении и модулировании компонента внеклеточного матрикса и которые участвуют в имплантации, инвазии, ангиогенезе, васкуляризации и миграции в нормальных и патогенных процессах. Существует по меньшей мере 28 изоформ, которые включают матриксины, адамализины, астацины, серрализины и т.д. Их роль была описана в нормальных процессах, таких как имплантация плаценты, а также в патогенных процессах, таких как инвазия и метастазирование различных форм рака.

Исследования, описанные в данном документе, представляют доказательство полностью новых функций MMP, которые способствуют пересадке, миграции и интеграции трансплантированных клеток. Стволовые клетки/клетки-предшественники, как эпителиальные, так и мезенхимальные клетки, экспрессируют многочисленные изоформы MMP, которые являются особенно активными при этих функциях. Созревание клеток приводит в результате к ингибированию экспрессии одной или более из активных MMP, ассоциированных со стволовыми клетками/клетками-предшественниками, и, таким образом, уменьшению процессов инвазии и миграции. Зрелые клетки также экспрессируют MMP, главным образом MMP, которые являются мембраносвязанными (MT-MMP), при этом указанные MMP участвуют в процессах пластичности, но не полностью в пересадке и интеграции клеток в ткани. В то же время существует некоторые виды синергии между MT-MMP и секретируемыми формами. Конечная цель этого практического осуществления заключается в том, что биоматериалы для трансплантации, подложка и другие условия должны быть такими, чтобы, среди прочих характеристик, оптимизировать экспрессию различных MMP, таких как секретируемые MMP, обеспечивая осуществление способов пересадки и миграции. Таким образом, факторы, активирующие дифференцировку трансплантированных клеток, будут, наряду с этим, подавлять сложные ответы MMP. Это практическое осуществление означает, что факторы, подлежащие устранению, включают сыворотку (которая активирует дифференцировку), растворимые сигналы, которые активируют дифференцировку (например, определенные факторы роста, цитокины и гормоны); компоненты внеклеточного матрикса, которые активируют дифференцировку (например, коллагены, адгезивные молекулы, высокосульфатированные гликозаминогликаны/протеогликаны); и механические воздействия, которые способствуют жесткости (свойства вязкоупругости, которые активируют дифференцировку) трансплантата.

В некоторых воплощениях одна или более из клеток в смеси представляют собой источник секретируемых и/или мембраноассоциированных MMP. Секретируемые MMP могут необязательно продуцироваться естественным путем одной или более из эпителиальных или мезенхимальных клеток или необязательно образовываться вследствие трансформации одной или более из эпителиальных или мезенхимальных клеток с помощью рекомбинантного вектора экспрессии или геномного редактирования для продуцирования MMP. В некоторых воплощениях вариантах осуществления, таких как без ограничения те, которые предусматривают популяции стволовых клеток/клеток-предшественников, которые естественным путем секретируют MMP, переменные, которые подавляют экспрессию MMP, необязательно экспрессию мембраноассоциированных и/или секретируемых MMP, контролируются в трансплантате в виде заплаты. Неограничивающие примеры таких переменных включают переменные, которые приводят к созреванию стволовых клеток/клеток-предшественников, такие как без ограничения добавление сыворотки к средам или к биоматериалам для трансплантации, гормоны или другие растворимые сигналы, которые влияют на дифференцировку эпителиальных и/или мезенхимальных клеток, уровни кислорода (поскольку анаэробные условия поддерживают клетки незрелыми, в то время как высокие уровни кислорода способствуют дифференцировке), и жесткость материалов для трансплантации (поскольку жесткость или механические воздействия, такие как сдвиговые и сжимающие воздействия, могут активировать дифференцировку).

В случае трансплантатов на основе таких стволовых клеток как эпителиальные клетки, так и их мезенхимальные клетки-партнеры оптимально представляют собой стволовые клетки или предшественники, поскольку оба вида содействуют образованию многочисленных типов MMP. Для пересадки зрелых клеток одна из эпителиальных или мезенхимальных клеток должна оптимально обеспечивать клеточный источник мембраноассоциированных и/или секретируемых MMP, например, необязательно с помощью ELSMC в качестве клеточного источника мембраноассоциированных и/или секретируемых MMP. Таким образом, трансплантаты, в которых как клетки эпителия, так и мезенхимальные клетки представляют собой зрелые типы клеток, не являются эффективными для пересадки. Если зрелыми являются клетки эндотелия, то эпителиальные клетки, вероятно, выживают и пролиферируют и функционируют, но не приживаются; в случае зрелой трансплантаты могут стать фиброзными.

Подводя итог, пересадка будет происходить, если обе эпителиально-мезенхимальные клетки-партнеры представляют собой стволовые клетки/клетки-предшественники, или если по меньшей мере одна из эпителиальных или мезенхимальных клеток представляет собой столовые клетки, например, необязательно с использованием ELSMC в качестве источника ассоциированных с матриксом и/или секретируемых изоформ матриксных металлопротеиназ (MMP), или если очищенные/рекомбинантные формы таких MMP предусмотрены в биоматериалах для трансплантации. Мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), подходящие для трансплантатов в виде заплаты, могут представлять собой ангиобласты, предшественники клеток эндотелия, клетки эндотелия на ранней стадии дифференцировки, предшественники звездчатых клеток, звездчатые клетки на ранней стадии дифференцировки, или мезенхимальные стволовые клетки (MSC), или их смеси.

Таким образом, в данном документе предусмотрена композиция для применения в качестве трансплантата в виде заплаты, содержащего по меньшей мере популяцию клеток (например, эпителиальные и мезенхимальные клетки) и источник MMP (т.е. популяцию клеток на ранней стадии дифференцировки, при которой она способна экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), необязательно поддерживаемые условиями среды и/или гидрогеля.

Компоненты среды

Для применения в комбинации с клетками и источником MMP, раскрытыми в данном документе, можно использовать любую среду (содержащую питательные вещества, витамины, соли и т.д.) совместно с критически важными растворимыми факторами, такими как инсулин, трансферрин/Fe и липиды, которая, как обнаружено, является пригодной для экспансии и/или выживания стволовых клеток/клеток-предшественников. Необходимо избегать всех факторов, которые вызывают созревание клеток, поскольку созревание будет приводить к снижению или подавлению экспрессии MMP. Факторы, которые необходимо избегать, включают сыворотку, растворимые сигналы, которые активируют дифференцировку, компоненты внеклеточного матрикса, которые активируют дифференцировку, и жесткость или механические воздействия (сжатие, истирание). Неограничивающим примером таких сред является среда Кубота.

Таким образом, в данном документе предусмотрена композиция для применения в качестве трансплантата в виде заплаты, содержащего по меньшей мере популяцию клеток и источник MMP (например, популяцию клеток на ранней стадии дифференцировки, при которой она способна экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), поддерживаемые в подходящей среде, или очищенные MMP). Неограничивающим примером подходящей среды является среда Кубота. Другие среды для стволовых клеток, такие как среды, используемые для эмбриональных стволовых (ES) клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, могут быть подходящими аналогичным образом, при условии, что они не содержат матриксных сигналов, которые будут активировать дифференцировку клеток, которые представляют собой источник MMP, или при условии, что MMP присутствуют или включены из других источников.

Гидрогель

Трансплантат в виде заплаты содержит один или более компонентов гидрогеля. В некоторых аспектах биоматериалы, которые могут образовывать гидрогели, или наряду с этим нерастворимый комплекс (например, не содержащий коллагена желатин), содержат гиалуронаны, тиол-модифицированные гиалуронаны, другие гликозаминогликаны (GAG) или их комбинации. Фактором, приводящим к затвердению, может быть любой фактор, вызывающий перекрестное сшивание компонентов матрикса или желатинизацию этих компонентов, которые могут превращаться в гель. Перекрестносшивающее средство может содержать поли(этиленгликолевый) (PEG) или PEG-диакрилатный (PEGDA) гидрогель или его дисульфидсодержащие производные. Примечательно, что биоматериалы, содержащиеся в гидрогеле, следует выбирать в связи со способностью обеспечивать стволовость в одной или более клеточных популяциях, раскрытых для применения в трансплантате в виде заплаты, например ELSMC.

Могут использоваться компоненты матрикса, поддерживающие стволовость, но не такие компоненты, которые активируют дифференцировку. Неограничивающие примеры поддерживающих компонентов включают гиалуронаны или несульфатированные (или минимально сульфатированные) гликозаминогликаны. Они являются особенно пригодными, поскольку их можно «настраивать», т.е. модифицировать для получения различных уровней жесткости (необязательно измеренной в виде вязкоупругости). Соответственно, в некоторых аспектах популяцию клеток, необязательно выделенных клеток внутреннего органа, можно привести к затвердению ex vivo в биоматериалах до введения клеток в организм хозяев, или в качестве альтернативы инъецировать в виде жидкого вещества и обеспечивать затвердение in vivo.

Самые мягкие версии (например, ~100 Па) гидрогелей являются идеальными для поддержания донорских клеток в незрелом состоянии). Более жесткие версии (например, > 500 Па) могут использоваться для того, чтобы вызвать достаточное созревание клеток для отключения образования MMP и блокирования тем самым миграции. Более жесткие версии могут также минимизировать проявления адгезии близлежащих тканей. В некоторых воплощениях популяцией клеток и источником MMP, необязательно, является другая популяция клеток (то есть популяция клеток на ранней стадии дифференцировки, при которой она способна экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP).

Не ограничиваясь теорией, считают, что формы внеклеточного матрикса, встречающиеся в амнионах, способны поддерживать донорские клетки незрелыми. Таким образом, амнионы предусмотрены как для применения в гидрогеле, так и необязательно в качестве альтернативного биосовместимого биоразлагаемого материала.

Примечательно, что материалы, которые, как известно, вызывают созревание, включают определенные компоненты, происходящие из зрелого внеклеточного матрикса, такие как без ограничения указанным, коллаген I типа. Эти материалы должны быть исключены из всех элементов трансплантата в виде заплаты, в том числе без ограничения клеток, гидрогеля, среды, подложки и/или любых дополнительных компонентов.

Таким образом, в данном документе предусмотрена композиция для применения в трансплантате в виде заплаты, содержащем по меньшей мере популяцию клеток и источник MMP (т.е. популяцию клеток на ранней стадии дифференцировки, при которой она способна экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), поддерживаемые в подходящей среде или содержащиеся в гидрогеле).

Как отмечено выше, жесткость может активировать способность клеток к дифференцировке. Другие жесткие гидрогели могут оказывать влияние на способность клеток мигрировать. Поскольку клетки должны мигрировать в орган, то гидрогель, в котором клетки содержатся, должен характеризоваться вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанных клеток, необязательно в пределах или за пределы гидрогеля и/или трансплантата в виде заплаты. Неограничивающие примеры такой вязкоупругости включают вязкоупругость, находящуюся в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 100 Па или приблизительно 250 Па, например, составляющую по меньшей мере приблизительно 50 Па, по меньшей мере приблизительно 100 Па, по меньшей мере приблизительно 150 Па, по меньшей мере приблизительно 200 Па, по большей мере приблизительно 250 Па, по большей мере приблизительно 200 Па, по большей мере приблизительно 150 Па, по большей мере приблизительно 100 Па и/или любое отдельное значение между ними, такое как без ограничения приблизительно 50 Па, приблизительно 100 Па, приблизительно 150 Па, приблизительно 200 Па или приблизительно 250 Па.

Не ограничиваясь теорией, считают, что в случае если клетки мигрируют из трансплантата в виде заплаты в целевой орган или ткань, - они мигрируют с некоторой частью гидрогеля, ассоциированного с ними или покрывающего их. Гидрогель защищает клетки от сигналов в тканевом микроокружении, которые будут влиять на дифференцировку или созревание клеток, и способствует сохранению клеток незрелыми. Это облегчает миграцию клеток через паренхимальную ткань. Поскольку гиалуронаны в гидрогеле постепенно разрушаются и удаляются, - клетки начинают дифференцироваться или созревать и начинают выполнять функции зрелых клеток.

Способы получения органоидов

Не ограничиваясь теорией, было определено, что клетки линии дифференцировки на ранней стадии могут характеризоваться высокой степенью эффективности трансплантата при включении в органоид или агрегат. Такой органоид может необязательно предусматривать ранние стадии дифференцировки как эпителиальных, так и мезенхимальных клеток.

Таким образом, в данном документе предусмотрен способ образования органоидов, при этом способ предусматривает, включает или по сути включает культивирование смеси эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток в контейнере, подходящем для культивирования тканей и в присутствии среды для культивирования, удаление зрелых клеток, которые прикрепляются к поверхности контейнера в результате пэннинга, и извлечение самособранных органоидов из суспензии клеток в средах для культивирования. Также в данном документе предусмотрена композиция, содержащая полученный таким образом органоид.

В некоторых воплощениях процедура включает пэннинг для исключения зрелых клеток с помощью избирательного быстрого (15-30 минут) прикрепления их к стандартным чашкам Петри для культивирования в бессывороточных условиях и при 37°C, поскольку даже при этих условиях зрелые клетки экспрессируют различные компоненты матрикса, которые способствуют прикреплению клеток. Многочисленные раунды (например, 4-5) такого способа пэннинга приводят к обогащению клеточной суспензии клетками на более ранней стадии дифференцировки. Затем клеточные суспензии переносят в чашки Петри со слабым прикреплением и снова в бессывороточной среде, разработанной для клеток на ранней стадии дифференцировки, и оставляют в течение ночи в инкубаторе при 37°C. Эти условия способствуют самосборке сопоставимых по стадии дифференцировки эпителиальных и мезенхимальных клеток в органоиды. Органоиды могут быть получены в результате смешивания ранних стадий клеток эпителия (клетки ES, клетки iPS, детерминированные стволовые клетки, переходные амплифицированные клетки, предшественники) с ранними стадиями мезенхимальных клеток (ангиобласты, предшественники клеток эндотелия, предшественники звездчатых клеток).

Смеси зрелых эпителиальных клеток со зрелыми мезенхимальными клетками и химерные смеси зрелых эпителиальных клеток с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC) обычно не приводят к образованию органоидов, но могут использоваться в качестве смесей клеток в суспензии в биоматериалах для трансплантации. Если зрелые клетки эпителия (например, гепатоциты, холангиоциты, островковые клетки, ациноциты, энтероциты и т.д.) объединяют со зрелыми мезенхимальными клетками (например, клетками эндотелия, звездчатыми клетками, стромальными клетками, миофибробластами), то смеси будут приводить в результате не к успешной интеграции трансплантатов в целевой участок или орган, а скорее к интеграциям, которые сохраняются на поверхности органов или тканей. Если используются химерные смеси, содержащие зрелые клетки и стволовые клетки/клетки-предшественники (например, зрелые гепатоциты с ангиобластами), то пересадка происходит, поскольку существует источник MMP, который способствует пересадке и миграции клеток.

В другом аспекте можно обеспечить затвердение выделенных клеток внутреннего органа ex vivo в биоматериалах до введения клеток в организм хозяев, или в качестве альтернативы инъецировать в виде жидкого вещества и обеспечить затвердение в трансплантате in vivo. Предпочтительно, клетки вводят в пораженную или дисфункциональную ткань или возле них, и могут вводиться посредством инъекции или пересадки на/в ткань или с использованием подходящего хирургического способа.

В другом аспекте биоматериалы, которые могут образовывать гидрогели, или наряду с этим нерастворимый комплекс, могут содержать гиалуронаны, тиол-модифицированные гиалуронаны или другие гликозаминогликаны (GAG). Фактором, приводящим к затвердению, может быть любой фактор, вызывающий перекрестное сшивание компонентов матрикса или желатинизацию этих компонентов, которые могут превращаться в гель. Перекрестносшивающее средство может содержать поли(этиленгликолевый) (PEG) или PEG-диакрилатный (PEGDA) гидрогель или его дисульфидсодержащие производные.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрены способы образования органоидов путем культивирования первого типа клеток (клетки эпителия) с одним или более типами клеток (мезенхимальные клетки), где второй тип клеток находится на зрелой стадии для того, чтобы быть соответствующим партнером по линии дифференцировки первого типа клеток. В некоторых воплощениях это может быть достигнуто путем удаления зрелых клеток, которые прикрепляются к чашкам для культивирования, с помощью пэннинга; переноса клеток, которые не прикрепились к чашкам для культивирования, со слабым прикреплением и в соответствующей среде и извлечения органоидов, которые самособираются, в этих условиях. Первый тип клеток может представлять собой эпителиальные стволовые клетки, коммитированные предшественники эпителиальных клеток или зрелые клетки (например, гепатоциты). Второй тип клеток может представлять собой стволовые клетки мезенхимальных линий дифференцировки (например, ангиобласты, мезенхимальные стволовые клетки), предшественники этих линий дифференцировки (например, предшественники эндотелиальных или звездчатых клеток) или смесь мезенхимальных клеток на ранней стадии дифференцировки. Важно, что такое образование не может происходить при всех условиях. Например, культивирование в Matrigel не приводит к образованию подходящих органоидов для успешного осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты. Несмотря на то, что полученные в Matrigel органоиды должны пересаживаться, степень пересадки будет снижена по сравнению с органоидами, полученными в определенных условиях. Более того, Matrigel не может представлять собой компонент условий, которые могут применяться для клинических продуктов.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ пересадки клеток в орган, предусматривающий приведение в контакт трансплантата в виде заплаты, содержащего несколько слоев, в том числе биосовместимую биоразлагаемую подложку, которая является нейтральной по отношению к эффектам в отношении дифференцировки донорских клеток; второй слой, содержащий один или более биоматериалов, таких как гиалуронаны, которые могут затвердевать, например в гидрогеле; смесь эпителиальных клеток и вспомогательных мезенхимальных клеток, которые включены в затвердевший биоматериал; и эту подобную лейкопластырю структуру, прикрепляемую к целевому участку с помощью швов или хирургического клея. На серозную поверхность подложки добавляют слой из затвердевших биоматериалов, полученный с тем, чтобы достичь уровня 400 Па или выше, по меньшей мере в два раза большего чем тот, который встречается в мягких биоматериалах, в которые включены донорские клетки. Клетки в трансплантате в виде заплаты способны пересаживаться и мигрировать в ткань/орган и по всей ткани/органу, а затем созревать до соответствующих направлений дифференцировки зрелых клеток, определяемых микроокружением, в котором они располагаются. Более высокие значения в паскалях биоматериалов, включенных или содержащихся в пористой подложке, приводят к блокаде миграции клеток в неверном направлении, и при их добавлении к серозной поверхности трансплантата проявления адгезии клеток из других органов и тканей минимизируются.

Органоиды

В соответствии с одним воплощением, раскрытым в данном документе, органоиды, плавающие агрегаты стволовых клеток желчных протоков (далее в данном документе «BTSC») и мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (далее в данном документе «ELMC») оказались наиболее эффективным способом включения в трансплантаты. В данном документе раскрыто, что BTSC и ELMC могут самостоятельно отбираться в органоиды с помощью пэннинга для устранения зрелых звездчатых/стромальных клеток, и это оказалось более эффективным и действенным в определении соответствующих эпителиально-мезенхимальных партнеров по стадии дифференцировки для трансплантатов. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ образования органоидов путем культивирования первого типа клеток со вторым типом клеток, где второй тип клеток представляет собой стадию соответствующего партнера по дифференцировке первого типа клеток, удаления зрелых клеток, которые прикрепляются к чашке для культивирования, с помощью пэннинга, и извлечения самособранных органоидов из суспензии культуры. Первый тип клеток может представлять собой эпителиальные стволовые клетки или коммитированные эпителиальные клетки. Второй тип клеток может представлять собой клетки мезенхимальной линии дифференцировки, мезенхимальные стволовые клетки или мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки. Дополнительные аспекты относятся к самособирающемуся органоиду и путям его применения.

В некоторых воплощениях донорские клетки, и/или вспомогательные мезенхимальные клетки экспрессируют матриксные металлопротеиназы (далее в данном документе MMP). Не ограничиваясь теорией, считают, что MMP способствуют слиянию донорских клеток и клеток-хозяев, а также растворению капсулы Глиссона (или эквивалентной капсулы вокруг ткани или органа). В настоящем изобретении в данном документе предусмотрено, что в некоторых воплощениях стволовые клетки на ранней стадии или ELMC экспрессируют высокие уровни MMP, в то время как зрелые гепатоциты экспрессируют низкие уровни MMP. В некоторых воплощениях объединение зрелых гепатоцитов со зрелыми синусоидальными клетками эндотелия (CD31+++, VEGF-рецептор+, коллаген IV типа+ и отрицательные в отношении CD117) и объединение в случае зрелых холангиоцитов, ассоциированных со зрелыми звездчатыми и стромальными клетками (ICAM-1+, ASMA+, витамин A++, коллаген I типа+), приводит в результате к образованию клеточных агрегатов, которые остаются на поверхности органа и не могут эффективно пересаживаться. В некоторых воплощениях при пересадке зрелых эпителиальных клеток требуется, чтобы их объединяли с незрелыми мезенхимальными клетками, которые продуцируют соответствующие MMP для пересадки и миграции.

В соответствии с одним вариантом осуществления, раскрытым в данном документе, органоиды, плавающие агрегаты из стволовых клеток/клеток-предшественников, таких как BTSC и ELSMC, оказались наиболее эффективной презентацией клеток для успешного результата при осуществлении пересадки трансплантата в виде заплаты. В данном документе раскрыто, что BTSC и ELSMC могут самостоятельно отбираться в органоиды с помощью устранения зрелых мезенхимальных клеток путем стандартных процедур пэннинга для клеток, которые прикрепляются к стандартным чашкам в бессывороточных условиях, с последующим культивированием оставшихся клеток (тех, которые не прикрепились) в чашках со слабым прикреплением и в определенной бессывороточной среде. В этих условиях органоиды самособираются.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ образования органоидов путем культивирования первого типа клеток, клеток эпителия, со вторым типом клеток, мезенхимальными клетками, где второй тип клеток представляет собой стадию соответствующего партнера по линии дифференцировки первого типа клеток, удаления зрелых клеток, которые прикрепляются к стандартным чашкам для культивирования, с помощью процедур пэннинга, и извлечения органоидов, которые самособираются, из суспензии культуры на чашках для культивирования, которые представляют собой чашки со слабым прикреплением. Первый тип клеток может представлять собой эпителиальные стволовые клетки, переходные амплифицированные клетки или коммитированные эпителиальные предшественники. Второй тип клеток может представлять собой стволовые клетки мезенхимальных линий дифференцировки, переходные амплифицированные клетки или коммитированные мезенхимальные предшественники.

В некоторых воплощениях и донорские клетки, и/или вспомогательные мезенхимальные клетки экспрессируют матриксные металлопротеиназы (далее в данном документе MMP). Не ограничиваясь теорией, считают, что MMP приводят в результате к растворению капсул вокруг тканей или органов и способствует слиянию донорских клеток и клеток-хозяев. В настоящем изобретении в данном документе предусмотрено, что в некоторых воплощениях стволовые клетки на ранней стадии или ELMC экспрессируют высокие уровни MMP, в то время как зрелые гепатоциты экспрессируют низкие уровни MMP. В некоторых воплощениях объединение зрелых гепатоцитов со зрелыми синусоидальными клетками эндотелия (CD31+++, VEGF-рецептор+, коллаген IV типа+ и отрицательный в отношении CD117) и объединение в случае зрелых холангиоцитов, ассоциированных со зрелыми звездчатыми и стромальными клетками (ICAM-1+, ASMA+, витамин A++, коллаген I типа+), приводит в результате к образованию клеточных агрегатов, которые остаются на поверхности органа и не могут эффективно пересаживаться. В некоторых воплощениях при пересадке зрелых эпителиальных клеток требуется, чтобы их объединяли с незрелыми мезенхимальными клетками, которые продуцируют соответствующие MMP для пересадки и миграции.

В соответствии с одним, раскрытым в данном документе, органоиды, плавающие агрегаты из стволовых клеток/клеток-предшественников, таких как BTSC и ELSMC, оказались наиболее эффективной презентацией клеток для успешного результата при осуществлении пересадки трансплантата в виде заплаты. В данном документе раскрыто, что BTSC и ELSMC могут самостоятельно отбираться в органоиды с помощью устранения зрелых мезенхимальных клеток путем стандартных процедур пэннинга для клеток, которые прикрепляются к стандартным чашкам в бессывороточных условиях, с последующим культивированием оставшихся клеток (тех, которые не прикрепились) в чашках со слабым прикреплением и в определенной бессывороточной среде. В этих условиях органоиды самособираются.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ образования органоидов путем культивирования первого типа клеток, клеток эпителия, со вторым типом клеток, мезенхимальными клетками, где второй тип клеток представляет собой стадию соответствующего партнера по линии дифференцировки первого типа клеток, удаления зрелых клеток, которые прикрепляются к обычным культуральным чашкам с помощью пэннинга, и путем извлечение органоидов, которые самоорганизуются из суспензии культуры на культуральных чашках с низким уровнем прикрепления. К первому типу клеток могут относиться эпителиальные стволовые клетки, транзитные амплифицируемые клетки, коммитированные эпителиальные предшественники. Второй тип клеток может быть стволовыми клетками мезенхимальных клеточных линий, транзитными амплифицирующими клетками или коммитированными мезенхимальными предшественниками.

В некоторых воплощениях для успешного результата при использовании стратегий осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты и донорские клетки, и/или вспомогательные мезенхимальные клетки должны экспрессировать множественные матриксные металлопротеиназы (далее в данном документе MMP) и особенно секретируемые формы MMP. Не ограничиваясь какой-либо теорией, считают, что многочисленные формы MMP способствует растворению капсулы вокруг органа или ткани с последующей быстрой миграцией донорских клеток в ткань хозяина. В настоящем изобретении в данном документе предусмотрено, что эпителиальные стволовые клетки на ранней стадии и/или ELSMC экспрессируют высокие уровни мембраноассоциированных и/или секретируемых MMP, в то время как зрелые клетки (например, гепатоциты) экспрессируют низкие уровни секретируемых MMP даже в тех случаях, если они экспрессируют MMP, ассоциированные с плазматической мембраной. Для пересадки таких зрелых клеток (например, гепатоцитов, холангиоцитов, островковых клеток, энтероцитов и т.д.) требуется, чтобы мезенхимальный партнер представлял собой клеточный источник MMP, в частности секретируемые формы MMP, если происходит пересадка. Альтернативой является получение соответствующих изоформ MMP, которые представляют собой их очищенные формы, в биоматериалах трансплантата.

В соответствии с настоящим изобретением количества клеток, которые можно пересадить с использованием трансплантата в виде заплаты, являются значительными (> 10⁸) и обусловлены размерами трансплантата, количеством и размером органоидов (или количеством клеток, если они не являются частью органоидов), вне зависимости от того, являются ли донорские клетки стволовыми клетками или зрелыми клетками, а также экспрессией секретируемых и мембраноассоциированных MMP (вне зависимости от того, происходят ли они из клеток эпителия и/или из мезенхимальных клеток). Эти результаты совершенно отличаются от ограниченных количеств клеток (например, 10⁵-10⁶), пригодных в случае доставки через сосуды или путем инъекции трансплантата.

В данном документе раскрыто, что получение трансплантатов предусматривает смешивание клеток с подходящими биоматериалами, которые могут стать нерастворимыми и поддерживать клетки, расположенные в целевом участке. В другом аспекте можно обеспечить затвердение выделенных клеток внутреннего органа ex vivo в биоматериалах до введения клеток в организм хозяев, или в качестве альтернативы инъецировать в виде жидкого вещества и обеспечить затвердение in vivo. В другом аспекте биоматериалы, которые могут образовывать гидрогели, или наряду с этим нерастворимый комплекс, могут содержать гиалуронаны или другие несульфатированные или минимально сульфатированные гликозаминогликаны, тиол-модифицированный гиалуронат натрия или материал растительного происхождения (например, альгинаты). Фактором, приводящим к затвердению, может быть любой фактор, вызывающий перекрестное сшивание компонентов матрикса или желатинизацию компонентов, которые могут превращаться в гель. Перекрестносшивающее средство может содержать полиэтиленгликольдиакрилат или его дисульфидсодержащее производное. Предпочтительно, нерастворимый комплекс клеток и биоматериалов характеризуется вязкоупругостью, находящейся в диапазоне от приблизительно 0,1 до 200 Па, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 Па, от приблизительно 1 до приблизительно 10 Па, приблизительно 10-100 Па или от приблизительно 100 до приблизительно 200.

Предпочтительно, клетки вводят в пораженную или дисфункциональную ткань или возле них, и могут вводиться с помощью инъекции или хирургической доставки. Не ограничиваясь теорией, в данном документе имеет место гипотеза, согласно которой более жесткие HA-гидрогели (например, > 500 Па) активируют дифференцировку клеток и снижают пересадку вследствие, отчасти, снижения экспрессии MMP при созревании и наряду со снижением способности мигрировать.

Подложка

Существуют многочисленные варианты биосовместимой биоразлагаемой подложки с нейтральным эффектом в отношении состояния созревания донорских клеток. Они включают формы шелка шелкопряда, такого как хирургический каркасный шелк Seri^R или контурный шелк Seri-Silk (Sofregen, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США), другие производные шелка шелкопряда, производные амниона, сальник, плаценту и синтетические ткани или материалы, такие как формы сополимера полигликолевой кислоты и L-молочной кислоты (PGA/PLLA). Критическим для эффективности подложки является то, что она характеризуется минимальными эффектами в отношении дифференцировки донорских клеток. Таким образом, многие формы подложек, используемые клинически, не являются пригодными для осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты, поскольку они состоят из компонентов (например, форм зрелых типов внеклеточного матрикса), которые индуцируют дифференцировку донорских клеток.

Подложка должна характеризоваться достаточной прочностью на растяжение для того, чтобы обеспечивать прикрепление трансплантата к целевому участку с помощью швов или с помощью хирургического клея. Она должна состоять из биосовместимого биоразлагаемого материала, который способен разрушаться в течение нескольких месяцев, но с продуктами разложения, которые не приводят к изменению состояния созревания донорских клеток. Таким образом, продукты должны оказывать минимальные эффекты в отношении pH или других аспектов окружающей среды. Подложка также должна быть способной соответствовать поверхности целевого участка; в связи с этим изгибающаяся подложка будет облегчать применение трансплантатов на участках значительной кривизны. Шелк Seri-Silk является неограничивающим примером подходящего материала для подложки. Альтернативный материал амниотического происхождения также предусмотрен в качестве подходящего материала для подложки, такой как без ограничения указанным, материал амниотического происхождения, выпускаемый Osiris Therapeutics, Inc (Колумбия, Мериленд, США).

Источником подложки может являться пористый каркас, такой как шелк Seri-Silk, или непористая мембрана, такая как амниотическая или плацентарная мембрана или сальник, или может представлять собой пористый или непористый синтетический текстиль, или их комбинацию. Если подложка является пористой, то она должна быть заполнена/пропитана биоматериалом для его герметизации, и тем самым подавления миграции указанной популяции клеток в направлении подложки, т.е. за пределы целевого участка, или через подложку. Определяющими свойствами материала подложки является биосовместимость, биоразлагаемость, нейтральность, как определено выше, и достаточная прочностью на растяжение, как описано выше. Кроме того, материал может необязательно быть биорассасываемым.

Подложку можно дополнительно оптимизировать, в зависимости от применения. Например, в некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты является пригодным для кожи и подлежащих дермальных тканей, если он содержит подложку, предназначенную для того, чтобы выдерживать эффект высыхания на воздухе.

Гидрогелевые матриксы, раскрытые в данном документе выше, также могут быть пригодными в других частях трансплантата в виде заплаты. Например, если биосовместимая биоразлагаемая подложка является пористой, то гидрогель может использоваться для подавления миграции указанной популяции клеток в направлении подложки. Такому гидрогелю потребуется более высокая вязкоупругость по сравнению с гидрогелем, например, от 1,5 до 15 раз больше, например в 2 раза больше. Неограничивающие примеры подходящей вязкоупругости включают без ограничения свойства вязкоупругости, находящиеся в диапазоне от приблизительно 250 до приблизительно 600 Па, например, составляющие по меньшей мере приблизительно 250 Па, по меньшей мере приблизительно 300 Па, по меньшей мере приблизительно 350 Па, по меньшей мере приблизительно 400 Па, по меньшей мере приблизительно 450 Па, по меньшей мере приблизительно 500 Па, по меньшей мере приблизительно 550 Па, по большей мере приблизительно 600 Па, по большей мере приблизительно 550 Па, по большей мере приблизительно 500 Па, по большей мере приблизительно 450 Па, по большей мере приблизительно 400 Па, по большей мере приблизительно 350 Па, по большей мере приблизительно 200 Па и/или любое отдельное значение между ними, такое как без ограничения приблизительно 250 Па, приблизительно 300 Па, приблизительно 350 Па, приблизительно 400 Па, приблизительно 450 Па, приблизительно 500 Па, приблизительно 550 Па и приблизительно 600 Па. Дополнительные неограничивающие примеры подходящей вязкоупругости включают вязкоупругость, находящуюся в диапазоне от приблизительно 600 до приблизительно 800 Па, например, составляющую по меньшей мере приблизительно 600 Па, по меньшей мере приблизительно 650 Па, по меньшей мере приблизительно 700 Па, по меньшей мере приблизительно 750 Па, по большей мере приблизительно 800 Па, по большей мере приблизительно 750 Па, по большей мере приблизительно 700 Па, по большей мере приблизительно 650 Па, по большей мере приблизительно 600 Па и/или любое отдельное значение между ними, такое как без ограничения приблизительно 600 Па, приблизительно 650 Па, приблизительно 700 Па, приблизительно 750 Па или приблизительно 800 Па. Еще одни неограничивающие примеры включают диапазон от приблизительно 250 Па до приблизительно 800 Па.

Еще одни гидрогели, раскрытые в данном документе, могут быть пригодными в качестве покрытия для предупреждения адгезии на серозной поверхности подложки, которая находится напротив стороны подложки, прилегающей к клеткам. Такой гидрогель мог бы характеризоваться вязкоупругостью, которая является подходящей для гидрогеля, в котором содержатся клетки и который является подходящим для герметизации подложки. Неограничивающие примеры подходящей вязкоупругости включают вязкоупругость, находящуюся в диапазоне от приблизительно 250 до приблизительно 400 Па или приблизительно 500 Па, например, составляющую по меньшей мере приблизительно 250 Па, по меньшей мере приблизительно 300 Па, по меньшей мере приблизительно 350 Па, по меньшей мере приблизительно 400 Па, по меньшей мере приблизительно 450 Па, по большей мере приблизительно 500 Па, по большей мере приблизительно 450 Па, по большей мере приблизительно 400 Па, по большей мере приблизительно 350 Па, по большей мере приблизительно 200 Па и/или любое отдельное значение между ними, такое как без ограничения приблизительно 250 Па, приблизительно 300 Па, приблизительно 350 Па, приблизительно 400 Па, приблизительно 450 Па или приблизительно 500 Па.

Трансплантаты в целом

В целом трансплантат в виде заплаты может быть сконструирован с применением вышеуказанных способов и компонентов для трансплантации донорских (аллогенных или аутологичных) клеток в солидный орган или ткань и в условиях, поддерживающих или сохраняющих донорские клетки на ранней стадии созревания. Более конкретно, предусмотрен трансплантат в виде заплаты, который является пригодным для трансплантации донорских клеток (аллогенных или аутологичных) в солидный орган или ткань в условиях, поддерживающих или сохраняющих некоторые или все из донорских клеток на ранней стадии созревания. В некоторых воплощениях донорские клетки представляют собой смесь эпителиальных и мезенхимальных клеток. В некоторых воплощениях обе популяции донорских клеток представляют собой стволовые клетки/клетки-предшественники. В некоторых воплощениях эпителиальные клетки представляют собой зрелые клетки (например, гепатоциты, островковые клетки и т.д.), и мезенхимальные клетки представляют собой стволовые клетки/клетки-предшественники. В некоторых воплощениях условия биоматериалов для трансплантации, например, среда и компоненты матрикса, способствуют сохранению обеих популяций донорских клеток и по меньшей мере популяции мезенхимальных клеток в виде стволовых клеток/клеток-предшественников. В некоторых воплощениях среда представляет собой базальную среду и растворимые сигналы. В дополнительных воплощениях эта базальная среда и растворимые сигналы способствуют поддержанию стволовости в обеих донорских популяциях или по меньшей мере в популяции мезенхимальных клеток. В некоторых воплощениях матрикс, необязательно содержащий компоненты внеклеточного матрикса, и его уровень жесткости способны поддерживать стволовость обеих донорских популяций или по меньшей мере популяции мезенхимальных клеток. В некоторых воплощениях матрикс содержит гиалуронаны, необязательно полученные в виде мягкого гидрогеля, характеризующегося вязкоупругостью, составляющей от приблизительно 50 Па до приблизительно 150 Па. В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты содержит подложку, которая характеризуется достаточной механической силой для того, чтобы обеспечивать связывание трансплантата с целевым участком, и состоит из биосовместимого биоразлагаемого материала, который значительно не изменяет стадию созревания донорских клеток. Необязательно, без дополнительных модификаций подложка должна быть сама по себе достаточной для защиты слоя, содержащего донорские клетки, значительно не влияя при этом на стадию созревания донорских клеток. В некоторых воплощениях подложка представляет собой сетку или каркас и дополнительно пропитана биоматериалом, таким как гиалуронан, характеризующимся вязкоупругостью, достаточно высокой для того, чтобы сделать любые клетки, мигрирующие в него, достаточно зрелыми для того, чтобы подавлять миграцию донорских клеток в направлении, отличном от направления к целевому участку. В некоторых воплощениях эта вязкоупругость составляет приблизительно 500 Па или больше. В некоторых воплощениях серологическую поверхность трансплантата покрывают биоматериалом для минимизации проявлений адгезии со стороны прилегающих тканей или органов. В некоторых воплощениях эти биоматериалы характеризуются вязкоупругостью, составляющей от приблизительно 200 Па до приблизительно 300 Па.

Предполагается, что предлагаемая подложка, обладающая достаточной упругостью, чтобы противостоять механическим воздействиям, способна связываться с целевым органом или тканью и характеризовалась достаточной гибкостью, чтобы связываться с участками с кривизной. Кроме того, любой биоматериал (отличный от гидрогеля) может применяться при условии, что биоматериал способен обеспечивать поддержание и сохранение клеточных популяций и характеризуется свойствами вязкоупругости, достаточными для обеспечения миграции клеточной популяции в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты.

В другом варианте осуществления трансплантат в виде заплаты является пригодным для сохранения и поддержания популяции клеток и содержит: (a) популяцию клеток (необязательно одного типа), поддерживаемую в среде в гидрогеле или другом биоматериале, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции клеток в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты; и (b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материл, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления (или обеспечения барьера против) миграции клеточной популяции в направлении подложки.

Важно отметить, что MMP могут представлять собой мембраноассоциированные и/или секретируемые MMP; они могут быть обеспечены клетками, продуцирующими MMP, происходить из таких клеток или они могут быть добавлены к композициям, представляющим интерес (например, очищенным или образованным рекомбинантным путем).

В другом воплощении предусмотрено нанесение покрытия или нанесение оболочки для трансплантата в виде заплаты или ткани, которые содержат гидрогель или другой биоматериал с достаточной вязкоупругостью и стойкостью, чтобы противостоять механическим воздействиям, прилагаемым против покрытия или оболочки, в том числе таким воздействиям, прилагаемым от других тканей и органов или ими. С помощью нанесения покрытия или нанесения оболочки предусмотрен способ подавления или предупреждения образования проявлений адгезии (которая может вовлекать механические воздействия или контакт с другими органами и тканями или происходить в результате их), при этом способ предусматривает нанесение покрытия или нанесение оболочки на поверхность с помощью гидрогеля или другого сопоставимого биоматериала.

В еще одном варианте осуществления предусмотрен способ пересадки клеток в целевую ткань, который включает приведение в контакт целевой ткани с трансплантатом в виде заплаты, содержащим (a) популяцию клеток, в том числе по меньшей мере одну популяцию, характеризующуюся ранней стадией дифференцировки, содержащую один тип или несколько типов клеток, поддерживаемых в среде в гидрогеле или другом биоматериале, характеризующихся реологическими свойствами (например, вязкоупругостью), достаточными для обеспечения миграции клеток популяции в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты; и (b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся реологическими свойствами (например, вязкоупругостью), достаточными для подавления (или обеспечения барьера против) миграции клеток из популяции в направлении указанной подложки, при этом трансплантат в виде заплаты выполнен с возможностью поддержания и сохранения указанной популяции клеток, подавляя при этом указанную по меньшей мере одну популяцию, характеризующуюся ранней стадией дифференцировки, от дифференцировки или дополнительного созревания до более поздней стадии дифференцировки. В дополнительном варианте осуществления предусмотрен способ, в котором одна популяция, характеризующаяся ранней стадией дифференцировки, способна экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP). В другом варианте осуществления клетки не характеризуются этой способностью, однако MMP присутствуют или включены из других источников (например, рекомбинантных).

Трансплантаты с клеточным источником MMP

Аспекты настоящего изобретения относятся к трансплантату в виде заплаты для поддержания и сохранения смешанной популяции клеток, содержащему: (a) смешанную популяцию, характеризующуюся двумя или более типами клеток, по меньшей мере один из которых находится на ранней стадии дифференцировки, которая способна экспрессировать секретируемые, и/или мембраноассоциированные матриксные металлопротеиназы, и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция, поддерживаемая в среде, присутствующей в гидрогелевом матриксе, характеризуется вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной клеточной популяции, необязательно в пределах или за пределы указанного гидрогеля и/или в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты; (b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции в направлении указанной подложки; и, необязательно, ((c) гидрогель, накладываемый на серозную (т.е. наружную) поверхность указанной подложки, которая находится напротив таковой при контакте с указанной смешанной популяцией, и в воплощениях в вариантах осуществления, в которых трансплантат в виде заплаты связан с целевым участком, находится напротив этой стороны при контакте с целевым участком (например, органом или тканью). В некоторых воплощениях указанный слой предупреждает или подавляет проявления адгезии другими тканями или органами или от них. В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты выполнен с возможностью поддержания и сохранения указанной смешанной популяции, при этом обеспечивается подавление дифференцировки или дальнейшего созревания указанного по меньшей мере одного типа клеток, находящегося на ранней стадии дифференцировки, до более поздней стадии дифференцировки, при которой он больше неспособен экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые MMP.

В некоторых воплощениях трансплантат должен содержать только один тип клеток, такой как эмбриональные стволовые (ES) клетки или индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки. Это может быть эффективным при условии, что эти клетки представляют собой клеточный источник MMP, или, в качестве альтернативы, к трансплантату добавляют другие источники, такие как очищенные (например, рекомбинантные) формы MMP.

В некоторых воплощениях указанная подложка является пористой или непористой. В некоторых воплощениях подложка содержит пористую и/или непористую сетку, каркас или мембрану. В некоторых воплощениях подложка содержит шелк; синтетическую ткань или природный материал, такой как амнион, плацента, или сальник, или их производные; или их комбинацию. В некоторых воплощениях указанная подложка содержит пористую сетку, заполненную гидрогелем или другим биоматериалом, используемым для превращения его в барьер. В дополнительных воплощениях такая инфузия приводит к предупреждению миграции клеток за пределы целевого органа или ткани. В некоторых воплощениях указанная подложка содержит твердый материал.

В некоторых воплощениях один или более из указанных гидрогелей содержат гиалуронаны.

В некоторых воплощениях указанная среда представляет собой среду Кубота или другую среду, поддерживающие стволовые клетки и способные сохранять стволовость.

В некоторых воплощениях указанная смешанная популяция содержит мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки. В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки могут быть эктодермальными, эндодермальными или мезодермальными. В некоторых воплощениях указанные мезенхимальные клетки предусматривают мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). В некоторых воплощениях указанные ELSMC представляют собой одно или более из ангиобластов, предшественников клеток эндотелия, предшественников звездчатых клеток и мезенхимальных стволовых клеток (MSC). В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки предусматривают эпителиальные стволовые клетки. В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки предусматривают стволовые клетки желчных протоков (BTSC). В некоторых воплощениях указанные стволовые клетки предусматривают коммитированные и/или зрелые стволовые клетки. В некоторых воплощениях указанные коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки предусматривают зрелые паренхимальные клетки. В некоторых воплощениях указанные зрелые паренхимальные клетки предусматривают одно или более из гепатоцитов, холангиоцитов и островковых клеток. В некоторых воплощениях указанные как мезенхимальные клетки, так и эпителиальные клетки предусматривают стволовые клетки.

В некоторых воплощениях указанная смешанная популяция содержит аутологичные и/или аллогенные клетки.

В некоторых воплощениях один или более типов клеток являются генетически модифицированными.

«Многослойные» трансплантаты

В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты подразумевается в виде многослойного трансплантата. Например, в данном документе предусмотрены трансплантаты в виде заплаты, содержащие несколько слоев, состоящие из них или по сути состоящие из них, включающие по меньшей мере (a) мягкий первый слой гидрогеля, содержащий донорские клетки, необязательно эпителиальные клетки и/или мезенхимальные клетки; (b) жесткий второй слой гидрогеля и (c) третий слой, содержащий биосовместимую биоразлагаемую подложку. В некоторых воплощениях вариантах осуществления, в частности в вариантах осуществления, в которых третий слой является пористым, второй слой включают, пропитывают и/или заполняют в третий слой. В некоторых воплощениях трансплантаты в виде заплаты дополнительно содержат четвертый слой гидрогеля. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты четвертый слой покрывают или наносят на серозную поверхность трансплантата. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты первый слой адаптируют к непосредственному контакту с целевой тканью или органом.

Используемый в данном документе термин «мягкий» относится к слою гидрогеля, который характеризуется низким уровнем внутреннего давления, определенного количественно с помощью анализов Паскалей (Па). Паскаль определяется как один ньютон на квадратный метр. В некоторых воплощениях мягкий слой характеризуется вязкостью, составляющей от приблизительно 10 Па до приблизительно 300 Па, от приблизительно 50 Па до приблизительно 250 Па, от приблизительно 100 Па до приблизительно 250 Па, от приблизительно 50 Па до приблизительно 200 Па, от приблизительно 150 Па до приблизительно 200 Па или от приблизительно 100 Па до приблизительно 200 Па. В конкретном варианте осуществления мягкий слой гидрогеля характеризуется вязкостью, которая составляет менее чем или приблизительно 200 Па.

Используемый в данном документе термин «жесткий» относится к слою гидрогеля, который характеризуется высоким уровнем внутреннего давления, определенного количественно с помощью анализов Паскалей (Па). В некоторых воплощениях жесткий слой характеризуется вязкостью, составляющей от приблизительно 300 Па до приблизительно 3000 Па, от приблизительно 300 Па до приблизительно 1000 Па, от приблизительно 400 Па до приблизительно 750 Па, от приблизительно 400 Па до приблизительно 550 Па, от приблизительно 450 Па до приблизительно 600 Па или от приблизительно 500 Па до приблизительно 600 Па. В конкретном варианте осуществления жесткий слой гидрогеля характеризуется вязкостью, которая составляет более чем или приблизительно 500 Па.

Предпочтительно, в случае первого слоя многослойного трансплантата нерастворимый комплекс клеток и биоматериалов характеризуются вязкостью или вязкоупругостью, находящимися в диапазоне от приблизительно 0,1 до 200 Па, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 Па, от приблизительно 1 до приблизительно 10 Па, от приблизительно 10 до 100 Па, или от приблизительно 100 до приблизительно 200 Па, или от приблизительно 50 до приблизительно 250 Па, или приблизительно 200 Па. Предпочтительно, в случае первого слоя многослойного трансплантата нерастворимый комплекс клеток и биоматериалов характеризуются вязкоупругостью, находящейся в диапазоне от приблизительно 0,1 до 200 Па, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 Па, от приблизительно 1 до приблизительно 10 Па, приблизительно 10-100 Па или от приблизительно 100 до приблизительно 200.

В некоторых воплощениях одна или более из клеток в смеси представляют собой источник секретируемых и/или мембраноассоциированных MMP. В некоторых воплощениях вариантах осуществления, таких как без ограничения те, которые предусматривают популяции стволовых клеток/клеток-предшественников, которые естественным путем секретируют MMP, переменные, которые подавляют экспрессию MMP, необязательно экспрессию секретируемых MMP, контролируются в трансплантате в виде заплаты. Неограничивающие примеры таких переменных включают переменные, которые приводят к созреванию стволовых клеток/клеток-предшественников, такие как без ограничения добавление сыворотки к средам или к биоматериалам для трансплантации, гормоны или другие растворимые сигналы, которые влияют на дифференцировку эпителиальных и/или мезенхимальных клеток, уровни кислорода (поскольку анаэробные условия поддерживают клетки незрелыми, в то время как высокие уровни кислорода способствуют дифференцировке), и жесткость материалов для трансплантации (поскольку механические воздействия, такие как сдвиговые и сжимающие воздействия, могут активировать дифференцировку).

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость первого слоя составляет от приблизительно 50 до приблизительно 250 Па. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость первого слоя составляет приблизительно 200 Па. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость второго слоя составляет от приблизительно 250 Па до приблизительно 600 Па. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость второго слоя составляет приблизительно 500 Па. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость четвертого слоя составляет от приблизительно 250 до приблизительно 500 Па. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость четвертого слоя составляет приблизительно 400 Па. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость второго слоя является большей, чем вязкость слоя 1. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость второго слоя от приблизительно 1,5 до приблизительно 15 раз больше, чем вязкость первого слоя. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты вязкость второго слоя воплощениях в приблизительно 2 раза больше, чем вязкость первого слоя.

В одном воплощении трансплантат в виде заплаты содержит слои, состоит из них или по сути состоит из них, начиная от слоя, находящегося в контакте с целевым участком и состоящего из донорских клеток, погруженных в мягкий (< 200 Па) гидрогель, приготовленный в бессывороточной определенной среде (эти клетки подлежат пересадке и миграции в ткань); второй слой гидрогеля, полученный в той же среде и имеющий повышенную жесткость (например, ~500 Па или выше), обеспечивающий барьер для миграции донорских клеток в любом направлении, отличном от направления к целевой ткани; третий слой, биосовместимая, биоразлагаемая, биорассасываемая подложка, которая является нейтральной по отношению к эффектам в отношении состояния созревания донорских клеток и может использоваться хирургически или посредством других путей для связывания трансплантата с целевым участком; и конечный слой гидрогеля, который является промежуточным по жесткости между мягким гидрогелем и очень жестким гидрогелем и достаточно жидким для того, чтобы быть нанесенным на поверхность или покрывать ее для минимизации проявлений адгезии со стороны близлежащих тканей.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты каждый из первого и второго слоев содержит один или более гиалуронанов. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты четвертый слой содержит один или более гиалуронанов.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки образуют один или более агрегатов. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты один или более агрегатов представляют собой органоид. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты эпителиальные клетки предусматривают эпителиальные стволовые клетки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты эпителиальные клетки предусматривают билиарные эпителиальные клетки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты эпителиальные клетки содержат коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки включают зрелые паренхимные клетки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты зрелые паренхимные клетки содержат один или более из гепатоцитов, холангиоцитов и островковых клеток.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты мезенхимальные клетки представляют собой вспомогательные мезенхимальные клетки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты мезенхимальные клетки содержат мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты ELSMC представляют собой одно или более из группы, состоящей из ангиобласта, предшественника клеток эндотелия, предшественника звездчатых клеток и мезенхимальных стволовых клеток (MSC).

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки не являются партнерами друг друга по стадии дифференцировки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты эпителиальные клетки представляют собой зрелые клетки. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты мезенхимальные клетки представляют собой ELSMC.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты по меньшей мере одно из эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток происходит от донора. В некоторых воплощениях донор представляет собой субъекта, нуждающегося в тканевом трансплантате. В некоторых воплощениях донор представляет собой источник здоровых клеток для воплощения тканевого трансплантата. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты по меньшей мере одно из эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток является аутологичным по отношению к предполагаемому реципиенту трансплантата в виде заплаты. В некоторых воплощениях все из клеток (т.е. эпителиальные и мезенхимальные) являются аутологичными по отношению к предполагаемому реципиенту трансплантата. В некоторых воплощениях донор клеток может представлять собой донора, отличного от реципиента (аллотрансплантат) или может также представлять собой субъекта (аутологичного), имеющего внутренний орган в пораженном или дисфункциональном состоянии, необязательно при этом их получают из части внутреннего органа, который не является пораженным или дисфункциональным, и/или клетки которого были генетически модифицированы для восстановления функции. С целью разработки модельной системы для изучения заболевания донорские клетки могут представлять собой клетки, у которых имеется заболевание, и которые трансплантируют на/в нормальную ткань в экспериментальном хозяине.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты по меньшей мере одно из эпителиальных клеток или мезенхимальных клеток является модифицированным. В некоторых воплощениях все из клеток модифицированы. В некоторых воплощениях модификация представляет собой генетическую модификацию. В некоторых воплощениях одну или более клеток модифицируют для экспрессии терапевтической нуклеиновой кислоты или полипептида. В некоторых воплощениях одну или более клеток модифицируют для экспрессии аллеля дикого типа нуклеиновой кислоты или полипептида.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты биосовместимая биоразлагаемая подложка является биорассасываемой. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты биосовместимая биоразлагаемая подложка содержит пористый материал. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты биосовместимая биоразлагаемая подложка содержит каркас или мембрану. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты каркас или мембрана содержит шелк, амнион, синтетическую ткань или их комбинацию. В некоторых воплощениях биосовместимая биоразлагаемая подложка не содержит какого-либо фактора, который индуцирует или предупреждает дифференцировку в клетках. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты биосовместимая биоразлагаемая подложка не содержит одного или более компонентов, происходящих из зрелого внеклеточного матрикса. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты компонент, происходящий из зрелого внеклеточного матрикса, представляет собой коллаген I типа.

В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты трансплантат в виде заплаты дополнительно содержит одну или более матриксных металлопротеиназ (MMP). В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты MMP представляет собой мембраноассоциированную MMP. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты мембраноассоциированная MMP образуется с помощью одного или более из эпителиальных клеток или мезенхимальных клеток. В некоторых воплощениях трансплантата в виде заплаты MMP представляет собой секретируемую MMP. Секретируемые MMP могут необязательно образовываться естественным путем с помощью одной или более из эпителиальных или мезенхимальных клеток или необязательно образовываться вследствие трансформации одной или более из эпителиальных или мезенхимальных клеток с помощью рекомбинантного вектора экспрессии для продуцирования MMP.

В некоторых аспектах в данном документе предусмотрен трансплантат в виде заплаты, содержащий несколько слоев, состоящий из них или по сути состоящий из таких слоев, включающих по меньшей мере мягкий первый слой гидрогеля, содержащий стволовые клетки желчных протоков; жесткий второй слой гидрогеля и третий слой, содержащий биосовместимую биоразлагаемую подложку.

В одном варианте осуществления трансплантат в виде заплаты состоит из слоев материалов и клеток, которые в совокупности образуют «подобный лейкопластырю трансплантат», который может быть связан хирургически или иным образом с целевым участком. Первый слой, расположенный напротив целевого участка, содержит мягкий гидрогель (при 200 Па), в который засевают смесь эпителиальных клеток и вспомогательных мезенхимальных клеток, суспендированных в определенной бессывороточной среде с богатым содержанием питательных веществ, разработанной для экспансии и/или выживания клеток; второй слой, содержащий гидрогель, полученный в той же среде, но желатинизированной до более жесткого уровня (т.е. более высоких уровней паскалей), и он образует барьер, блокирующий миграцию клеток в направлении, отличном от направления к целевым участкам; третий слой содержит биосовместимую биоразлагаемую подложку, которая не влияет или минимально влияет на уровень дифференцировки донорских клеток, однако выступает в качестве механической поддерживающей структуры для трансплантата; четвертый слой состоит из наносимого гидрогеля (опять-таки, такого как гиалуронаны), который характеризуется уровнем жесткости, промежуточным между уровнем мягкого гидрогеля по сравнению с жестким гидрогелем, и выполняет функцию минимизации проявлений адгезии к трансплантату со стороны клеток из близлежащих тканей. Гидрогели должны состоять из материала, который является биосовместимым, биоразлагаемым и «настраиваемым», что означает способность регулирования в отношении жесткости. Одним эффективным материалом для гидрогелей является тиол-модифицированный гиалуронан, который может быть активированным с образованием гидрогелей в случае воздействия кислорода и/или поли(этиленгликоль)диакрилата (PEGDA) и легко «настраиваемым» с помощью точных соотношений концентраций гиалуронана и PEGDA (и/или уровней кислорода).

В другом варианте осуществления трансплантат в виде заплаты содержит несколько слоев. Первый слой, расположенный напротив целевого участка, состоит из мягкого гидрогеля, который представляет собой минимально сульфатированный или несульфатированный GAG или другой несульфатированный или нейтральный биоматериал, который может желатинизироваться или затвердевать и на который помещают донорские клетки. Второй слой гидрогеля или биоматериала, который является более жестким, включают в/на подложку, биосовместимую, биоразлагаемую, биорассасываемую подложку или внутрь ее, что способствует тому, что трансплантат-заплату используют для хирургических или других целей, и он служит в качестве барьера, заставляющего клетки мигрировать в направлении целевой ткани. Серозную сторону подложки покрывают во время хирургического вмешательства биоматериалами, такими как гиалуронаны (или другие минимально сульфатированные или несульфатированные GAG или другие материалы, которые могут желатинизироваться или затвердевать), и в которых уровни в Паскалях, по меньшей мере два раза больше, чем уровни в Паскалях, обнаруженные в слое мягких биоматериалов; это служит цели минимизации проявлений адгезии со стороны близлежащих тканей. Трансплантат в виде заплаты связывают с целевым органом или тканью, и клетки способны мигрировать в ткань или орган и становятся полностью включенными.

В конкретном воплощении трансплантат в виде заплаты содержит первый слой мягкого биоматериала (< 200 Па), такого как мягкий гиалуронановый гидрогель, и в который помещены донорские клетки, подлежащие трансплантации в определенной бессывороточной среде, предназначенной специально для стадии дифференцировки клеток. Этот слой помещают поверх более жесткого слоя (например, более жесткого гидрогеля), который выступает в качестве барьера, заставляющего донорские клетки направляться при их миграции к целевой ткани. Более жесткий слой получают заранее на подложке, биосовместимой биоразлагаемой подложке, которая обеспечивает возможность применения заплаты для хирургических или других процедур, таким образом, чтобы связывать заплату с целевым участком. Конечный слой представляет собой биоматериал, который является промежуточным по жесткости по сравнению с тем, который используется для донорных клеток на стороне целевой ткани, и тем, который используется для барьера. Этот слой добавляют на серозную сторону трансплантата и во время хирургического вмешательства, и он функционирует для минимизации проявлений адгезии со стороны близлежащих тканей. Биосовместимая биоразлагаемая подложка может представлять собой шелк Seri-silk или его производное.

Способы применения и доставки трансплантатов в виде заплаты

Аспекты настоящего изобретения относятся к композициям и способам пересадки клеток в орган. При попытках, направленных на трансплантацию клеток из солидных органов во внутренние органы, обычно применяли либо непосредственную инъекцию, либо доставку клеток посредством сосудистого пути. Lanzoni, G. et al. Stem Cells 31, 2047-2060 (2013). Эти способы трансплантации приводят к небольшим количествам клеток, трансплантируемым в целевой участок, и к рискам эмбол, которые могут быть опасными для жизни. Трансплантация повышается, если клетки доставляют с помощью «инъекции трансплантата», при котором клетки суспендируют в гиалуронанах или покрывают ими, а затем инъецируют совместно с триггером (PEGDA), который вызывает желатинизацию гиалуронанов in situ, как описано в Turner R. et al. Hepatology 57, 775-784 (2013). Методики инъекции трансплантатов предусматривают стратегию размещения клеток в определенном участке, хотя и в небольших количествах, обычно 10⁵-10⁷, 10⁶-10⁷ или 10⁵-10⁶ клеток на участок инъекции. Эта стратегия устраняет или минимизирует эктопическое распределение клеток и оптимизирует интеграцию клеток в участке. Однако если используются зрелые функциональные клетки, то они могут быть высокоиммуногенными, что делает необходимым долговременную иммуносупрессию. Кроме того, количество клеток, которые можно инъецировать, может быть недостаточным для достижения соответствующих клинических результатов.

Эти препятствия и проблемы преодолеваются с помощью стратегий «осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты», описанных в данном документе. В некоторых воплощениях «подобные лейкопластырю» трансплантаты связывают хирургически или иным образом с поверхностью органа или ткани; условия трансплантата представляют собой такие, при которых клетки полностью пересаживаются в участок, мигрируют через орган/ткань, а затем созревают в соответствующие типы взрослых клеток. Возможность трансплантации больших количеств клеток (> 10⁸ клеток) создается или определяется с помощью размера заплаты, количества или смеси клеток в трансплантате и источника многочисленных форм MMP, в идеале клеточных источников MMP. Более того, в некоторых воплощениях применение органоидов облегчает способность накапливать донорские клетки, учитывая легкость, с помощью которой органоиды можно криоконсервировать в определенных бессывороточных условиях.

Композиция трансплантата в виде заплаты, предусмотренная в данном документе, относится к непосредственной трансплантации клеток в ткань или солидный орган. Способ является безопасным, предупреждает образование эмбол и эктопическое распределения клеток и оптимизирует пересадку и распределение количества клеток в ткань или по всей ткани.

Соответственно, в данном документе предусмотрены способы пересадки клеток в целевую ткань, предусматривающие, включающие или по сути включающие приведение в контакт целевой ткани с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше.

В некоторых воплощениях способов целевая ткань выбрана из группы, состоящей из ткани печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, желудочно-кишечного тракта, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, спинного мозга, кожи и подлежащих дермальных тканей, ткани матки, почки, мышцы, кровеносного сосуда, сердца, хряща, сухожилий и кости. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань печени. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань поджелудочной железы. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань желчных протоков. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань желудочно-кишечного тракта. В некоторых воплощениях ткань является патологической, поврежденной или имеет нарушение. В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой ткань почки.

В некоторых воплощениях способов целевая ткань представляет собой орган. В некоторых воплощениях способов орган представляет собой орган скелетно-мышечной системы, пищеварительной системы, дыхательной системы, мочевыделительной системы, женской репродуктивной системы, мужской репродуктивной системы, эндокринной системы, кровеносной системы, лимфатической системы, нервной системы или покровной системы. В некоторых воплощениях способов орган выбран из группы, состоящей из печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, желудочно-кишечного тракта, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, спинного мозга, кожи и подлежащих дермальных тканей, матки, почки, мышцы, кровеносного сосуда, сердца, хряща, сухожилия и кости. В некоторых воплощениях орган является патологическим, поврежденным или имеет нарушение.

Также в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением печени, при этом способы предусматривают, включают или по сути включают приведение в контакт печени субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях способов заболевание или нарушение печени представляет собой фиброз печени, цирроз печени, гематохроматоз, рак печени, атрезию желчных протоков, неалкогольную жировую болезнь печени, гепатит, вирусный гепатит, аутоиммунный гепатит, фасциолез, алкогольную болезнь печени, недостаточность альфа-1-антитрипсина, болезнь накопления гликогена II типа, наследственный амилоидоз, связанный с транстиретином, синдром Жильбера, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, синдром Бадда-Киари, повреждение печени или болезнь Вильсона.

В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением поджелудочной железы, при этом способы предусматривают, включают или по сути включают приведение в контакт поджелудочной железы субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях способов заболевание или нарушение поджелудочной железы представляет собой сахарный диабет, экзокринную недостаточность поджелудочной железы, панкреатит, рак поджелудочной железы, дисфункцию сфинктера Одди, кистозный фиброз, разделенную поджелудочную железу, кольцевидную поджелудочную железу, повреждение поджелудочной железы или кровотечение из протока поджелудочной железы.

В других аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением желудочно-кишечного тракта, при этом способ предусматривает, включает или по сути включает приведение в контакт одной или более из частей кишечника субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях заболевание или нарушение желудочно-кишечного тракта представляет собой гастроэнтерит, рак желудочно-кишечного тракта, илеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, пептическую язвенную болезнь, целиакию, фиброз, ангиодисплазию, болезнь Гиршпрунга, псевдомембранозный колит или повреждение желудочно-кишечного тракта.

В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта с заболеванием или нарушением почки, при этом способы предусматривают, включают или по сути включают приведение в контакт одной или более из почек субъекта с трансплантатом в виде заплаты, раскрытым в данном документе выше. В некоторых воплощениях способов заболевание или нарушение почки представляет собой нефрит, нефроз, нефритический синдром, нефротический синдром, хроническое заболевание почки, острую почечную недостаточность, повреждение почки, кистозную болезнь почки, поликистозное заболевание почки, гломерулонефрит, IgA-нефропатию, волчаночный нефрит, рак почки, синдром Альпорта, амилоидоз, синдром Гудпасчера или гранулематоз Вегенера.

В некоторых воплощениях терапевтических способов по меньшей мере одно из эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток происходит от донора. В некоторых воплощениях донор представляет собой субъекта, нуждающегося в тканевом трансплантате. В некоторых воплощениях донор представляет собой источник здоровых клеток для тканевого трансплантата. В некоторых воплощениях по меньшей мере одно из эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток является аутологичным по отношению к предполагаемому реципиенту трансплантата в виде заплаты. В некоторых воплощениях все из клеток (т.е. эпителиальные и мезенхимальные) являются аутологичными по отношению к предполагаемому реципиенту трансплантата. В некоторых воплощениях донор клеток может представлять собой донора, отличного от реципиента (аллотрансплантат), или может также представлять собой субъекта (аутологичного), имеющего внутренний орган в пораженном или дисфункциональном состоянии, где необязательно их получают из части внутреннего органа, который не является пораженным или дисфункциональным, и/или клетки которого были генетически модифицированы для восстановления функции.

В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты, применяемый в способах, раскрытых в данном документе выше, представляет собой трансплантат в виде заплаты, содержащий несколько слоев, включающих по меньшей мере первый слой гидрогеля, содержащий эпителиальные клетки и мезенхимальные клетки; второй слой гидрогеля; третий слой, содержащий биосовместимую биоразлагаемую подложку; и необязательно четвертый слой гидрогеля. В некоторых воплощениях способ дополнительно предусматривает обеспечение возможности включения в ткань клеток, содержащихся в трансплантате в виде заплаты. В некоторых воплощениях способов первый слой гидрогеля является мягким. В некоторых воплощениях способов второй слой гидрогеля является жестким. В некоторых воплощениях способов мезенхимальные клетки представляют собой вспомогательные мезенхимальные клетки.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ пересадки клеток в орган, предусматривающий применение трансплантата в виде заплаты, подобного лейкопластырю композита с несколькими слоями материалов и клеток, которые в совокупности могут быть связаны хирургически или иным образом с целевым участком. Первый слой, расположенный напротив целевого участка, содержит мягкий гидрогель (при 200 Па), в который засевают смесь эпителиальных клеток и вспомогательных мезенхимальных клеток, суспендированных в определенной бессывороточной среде с богатым содержанием питательных веществ, разработанной для экспансии и/или выживания клеток; второй слой, содержащий гидрогель, полученный в той же среде, но загущенный до более жесткого уровня (т.е. более высокого уровня значения в Паскалях) и он образует барьер, блокирующий миграцию клеток в направлении, отличном от направления к целевым участкам; третий слой содержит биосовместимую биоразлагаемую подложку, которая не влияет или минимально влияет на уровень дифференцировки донорских клеток, и таким образом является «нейтральным»; четвертый слой состоит из наносимого гидрогеля (опять-таки, такого как гиалуронаны), который характеризуется уровнем жесткости, промежуточным между мягким и жестким гидрогелем, и выполняет функцию минимизации проявлений адгезии к трансплантату со стороны клеток близлежащих тканей. Гидрогели должны состоять из материала, который является биосовместимым, биоразлагаемым и «настраиваемым», что означает способность регулирования в отношении жесткости. Одним эффективным материалом для гидрогелей является тиол-модифицированный гиалуронан, который может быть активированным с образованием гидрогелей в случае воздействия кислорода и/или поли(этиленгликоль)диакрилата (PEGDA) и легко «настраиваемым» с помощью точных соотношений концентраций гиалуронана и PEGDA (и/или уровней кислорода). Клетки в условиях биоматериалов трансплантата в виде заплаты продуцируют многочисленные матриксные металлопротеиназы (MMP), которые облегчают пересадку, миграцию и интеграцию донорских клеток в ткань реципиента. Микроокружение ткани реципиента обусловливает направление дифференцировки зрелых трансплантируемых клеток.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ пересадки клеток в орган, предусматривающий приведение в контакт трансплантата в виде заплаты, содержащего несколько слоев, включающих по меньшей мере первый слой, содержащий биосовместимую биоразлагаемую подложку, второй слой, содержащий один или более гиалуронанов, в том числе смесь эпителиальных клеток и вспомогательных мезенхимальных клеток, и третий слой, содержащий один или более гиалуронанов, при этом слой, в который включены клетки, является очень мягким (до 200 Па); слой, ассоциированный с подложкой, является более жестким (~500 Па или более); и третий слой является промежуточным по уровню паскалей и способствует минимизации проявлений адгезии со стороны близлежащих тканей и органов. В еще одном аспекте клетки могут быть пересажены в орган, выбранный из группы, состоящей из печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса кишечника, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, спинного мозга, нервных ганглиев, кожи и подлежащих дермальных тканей, матки, кости, тимуса, кишечника, матки, кости, почки, мышцы, кровеносных сосудов или сердца.

В еще одном аспекте клетки могут быть пересажены в орган, выбранный из группы, состоящей из печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, кишечника, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, спинного мозга, нервных ганглиев, кожи и подлежащих дермальных тканей, матки, кости, сухожилия, хрящевой ткани, почки, мышцы, кровеносных сосудов или сердца.

Неограничивающим примером трансплантата в виде заплаты, подходящего для способов, раскрытых в данном документе, является трансплантат в виде заплаты, содержащий: (a) смешанную популяцию, характеризующуюся двумя или более типами клеток, по меньшей мере один из которых находится на ранней стадии дифференцировки, которая способна экспрессировать секретируемые, и/или мембраноассоциированные матриксные металлопротеиназы, и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде, присутствующей в гидрогелевом матриксе, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной клеточной популяции, необязательно в пределах или за пределы указанного гидрогеля и/или в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты; (b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции или обеспечения барьера указанной смешанной клеточной популяции в направлении указанной подложки; и необязательно (c) гидрогель, накладываемый на серозную (т.е. наружную) поверхность указанной подложки, которая находится напротив таковой при контакте с указанной смешанной популяцией, и в воплощениях, где трансплантат в виде заплаты связан с целевым участком, находится напротив этой стороны при контакте с целевым участком (например, органом или тканью). В некоторых воплощениях указанный слой предупреждает или подавляет проявления адгезии с другими тканями или органами или от них. В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты выполнен с возможностью поддержания и сохранения указанной смешанной популяции, при этом обеспечивается подавление дифференцировки или дальнейшего созревания указанного по меньшей мере одного типа клеток, находящегося на ранней стадии дифференцировки, до более поздней стадии дифференцировки, при которой он больше неспособен экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые MMP.

В некоторых воплощениях указанная подложка является пористой или непористой. В некоторых воплощениях подложка содержит пористую сетку, каркас или мембрану. В некоторых воплощениях подложка содержит шелк; синтетическую ткань или природный материал, такой как амнион, плацента или сальник; или их комбинацию. В некоторых воплощениях указанная подложка содержит пористую сетку, заполненную гидрогелем. В воплощениях дополнительных воплощениях такая инфузия приводит к предупреждению миграции клеток за пределы целевого органа или ткани. В некоторых воплощениях указанная подложка содержит твердый материал.

В некоторых воплощениях трансплантат в виде заплаты содержит гидрогель, накладываемый на серозную поверхность указанной подложки, которая находится напротив подложки при контакте с указанной одной клеткой или смешанной клеточной популяцией.

В некоторых воплощениях один или более из указанных гидрогелей содержат гиалуронаны.

В некоторых воплощениях указанная среда представляет собой среду Кубота или другую среду, поддерживающие стволовые клетки и способные сохранять стволовость.

В некоторых воплощениях указанная смешанная популяция содержит мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки. В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки могут быть эктодермальными, эндодермальными или мезодермальными. В некоторых воплощениях указанные мезенхимальные клетки предусматривают мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). В некоторых воплощениях указанные ELSMC представляют собой одно или более из ангиобластов, предшественников клеток эндотелия, предшественников звездчатых клеток и мезенхимальных стволовых клеток (MSC). В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки предусматривают эпителиальные стволовые клетки/клетки-предшественники. В некоторых воплощениях указанные эпителиальные клетки предусматривают стволовые клетки желчных протоков (BTSC). В некоторых воплощениях указанные стволовые клетки предусматривают коммитированные и/или зрелые стволовые клетки. В некоторых воплощениях указанные коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки предусматривают зрелые паренхимальные клетки. В некоторых воплощениях указанные зрелые паренхимальные клетки предусматривают одно или более из гепатоцитов, холангиоцитов и островковых клеток. В некоторых воплощениях указанные как мезенхимальные клетки, так и эпителиальные клетки предусматривают стволовые клетки.

В некоторых воплощениях указанная смешанная популяция содержит аутологичные и/или аллогенные клетки.

В некоторых воплощениях один или более типов клеток являются генетически модифицированными.

Примеры

Следующие примеры являются неограничивающими и иллюстрируют процедуры, которые могут использоваться в различных случаях при осуществлении настоящего изобретения. Кроме того, все ссылки, раскрытые в данном документе ниже, включены посредством ссылки в их полном объеме.

ПРИМЕР 1. Свиная модель валидации трансплантата в виде заплаты

Животные

Животных, используемых в качестве хозяев или в качестве доноров клеток, содержали в вивариях при Колледже ветеринарной медицины при NCSU (Роли, Северная Каролина, США). Хирургические вмешательства, вскрытия и забор всех биологических жидкостей и тканей осуществляли в этих вивариях. Все процедуры одобрены комитетом IACUC при NCSU. Свиньи, подлежащие использованию в качестве реципиентов, представляли собой смесь из шести пород: шестикомпонентную породу, состоящую из пород йоркширская, большая белая, ландрас (от свиноматок), дюрок, пятнистая и пьетрен (от хряков). Этот высокогетерогенный генетический фон являлся предпочтительным, поскольку он соответствовал гетерогенным генетическим составляющим человеческих популяций. Животные-хозяева представляли собой самок в возрасте примерно шесть недель и ~15 кг.

Было две категории: a) самцы свиней в возрасте примерно шесть недель и ~15 кг, которых использовали в качестве доноров для трансплантации клеток в самок; b) трансгенные животные-доноры, несущие трансген GFP.GFP+ животных-доноров получали в результате скрещивания трансгенного хряка H2B-GFP с молодой свиньей дикого типа с помощью стандартной искусственной инсеминации. Модель разрабатывали посредством репарации, направляемой гомологией (HDR), опосредованной CRISPR-Cas9 IRES-pH2B-eGFP в эндогенный локус β-актина (ACTB). Трансгенные животные демонстрировали универсальную экспрессию pH2B-eGFP во всех тканях. Слияние GFP с H2B приводило в результате к локализации маркера GFP в нуклеосоме и обеспечивало четкую ядерную визуализацию, а также исследование хромосомной динамики. Линию основателя подробно анализировали и подтверждали универсальную и локализованную в ядре экспрессию. Кроме того, скрещивание характеризовалось передачей H2B-GFP следующему поколению. Все животные были здоровыми, и было установлено несколько случаев беременностей с потомством, демонстрирующим ожидаемое менделевское соотношение в случае передачи pH2B-eGFP. Потомков мужского пола генотипировали при рождении, и тех, которые были положительными в отношении трансгена, гуманным образом подвергали эвтаназии для забора тканей и выделения донорских клеток.

Для каждого животного-донора и животного-реципиента локусы свиного лейкоцитарного антигена класса I (SLA-I) и класса II (SLA-II) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров, разработанных для амплификации известных аллелей в этих областях на основе стратегии праймеров, специфических по отношению к последовательности ПЦР. Система состояла из 47 дифференциальных наборов праймеров SLA-I, амплифицирующих локусы SLA-1, SLA-2 и SLA-3 ⁵³, и 47 дифференциальных наборов праймеров SLA-II, амплифицирующих локусы DRB1, DQB1 и DQA. Эти наборы праймеров разрабатывали для аллелей по группам, которые имеют общие мотивы последовательностей, и при этом было показано, что они легко и однозначно позволяют выявить аллели SLA-I и SLA-II. При совместном применении эти наборы праймеров эффективно определяли гаплотип для каждого животного, которого исследовали, обеспечивая тем самым легкое подтверждение с помощью анализа совпадающего или несовпадающего генотипа у животных-доноров и животных-реципиентов.

Среды и растворы

Все среды стерилизовали фильтрованием (0,22 мкм фильтр) и до применения содержали в темноте при 4°C. Базальную среду и фетальную бычью сыворотку (FBS) приобретали у GIBCO/Invitrogen. Все факторы роста приобретали у R&D Systems. Все другие реагенты, кроме отмеченных, приобретали в Sigma.

Промывку для клеток составляли с использованием 599 мл базальной среды (например, RPMI 1640; Gibco № 11875-093) с добавлением 0,5 грамма сывороточного альбумина (Sigma, № A8896-5G, не содержащий жирных кислот), 10-9 M селена и 5 мл антибиотиков (Gibco № 35240-062, AAS). Ее использовали для промывки тканей и клеток во время обработки.

Получали коллагеназный буфер, состоящий из 100 мл раствора для промывки клеток с добавлением коллагеназы (Sigma № C5138) с конечной концентрацией 600 ЕД/мл (R1451 25 мг) для ткани желчных протоков (протоков) и 300 ЕД/мл (12,5 мг) для ткани органов (печени, поджелудочной железы).

Среду Кубота, определенную бессывороточную среду, разработанную для энтодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников, использовали для получения клеточных суспензий, органоидов и HA-гидрогелей. Эта среда состояла из базальной среды (в данном документе RPMI 1640), не содержащей меди, с низким содержанием кальция (0,3 мM), 1 нM селена, 0,1% альбумина бычьей сыворотки (очищенный, не содержащий жирных кислот; фракция V), 4,5 мM никотинамида, 0,1 нМ гептагидрата сульфата цинка, 5 мкг/мл трансферрина/Fe, 5 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл липопротеина высокой плотности и смеси очищенных свободных жирных кислот, которые присутствовали в комплексе с высокоочищенным альбумином, не содержащим жирных кислот. Ее получение подробно приведено в обзоре способов ⁵⁷. Кроме того, она коммерчески доступна от PhoenixSongs Biologicals (Бренфорд, Коннектикут, США).

Растворимые длинноцепочечные формы HA (Sigma Catalog № 52747) использовали при стабилизации культур органоидов и в криоконсервации. Формы, используемые для получения гидрогелей, тиол-модифицированных HA получали из Glycosan Biosciences - дочерней компании Biotime. Компоненты этих тиол-модифицированных HA получали с применением запатентованного способа бактериальной ферментации с использованием Вacillus subtilis в качестве хозяина в способе ISO 9001:2000 (www.biopolymer.novozymes.com/). Компоненты получали от Novozymes под торговой маркой HyaCare®, и они на 100% не содержали сырья животного происхождения и остатков органических растворителей. Никаких ингредиентов животного происхождения не использовали при получении, также были очень низкие уровни белка и отсутствовали эндотоксины. Получение соответствовало стандартам, установленным Европейской фармакопеей. HA-гидрогели получали с использованием Glycosil (HyStem® HAs, ESI BIO-CG313), тиол-модифицированных HA, которые можно активировать для образования дисульфидных мостиков с помощью полиэтиленгликольдиакрилата (PEGDA). Glycosil® разбавляли в виде 1% раствора тиолированного HA в 1% фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с использованием дегазированной воды или, в данном случае, - в среде Кубота. При разбавлении он остается жидким в течение нескольких часов, однако, может подвергаться гелеобразованию при воздействии кислорода. Более точное гелеобразование происходит при отсутствии изменений температуры или pH, если Glycosil обрабатывают перекрестносшивающим средством, таким как PEGDA, вызывающим гелеобразование в течение нескольких минут.

Уровень перекрестного сшивания обусловливает уровень жесткости и может быть точно определен с помощью соотношения тиол-модифицированных HA и PEGDA. В предыдущих исследованиях популяции стволовых клеток исследовали в HA-гидрогелях различной степени жесткости, и было обнаружено, что они сохраняются в виде стволовых клеток, как антигенно, так и функционально (например, в отношении способности мигрировать), только в тех случаях, если уровень жесткости составлял менее чем 200 Па²³. Авторы данного изобретения использовали данный результат для разработки трансплантатов с очень мягким слоем и с более жесткими слоями гиалуронановых гидрогелей на серозной стороне с образованием барьера для миграции в направлениях, отличных от целевой ткани, а также для минимизации проявлений адгезии со стороны клеток из близлежащих тканей. Определение характеристик 3 версий гидрогелей с различными уровнями жесткости приведены на фиг. 2, определения характеристик которых включали прямые измерения реологических свойств. Наиболее жесткий барьер, барьер, составляющий 10-кратный HA-гидрогель (жесткость = 760 Па), получали на подложке заранее и его можно было криоконсервировать, если требовалось. Во время хирургического вмешательства донорские клетки получали в мягком 1-кратном HA-гидрогеле (жесткость = 60 Па); помещали на более жесткий 10-кратный гидрогель (уже на подложке) и заплату связывали с целевым участком. После связывания серозную сторону трансплантата покрывали или обрабатывали 2-кратным HA-гидрогелем (жесткость = 106 Па) с использованием пластического шприца NORM-JECT 4010.200V0 с перманентно прикрепленной иглой для IV BD Micro-Fine™.

Макромасштабные реологические свойства гидрогелей определяли с использованием контролируемого напряжением вискозиметра с системой конус-плоскость (TA Instruments, AR-G2, диаметр конуса 40 мм, угол 1°). Гели активно полимеризовали на вискозиметре во время колебания при частоте 1 рад/с и амплитуде напряжения, составляющей 0,6 Па, при этом модуль контролировали непрерывно для проверки достаточности завершения реакции перекрестного сшивания. После уравновешивания гидрогели подвергали проверке частоты колебаний (амплитуда напряжения: 0,6 Па, диапазон частоты: 0,01-100 Гц). Свойства вязкоупругости (реологические) 3 версий гиалуронановых гидрогелей, которые использовались, представлены на фиг. 2.

Наиболее широко используемые донорские клетки получали от трансгенных свиней H2B-GFP, как описано выше. Они обеспечивали значительное преимущество для исследований трансплантации клеток в том, что все клетки мечены GFP. Использование флуоресцентных белков в качестве молекулярных меток давало возможность отслеживать донорские клетки в отношении их миграции и пересадки после трансплантации. Этот слитый белок целенаправленно воздействует на нуклеосомы, приводя к образованию ядерного/хроматинового сигнала GFP. В описанных трансплантатах стволовые клетки экспрессировали GFP полностью в ядре, однако линии дифференцировки, ограниченные зрелыми типами клеток, могут иметь его в цитоплазме или ядре. Следует обратить внимание, что уровень цитоплазматического GFP был особенно высоким в течение первой недели и со временем снижался. Это было связано с тем, что способ пересадки/инвазии/интеграции приводил в результате к эффектам в отношении клеток, которые вызывали обнаружение в цитоплазме H2B-связанного GFP. Это не означало, что клетки погибали, а скорее что они отвечали на высокие уровни MMP и ассоциированную передачу сигналов, которые представляли собой часть зон ремоделирования. Действительно, обнаруженные клетки GFP+ были отчетливо жизнеспособными и пролиферировали, при этом все они экспрессировали различные зрелые функциональные элементы (например, альбумин, HNF4a, AFP, инсулин, глюкагон или амилазу).

Как описано более подробно при определениях характеристиках трансплантатов, аутофлуоресценция как подложки (ярко-зеленый цвет), так и также липофусцинов (темный травянисто-зеленый цвет) в зрелых гепатоцитах представляла проблему, приводящую к перекрытию длин волн длинами волн GFP. В связи с этим, авторы данной заявки смещали сигнал GFP+ в розовый или пурпурно-красный цвет, используя антитело к GFP и вторичное антитело с красным флюоресцентным зондом. Это приводило к тому, что стволовые клетки распознавались в виде небольших клеток с розовыми ядрами (слияние окрашивания синего ядра с использованием DAPI со связанной с антителом GFP+ меткой светло-розового цвета). Любые донорские клетки, которые созревали в гепатоциты, распознавались, как имеющие лавандовый цвет от слияния с зеленой аутофлуоресценции (липофусцинов), синего (DAPI) и пурпурно-красного цвета (GFP) (фиг. 4).

Свиную ткань внепеченочных желчных протоков (желчный пузырь, общий проток, печеночные протоки) получали от трансгенных свиней. Ткани измельчали с помощью стерилизованного пестика из нержавеющей стали для удаления паренхимных клеток, осторожно сохраняя связь внутрипеченочных и внепеченочных желчных протоков. Затем желчные протоки промывали буфером на основе «промывки для клеток», состоящим из стерильной бессывороточной базальной среды, дополненной антибиотиками, 0,1% сывороточного альбумина и 1 нM селена (10^-9 M). Затем их разделяли механически с помощью скрещивающихся скальпелей, и агрегаты ферментативно диспергировали в клеточную суспензию в RPMI-1640, дополненной 0,1% альбумина бычьей сыворотки (BSA), 1 нM селена, 300 ЕД/мл коллагеназы IV типа, 0,3 мг/мл дезоксирибонуклеазы (ДНКаза) и антибиотиков. Расщепление осуществляли при 32°C с частым встряхиванием в течение 30-60 минут. Для большинства тканей требовалось два цикла расщепления с последующим центрифугированием при 1100 об/мин. при 4°C. Клеточные осадки объединяли и ресуспендировали в промывке для клеток. Клеточную суспензию центрифугировали при 30 G в течение 5 минут при 4°C с удалением эритроцитов. Клеточные осадки снова ресуспендировали в промывке для клеток, и фильтровали через 40 мкм нейлоновое клеточное сито (Becton Dickenson Falcon № 352340), и обрабатывали свежей промывкой для клеток. Определяли количества клеток и оценивали жизнеспособность с использованием трипанового синего. Регулярно наблюдали жизнеспособность клеток свыше 90-95%.

В предыдущих исследованиях авторы данной заявки определили антигенный профиль популяций мезенхимальных клеток, которые обеспечивают критически важные паракринные сигналы, необходимые для печеночных стволовых клеток и стволовых клеток желчных протоков по сравнению с другими сигналами, требуемыми для зрелых паренхимальных клеток. Мезенхимальные клетки, которые являлись партнерами BTSC, представляли собой субпопуляции, лишенные антигенов MHC, с низким боковым светорассеянием и определяемые как ангиобласты (CD117+, CD133+, VEGF-рецептор+ и отрицательные в отношении CD31), предшественники клеток эндотелия (CD133+, VEGF-рецептор+ и CD31+) и предшественники звездчатых клеток (CD146+, ICAM1+, VCAM+, альфа-гладкомышечный актин (ASMA+) и отрицательные в отношении витамина A). Эти 3 субпопуляции обозначаются в совокупности как мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). В отличие от этого, зрелые гепатоциты ассоциированы со зрелыми синусоидальными клетками эндотелия (CD31+++, коллаген IV типа+, VEGF-рецептор+ и отрицательные по CD117), и тоже самое прослеживается в отношении зрелых холангиоцитов, которые ассоциированы со зрелыми звездчатыми и стромальными клетками (ICAM-1+, ASMA+, витамин A++, коллаген I типа+).

Клеточные суспензии добавляли в многолуночные плоскодонные планшеты для культивирования клеток (Corning № 353043) в бессывороточной среде Кубота и инкубировали в течение ~одного часа при 37°C для облегчения прикрепления зрелых мезенхимальных клеток. Зрелые мезенхимальные клетки прикреплялись к чашкам в течение 10-15 минут, даже несмотря на то, что среда была бессывороточной. Клетки, оставшиеся в суспензии, переносили в другую чашку и снова инкубировали в течение часа. Повторения указанного приводили к уменьшению значительной доли зрелых мезенхимальных клеток. После уменьшения зрелых мезенхимальных клеток оставшиеся плавающие клетки высевали при ~2 X 10⁵ клеток на лунки в бессывороточной среде Кубота в чашках Corning со слабым прикреплением (Corning № 3471) и инкубировали в течение ночи при 37°C в инкубаторе CO2. Органоиды, состоящие из стволовых клеток желчных протоков (BTSC) и ELMSC, образовывались в течение ночи (фиг. 1). Эти культуры органоидов выживали в течение нескольких недель в среде Кубота, особенно если среду дополняли (0,1%) растворимыми формами HA (Sigma); их также могли криоконсервировать, как описано ниже. Из каждого грамма неонатальной ткани желчных протоков свиньи получали ~1,5 X 10⁷ клеток. Использовали ~3-6 X 10⁵ клеток на лунку 6-луночного планшета с ультранизкой адгезией и инкубировали в бессывороточной среде Кубота. Клетки продуцировали в среднем от 6000 до 20000 небольших органоидов (~50-100 клеток/органоид/лунка). Для трансплантатов использовали по меньшей мере 100000 органоидов (> 10⁷ клеток). В зависимости от размера подложки, авторы данной заявки могли повышать количество органоидов в трансплантатах до 10⁸ органоидов (т.е. ~10⁹ клеток) или больше, включенных в ~1 мл мягкого гиалуронанового гидрогеля на подложке размером 3 см X 4,5 см.

Выделенные органоиды из стволовых клеток криоконсервировали в CS10, изотоническом буфере для криоконсервации, содержащем средства против замораживания, декстран и DMSO (Bioliife, Сиэтл, Вашингтон, США; https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html). Жизнеспособность клеток дополнительно повышали при добавлении 0,1% HA (Sigma № 52747). Криоконсервацию осуществляли с использованием программируемых криозамораживателей CryoMed™. Жизнеспособность при размораживании составляла более чем 90%, и клетки после размораживания были способны прикрепляться, увеличиваться в объеме ex vivo и in vivo и образовывать предполагаемые зрелые клетки in vitro и in vivo.

Выделение клеток и сборка трансплантатов описаны схематически на фиг. 1, а детали представлены на фиг. 2. Трансплантаты получали с использованием подложки (таблица 1), на которую помещали органоиды из стволовых клеток, включенные в мягкие гиалуронановые гидрогели. Их легко получали заранее и поддерживали в чашке для культивирования в инкубаторе в течение ночи. Трансплантаты оказались стабильными в целевом участке в течение экспериментов. Криоконсервации органоидов достигали легко, однако криоконсервация не достигалась в случае помещения в мягкий гидрогель. Это означало, что включение органоидов в мягкий гидрогель необходимо было выполнять непосредственно перед хирургическим вмешательством.

Хирургические вмешательства

Анестезию индуцировали введением комбинации кетамин/ксилазин (каждый по 2-3 мг/кг веса), инъецируемой IV, или 20 мг/кг кетамина совместно с 2 мг/кг ксилазина IM, и поддерживали с помощью изофлурана в кислороде, вводимом через установку с замкнутым контуром для подачи анестезирующего газа.

Животных помещали в положении лежа на спине и вентральную часть живота зажимали от мечевидного отростка до лобковой кости. Кожу подготавливали асептически путем чередования йодированного скраба и спиртовых растворов. После вхождения в операционный блок подготовку кожи повторяли с применением стерильной методики и площадь покрывали наружным раствором йода перед нанесением стерильных хирургических салфеток. Хирурги применяли подходящую асептическую методику. В середине вентральной области выполняли надрез через кожу, через подкожные ткани и белую линию живота, начиная у мечевидного отростка и продолжая в каудальном направлении на расстояние 8-12 см. Открывали левый печеночный участок и наносили на вентральную поверхность печени трансплантат в виде заплаты размером 3 x 4,5 см, содержащий 1-кратном HA (~60 Па), с включенными органоидами на подложке, содержащей 10-кратный HA (~760 Па), и заплату помещали в непосредственный контакт с поверхностью капсулы печени. Трансплантат в виде заплаты пришивали к печени с использованием 4-6 простых прерывистых швов из 4-0 полипропилена. Открытую поверхность трансплантата затем обрабатывали 2 мл 2X гидрогеля НА (~ (~106 Па), уровень жесткости которого был достаточно близким к жидкому для обеспечения нанесения или покрытия на серозную сторону трансплантата; это было необходимо для дополнительной минимизации проявлений адгезии со стороны близлежащих тканей. После помещения хирургического трансплантата белую линию живота закрывали простым непрерывным швом с использованием 0-PDS. Белую линии блокировали с помощью 2 мг/кг 0,5% бупивакаина IM. Подкожные ткани и кожу закрывали непрерывными швами соответственно 2-0 PDS и 3-0 монокрила. Тканевый пластырь помещали на поверхность кожи.

Трансплантаты в виде заплаты от трансгенных свиней реципиентам были аллогенными и, таким образом, для них требовалась иммуносупрессия. Применяемые протоколы иммуносупрессии представляли собой протоколы, установленные другими авторами. Все свиньи получали пероральные дозы иммуносупрессорных препаратов такролимуса (0,5 мг/кг) и микофенолата (500 мг) дважды в день, начиная за 24 часа до хирургического вмешательства. Лекарственные препараты вводили непрерывно в течение всего экспериментального периода. Их легко можно было вводить животным, если смешивать с их излюбленными кормами.

Всех животных гуманным образом эвтанизировали в определенный момент времени с помощью седации кетамином/ксилазином и анестезии изофлураном с последующей внутривенной инъекцией летальной дозы пентобарбитала натрия. После подтверждения смерти тушу осторожно вскрывали, целевые органы удаляли и помещали в охлажденную среду Кубота для транспортирования в лабораторию. Кроме печени, извлекали легкие, сердце, почку и селезенку и фиксировали в 10% нейтральном формалине.

Определение характеристик трансплантатов

Через 48+ часов после фиксации образцы тканей помещали в меченые кассеты в 70% этанол и обрабатывали в течение длинного цикла при 60 градусах в гистопроцессоре Leica ASP300S в течение примерно 10 часов. После завершения обработки в течение ночи образцы включали с использованием устройства для включения Leica EG1160. Форму заливали воском и образец помещали в правильной ориентации таким образом, что можно было собрать требуемые срезы. Кассету охлаждали до тех пор, когда установку и образец ткани можно было удалить из формы в виде одного блока. Блок разрезали на срезы по 5 микрон с использованием микротома Leica RM2235; срезы помещали на плаву на водяную баню и наносили на микроскопические препараты. Перед окрашиванием микроскопические препараты высушивали на воздухе в течение ночи. Срезы окрашивали с использованием гемактоксилина и эозина (H&E; реагенты № 7211 и № 7111) или трихрома Массона (краситель трихром Массона: набор Blue Collagen № 87019), с использованием продуктов для гистологического анализа Richard Allan Scientific и в соответствии с рекомендуемым протоколом производителя; протокол программировали в Autostainer XL Leica.

Ткань включали и замораживали в OCT и мгновенно размораживали при -20°C для получения замороженных срезов. Замороженные срезы окрашивали для IHC в соответствии с вышеописанным протоколом. Для иммунофлуоресцентного анализа замороженные срезы размораживали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем фиксировали в 10% забуференном формальдегиде, ацетоне или метаноле в соответствии с описаниями антител. После фиксации срезы промывали 3 раза в 1% фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с последующим блокированием с помощью 2,5% лошадиной сыворотки в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела, разбавленные в 10% козьей сыворотке в PBS, добавляли и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующее утро срезы ополаскивали 3 раза с помощью PBS и инкубировали со вторичными антителами, разбавленными в 2,5% лошадиной сыворотке в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Изображения получали с использованием спектрального конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss CLSM 710 (Carl Zeiss Microscopy). Антитела приведены в таблице 3.

В случае изображений на фиг. 5, срезы (3 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином и сириусом красным в соответствии со стандартными протоколами. Для иммуногистохимического анализа активность эндогенной пероксидазы блокировали в результате 30 мин. инкубации в растворе перекиси водорода в метаноле (2,5%). Антигены извлекали, как указано поставщиком, путем нанесения протеиназы K (код S3020, Dako, Глоструп, Дания) в течение 10 мин. при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами (пан-цитокератин, Dako, код: Z0622, разбавление: 1:100; Sox9, Millipore, код: AB5535, разбавление: 1:200). Образцы ополаскивали дважды с помощью PBS в течение 5 мин., инкубировали в течение 20 мин. при комнатной температуре с вторичным биотинилированным антителом (LSAB+ System-HRP, код K0690; Dako, Глоструп, Дания), а затем со стрептавидин-HRP (LSAB+ System-HRP, код K0690, Dako, Глоструп, Дания). Диаминобензидин (Dako, Глоструп, Дания) использовали в качестве субстрата, и срезы контрастно окрашивали гематоксилином (PMID: 29248458). Для иммунофлуоресцентного анализа неспецифическое связывание белка блокировали с помощью 5% нормальной козьей сыворотки. Образцы инкубировали в течение ночи при 4°C с первичными антителами (антитело курицы к GFP, Abcam, код: ab13970, разбавление = 1:200; антитело кролика к HNF4α, Abcam, код: 92378, разбавление: 1:50, антитело кролика к альбумину, ab2406, разбавление = 1:500). Образцы промывали и инкубировали в течение 1 ч. с мечеными изотип-специфическими вторичными антителами (конъюгированным с AlexaFluor-546 антителом к антителу кролика, конъюгированным с Alexafluor-488 антителом к антителу мыши, конъюгированным с Alexafluor-488 антителом к антителу кролика, Invitrogen, Life Technologies Ltd, Пейсли, Великобритания) и контрастно окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации клеточных ядер (PMID: 26610370). Для всех иммунологических реакций также включали отрицательные контроли (первичное антитело замещали преиммунной сывороткой). Срезы исследовали кодированным образом с помощью светового и флуоресцентного микроскопа Leica Microsystems DM 4500 B (Leica Microsystems, Ветцлар, Германия), оснащенного видеокамерой Jenoptik Prog Res C10 Plus (Йена, Германия). Иммунофлуоресцентные пятна также анализировали с помощью конфокальной микроскопии (Leica TCS-SP2). Микроскопические препараты дополнительно обрабатывали с помощью системы для анализа изображений (IAS - Delta Sistemi, Рим, Италия) и независимо оценивали двумя исследователями слепым способом. Иммунофлуоресцентные пятна сканировали с помощью цифрового сканера (Aperio Scanscope FL System, Aperio Technologies, Inc, Оксфорд, Великобритания) и обрабатывали с помощью ImageScope.

Замороженные срезы вызывали сложности, учитывая высокую аутофлуоресценцию в гепатоцитах (липофусцин) и флуоресценцию подложки Seri-Silk. Заявители добились больших успехов, приготовив срезы из парафина и окрашивая GFP, используя кроличьи поликлональные антитела к GFP (Novus Biologicals, NE600-308); антитело кролика к GFP использовали в комбинации со вторичным антителом осла к антителу кролика IgG H&L (Alexa Fluor 568; ab175470, Invitrogen), в то время как конъюгированное с Alexa Fluor 488 антитело осла к IgG козы использовали для исключения неспецифического окрашивания печеночной аутофлуоресценции. Аутофлуоресценцию снижали гашением путем применения красителей, которые включали трипановый синий. Трипановый синий использовали в отношении тканей/клеток при 0,4% в PBS. Это значительно снижало фоновое значение.

Общую РНК экстрагировали из органоидов или трансплантатов с использованием тризола (Invitrogen). Первую цепь кДНК, синтезированную с использованием набора для синтеза 1-й цепи ДНК Primescript (Takara), использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации. Количественный анализ уровней мРНК выполняли с использованием зонда Faststart Universal Probe Master (Roche Diagnostics) с системой для выявления последовательностей ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems). Праймеры разрабатывали с помощью универсального зонда Universal Probe Library Assay Design Center (Roche Applied Science). Последовательности праймеров приведены в таблице 4. Праймеры отжигали при 50°C в течение 2 мин. и при 95°C в течение 10 мин. с последующими 40 циклами по 95°C (15 с) и 60°C (1 мин.). Экспрессию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) использовали, как правило, в качестве контроля и стандарта.

РНК очищали из клеток с использованием набора для анализа целостности РНК Qiagen RNeasy (RIN), с использованием биоанализатора Agilent 2000. Библиотеки кДНК получали с использованием набора для получения мРНК Illumina TruSeq Stranded на платформе Illumina HiSeq 2500. Секвенировали два образца на полосу, что занимало в целом 8 полос для всех образцов (одна проточная кювета). Анализ контроля качества выполняли с помощью FastQ. Картирование считываний последовательности по отношению к геному человека (hg19) выполняли с помощью MapSplice2 с использованием параметров по умолчанию. Количественную оценку транскриптов выполняли с помощью анализа RSEM, и DESeq использовали для нормализации экспрессии генов и идентификации различным образом экспрессируемых генов. MapSplice2 также использовали для определения кандидатных слитых транскриптов. Сигналы слияния были основаны на глубине и сложности считываний, охватывая кандидатные слитые соединения. Профили экспрессии генов сравнивали с применением анализа корреляции Пирсона, а иерархическую кластеризацию выполняли после преобразования, стабилизирующего дисперсию, предусмотренного в пакете DESeq. Анализ обогащения путей выполняли с помощью программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Дифференциальный анализ экспрессии генов проводили только в отношении генов с минимальным средним нормализованным индексом > 50 по меньшей мере в одной категории.

Статистически значимые различия между образцами рассчитывали с использованием 2-стороннего t-критерия Стьюдента, и результаты представляли в виде среднего ± стандартное отклонение (SD). P-значения, составляющие менее чем 0,05, считали статистически значимыми.

Результаты

В предыдущих исследованиях по инъекции трансплантатов было обнаружено, что пересадка требовала котрансплантации эпителиальных клеток с их мезенхимальными клетками-партнерами по соответствующей стадии дифференцировки. В случае печеночных стволовых клеток и стволовых клеток желчных протоков эти мезенхимальные клетки состояли из ангиобластов (CD117+, CD133+, VEGFr+, CD31-отрицательных) и их непосредственных потомков, предшественников клеток эндотелия (CD133+, VEGFr+, CD31+, фактор фон Виллебранда+) и предшественников звездчатых клеток (CD146+, ICAM-1+, альфа-гладкомышечный актин+ (ASMA), витамин A-отрицательных). Авторы данной заявки обозначали их в совокупности как мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC). Авторы данной заявки также добились частичной эффективности в случае выделенных мезенхимальных стволовых клеток свиньи (MSC), полученных с помощью способов от других авторов, а также выделения клеток из печеней неонатальных свиней.

В предыдущих исследованиях авторы данной заявки достигли эффективности в выделении сопоставимых эпителиальных и мезенхимальных клеточных стадий с использованием многопараметрической проточной цитометрии для определения соотношений партнеров по стадии дифференцировки эпителиальных и мезенхимальных клеток в клеточных суспензиях, а затем использования этих соотношений в трансплантатах с помощью отобранных иммунных путем клеток. В этих исследованиях авторы данной заявки обнаружили, что более эффективным является истощение клеточных суспензий зрелых мезенхимальных клеток в результате повторных процедур пэннинга с последующим культивированием оставшихся клеточных суспензий на планшетах со слабым прикреплением и в бессывороточной среде Кубота в течение 6-8 часов. Органоиды самособирались, при этом каждый агрегат содержал примерно 50-100 клеток. Маркерный анализ указывал на объединение BTSC с ELSMC (фиг. 1). Как представлено на схеме на фиг. 1A, их использовали незамедлительно или криоконсервировали в определенных условиях, определенных ранее, и размораживали для трансплантатов, если требовалось. Характеристики органоидов BTSC/ELSMC определяли с использованием иммунофлуоресценции (IF), qRT-PCR и RNA-seq и, как было показано, они экспрессировали классические признаки BTSC (фиг. 1) и ELSMC (данные не показаны). BTSC в органоидах не экспрессировали зрелых печеночных генов и поджелудочной железы, но экспрессировали низкие уровни генов плюрипотентности (например, OCT4, SOX2) и гены энтодермальных стволовых клеток (например, EpCAM, SOX9, SOX17, PDX1, LGR5, CXCR4, MAFA, NGN3 и NIS). Иллюстративные анализы qRT-PCR подтверждали результаты IF и IHC в отношении клеток до трансплантации (фиг. 1D). Анализы IHC указывали на то, что более примитивные клетки (например, клетки, экспрессирующие гены плюрипотентности) были распределены во внутренних частях органоидов, а более поздние стадии созревания - по периметрам (например, клетки, экспрессирующие EpCAM или альбумин) (фиг. 1C).

Результаты от трансплантатов в виде заплаты сравнивали с результатами от инъекции трансплантатов с помощью способов, определенных ранее, и включающих инъекцию клеток и локализацию участка в результате активации гиалуронанов с помощью полиэтиленгликольдиакрилата (PEGDA) для желатинизации в течение нескольких минут.Инъекция трансплантатов в паренхиму свиной печени приводила к практически 100% приживлению, но с минимальной миграцией (при ее наличии) и интеграцией в ткань хозяина, происходящей медленно в течение нескольких недель (данные не показаны). Результаты были аналогичны результатам, наблюдаемым ранее в случае инъекции трансплантатов печеночных стволовых клеток¹⁷. Инъекция трансплантатов в мезентерий, прилегающий к ответвлениям печеночных протоков/воротной вены, расположенных непосредственно каудально по отношению к долям печени, была возможной в случае крупных протоков, однако вызывала окклюзию более мелких протоков в результате эффектов набухания HA-гидрогелей и приводила к холестазу (фиг. 13). Успех в случае осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты приводил к отказу от дальнейших усилий при использовании стратегий инъекции трансплантатов.

Композиция трансплантатов на основе столовых клеток включала применение условий с использованием 3 различных слоев гиалуронановых (HA) гидрогелей с точными концентрациями HA к PEGDA для достижения уровня жесткости, оцениваемой с помощью реологических анализов (фиг. 2C). Донорские клетки включали в мягкий HA слой (~100 Па) и помещали напротив поверхности печени/поджелудочной железы; мягкие гидрогели поддерживали признаки стволовости²³, которые в этих исследованиях оказались необходимыми для пересадки. Этот слой помещали сверху жесткого (10-кратный; ~700 Па) HA слоя, полученного заранее на подложке и выступающего в качестве барьера для миграции. Заплату прикрепляли к целевому участку с помощью швов или хирургического клея. 2-кратный HA-гидрогель был достаточно мягким (жесткость = ~200 Па) для того, чтобы способствовать обработке или покрытию серозной поверхности трансплантата во время хирургического вмешательства и выполнять функцию дополнительной минимизации проявлений адгезии со стороны близлежащих тканей.

Трансплантаты в виде заплаты помещали на поверхность печени, т.е. поверхностно по отношению к капсуле Глиссона или капсуле поджелудочной железы, и прикрепляли швами или хирургическим клеем по углам (фиг. 2F). Жесткость шелка Seri приводила к размещению трансплантатов в участках с минимальной кривизной и за пределами участков со значительными механическими воздействиями (например, возле диафрагмы). При помещении трансплантатов на поджелудочную железу трансплантат протискивался между двенадцатиперстной кишкой и поджелудочной железой.

Единственным вариантом предпринимаемого осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты и последующего отказа от нее было острое хирургическое удаление капсулы. Кровоизлияние было обильным, что исключало дальнейшее применение у хозяев с измененным гомеостазом, ассоциированным с печеночной недостаточностью, или даже у здоровых хозяев, учитывая нежелательные эффекты сыворотки в отношении донорских клеток. Без таких попыток изменения капсул органов, трансплантаты в виде заплаты поддавали хирургическим процедурам.

Ряд подложек испытывали с акцентом на подложки, используемые клинически при абдоминальных хирургических вмешательствах (таблица 1 и таблица 2). Все, кроме шелка Seri-Silk, вызвали проблемы, которые приводили к их устранению для дальнейшего рассмотрения. Проблемы включали ломкость (например, Seprafilm, Retroglyde); индукцию некроза или фиброза и значительные уровни проявлений адгезии (например, Surgisis, Vetrix) и значительные адгезионные образования в случае нитчато-губчатой версии Seri-Silk или любых подложек с добавлением карбоксиметилцеллюлозы («belly jelly») в брюшную полость. Из исследованных подложек хирургический шелк SERI^24-26 (Allergan, Inc. Ирвайн, Калифорния, США) обеспечивал наиболее эффективную комбинацию механической поддержки и минимальных проявлений адгезии, при этом эффект дополнительно усиливался в результате нанесения 2X HA на серозную поверхность SeriSilk после прикрепления к целевому участку. Продукт представлял собой очищенный фиброин шелка шелкопряда и был разработан Девидом Капланом (университет Тафтса, Бостон, Массачусетс, США). Авторы данной заявки обнаружили, что он является жестким, - свойство, которое оказалось пригодным для хирургических манипуляций и помещения на плоские/жесткие органы, например печень. Жесткость сделала его сложным для применения в участках со значительной кривизной или необходимостью гибкости. Тем не менее, его жесткость оказалась нейтральной по отношению к эффектам созревания донорских клеток, - результат, который сделал такую подложку приемлемой для осуществления пересадки трансплантата в виде заплаты. В трансплантатах через 3 недели Seri-Silk был окружен полосами коллагена, что указывало на умеренную реакцию организма на чужеродный объект. Оценка других кандидатных подложек, таких как синтетические ткани, продолжается.

Доказательство ремоделирования через одну неделю после хирургического вмешательства подтверждали с помощью окрашивания трихромом (фиг. 3, 7) или сафранином O, красителями, которые окрашивают коллагены и другие компоненты внеклеточного матрикса. Изображения трансплантата (фиг. 3A-B), которые окрашивали трихромом, сравнивали с изображениями того же участка, окрашенного гематоксилином/эозином (фиг. 3 C-D). Реконструирование капсулы Глиссона и долек происходило через 3 недели наряду с резорбцией HA. Полосы, содержащие область ремоделирования, были неожиданно крупными (фиг. 3-5, 7).

Донорские клетки, происходящие от трансгенных GFP+ свиней, легко определяли с помощью экспрессии GFP с использованием IHC анализов. В поджелудочной железе донорские клетки определяли с помощью зеленой флуоресценции. В то же время в печени аутофлуоресценция липофусцинов в гепатоцитах достигала максимума при длине волны, перекрывающейся с длиной волны GFP. Таким образом, определяли донорские клетки в печени с антителом к GFP (антитело кролика к GFP; Novus, NB600-308) и связывали их со вторичным антителом к красному флурозонду (антитело осла к антителу 555 кролика, Invitrogen), что вызывало окрашивание донорских клеток с получением розовых ядер (красный флуорозонд совместно с синим DAPI). Клетки-хозяева распознавали, учитывая их синие ядра (краситель DAPI), но без экспрессии GFP (фиг. 4).

Дольки печени зрелых гепатоцитов были ярко-зелеными вследствие аутофлуоресценции (липофусцины) (фиг. 4B). Донорские GFP+ клетки, которые созревали до агрегатов гепатоцитов, имели лавандовый цвет и розовые ядра (фиг. 4C) вследствие слияния красного флуорозонда от GFP, синего от DAPI и аутофлуоресцентного темно-зеленого от липофусцинов. Гепатоциты, происходящие либо от хозяина, либо от донора, собирались в кластеры вокруг мезенхимальных клеток хозяина (клетки эндотелия, звездчатые клетки) с яркой желто-зеленой аутофлуоресценцией из-за, предположительно, витамина A в зрелых звездчатых клетках (фиг. 4C); данные IHC для клеток эндотелия и звездчатых клеток не показаны.

В течение недели трансплантаты в виде заплаты органоидов из BTSC/ELSMC приводили к ремоделированию капсулы органа и прилегающих долек с последующим слиянием клеток хозяина и донорских клеток (фиг. 3-5,7). Пальцевидные отростки донорских клеток продолжались в печеночные дольки ткани хозяина; наряду с этим, клетки-хозяева продолжались в HA трансплантатов (фиг. 4). В случае поджелудочной железы трансплантат протискивался между поджелудочной железой и двенадцатиперстной кишкой, и через одну неделю после хирургического вмешательства пересадка донорских клеток происходила как в поджелудочную железу, так и в бруннеровы железы подслизистой оболочки двенадцатиперстной кишки (фиг. 6). Интеграция клеток в больших областях печени (или поджелудочной железы) завершалась через 2 недели, к этому времени слои HA в основном рассасывались; донорские клетки характеризовались направлением дифференцировки, ограниченным в зрелые паренхимальные печеночные клетки, как холангиоцитарные, так и гепатоцитарные (фиг. 5), или в клетки поджелудочной железы (фиг. 6).

Через 3 недели HA слои рассасывались полностью, оставляя только подложку. Это коррелировало с появлением капсулы органа и гистологической структуры ткани возле капсул (фиг. 3, 5, 6) или капсулы поджелудочной железы и гистологических структур поджелудочной железы (фиг. 6). В поджелудочной железе зрелые клетки определяли с помощью функциональных маркеров, которые предусматривали инсулин в случае островковых клеток (бета-клеток) и амилазу в случае ациноцитов.

Через неделю эффективность пересадки как для печени, так и для поджелудочной железы была близка к 100%, поскольку все определенные донорские клетки, как было обнаружено, были жизнеспособными и находились в пределах печени или поджелудочной железы; а не в остатках трансплантатов выше капсул органов; и с ничтожно малым доказательством или его отсутствием эктопического распределения клеток в других органах (например, легком).

Скорость миграции донорских клеток в трансплантатах BTSC/ELSMC через печень и через поджелудочную железу оказалась значительной, что приводило к появлению донорских клеток в большинстве участков органа (печени или поджелудочной железы) к концу недели и однородному распределению клеток по ткани (печени/поджелудочной железе) через 2-3 недели (фиг. 3-6).

Коррелируя с растворением и ремоделированием капсулы Глиссона (или капсулы поджелудочной железы) и близлежащих долек печени (или ткани поджелудочной железы) и коррелируя со значительной пересадкой, имела место повышенная экспрессия многочисленных MMP, ферментов, которые, как известно, растворяют компоненты матрикса и ассоциированы с клеточной миграцией. На фиг. 7 представлены данные из исследований анализов RNA-seq и IHC в отношении MMP, экспрессируемых стволовыми клетками/клетками-предшественниками по сравнению со зрелыми клетками. BTSC экспрессировали высокие уровни многочисленных MMP, состоящих как из секретируемых форм (например, MMP2, MMP7), так и мембраноассоциированных форм (например, MMP14 и MMP15). ELSMC, предшественники клеток эндотелия и звездчатых клеток, также способствовали образованию многочисленных MMP.

Результаты данных RNA-seq подтверждали с помощью анализов IHC белков, кодируемых генами MMP (фиг. 7). Анализы IHC подтверждали наличие секретируемых форм MMP (например, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9), особенно в участках ремоделирования. Экспрессию белка MMP1 обнаруживали в органоидах BTSC/ELSMC, а также в участках ремоделирования трансплантатов; в то же время существующие банки данных результатов RNA-seq не включают MMP1 из-за содержащей аннотированных молекул свиного MMP1, подлежащих применению для анализа. Таким образом, признание его экспрессии основано на анализах IHC.

Переменные, вызывающие дифференцировку донорских клеток, приводили к подавлению экспрессии MMP, особенно секретируемых форм, и наряду с этим к утрате способности к пересадке и миграции (данные не показаны). Эти факторы включали сыворотку, различные растворимые регуляторные сигналы (факторы роста, цитокины, гормоны), которые, как известно, влияют на дифференцировку донорских клеток, компоненты внеклеточного матрикса, независимо от того, находились ли они в гидрогелях или в подложках (особенно подложках, содержащих коллаген I типа), а также жесткость HA-гидрогелей (т.е. уровни Па). Если дифференцировка ELSMC происходила предпочтительно в строму, то трансплантаты становились фиброзными; если в клетки эндотелия, то трансплантаты сохраняли жизнеспособные клетки и ткань, но оставались поверхностными по отношению к капсуле органа (данные не показаны).

Органоиды из BTSC/ELSMC оказались наиболее успешно функционирующей структурой клеток для осуществления пересадки. В прошлом приходилось совместно трансплантировать эпителиально-мезенхимальных партнеров с помощью их иммунологического отбора из клеточных суспензий путем проточной цитометрии с использованием их отличительных поверхностных антигенов, а затем их смешивания в соответствии с соотношениями, встречающимися в клеточных суспензиях из свежевыделенных тканей¹⁷. В данной работе авторы изобретения обнаружили, что обеспечение их самостоятельного отбора в органоиды после удаления с помощью пэннинга зрелых мезенхимальных клеток оказалось более эффективным и действенным в определении соответствующих эпителиально-мезенхимальных партнеров по стадии дифференцировки с соответствующей паракринной передачей сигналов для трансплантатов и получения органоидов в определенных (бессывороточных) условиях, которые делали их криоконсервацию легкой и безопасной.

Первоначальная разработка трансплантатов состояла из смешивания клеток с подходящими биоматериалами, которые могут стать нерастворимыми и поддерживать клетки, расположенные в целевом участке. Для трансплантатов идеальными биоматериалами оказались несульфатированные или минимально сульфатированные гликозаминогликаны (GAG), такие как гиалуронаны (HA), встречающиеся в нишах для всех стволовых клеток с рецепторами к HA, являющихся классическими признаками стволовых клеток. Поддержание клеток в виде стволовых клеток/клеток-предшественников оптимизировало экспрессию секретируемых и мембраноассоциированных MMP, эффективных для пересадки.

Доказательство способов пересадки было особенно выраженным в участках ремоделирования, которые появлялись на поверхности раздела трансплантата и ткани хозяина. Для проверки результатов ремоделирования использовали окрашивание трихромом и сафранином O с использованием красителей, которые окрашивают компоненты внеклеточного матрикса, и анализируя наряду с этим прилегающие срезы, окрашенные гематоксилином/эозином (фиг. 3, 7). Это подтверждало ремоделирование капсулы органа и прилегающей ткани в течение недели после хирургического вмешательства. Через 3 недели после хирургического вмешательства эти анализы продемонстрировали восстановление капсул органов и гистологической структуры нормальной ткани после выведения HA. Зона ремоделирования была необычайно крупной (фиг. 3, 7), особенно через одну неделю после хирургического вмешательства, и, как было показано, включала в себя многочисленные формы MMP (фиг. 7).

Несмотря на то, что существует несколько источников и типов HA, среди наиболее пригодных - тиол-модифицированные НА, определенные Гленн Прествич (Университет Юты, Солт Лейк Сити, Юта, США), которые можно активировать с помощью PEGDA для образования гидрогеля с точными биохимическими и механическими свойствами. Эти свойства HA придают совершенную эластичность, обеспечивают доступ к трансплантату всех растворимых сигналов в крови, лимфе или интерстициальной жидкости и минимизируют созревание донорских клеток, пока не произошли пересадка и миграция. Способность варьировать реологические факторы с помощью простых изменений концентраций HA и PEGDA обеспечила дополнительные преимущества в определении направления миграции клеток и минимизации проявлений адгезии. Мягкие HA-гидрогели, гидрогели, имитирующие свойства нишей для стволовых клеток, обеспечивали экспрессию репертуара MMP, ассоциированного со стволовыми клетками/клетками-предшественниками. Таким образом, механические свойства HA, изучаемые в течение нескольких лет в функциях скелетных тканей, являются важными в контроле стратегий осуществления пересадки²³.

Трансплантаты в виде заплаты, содержащие стволовые клетки/клетки-предшественники, приводили к поразительному явлению «плавления» трансплантатов в тканях в течение нескольких дней с последующим слиянием донорских клеток и клеток-хозяев и распределению клеток через большинство участков органа в течение от одной до двух недель. После этого созревание донорских клеток и восстановление капсул органа происходило наряду с выведением HA из тканей.

Способ пересадки и интеграции коррелировал с экспрессией многочисленных MMP, семейства кальцийзависимых, цинксодержащих эндопептидаз, которые разрушают компоненты внеклеточного матрикса. С помощью исследований RNA-seq обнаружили паттерн MMP, ассоциированных со стволовыми клетками/клетками-предшественниками, включающих высокие уровни как секретируемых форм (например, MMP2, MMP7), так и мембраноассоциированных форм (например, MMP14, MMP15). Как было обнаружено, IHC анализы указывали на то, что уровни белка секретируемых MMP (например, MMP1, MMP2, MMP7) являлись высокоэкспрессированными в участках ремоделирования (фиг. 7). Условия (растворимые факторы роста, цитокины, сыворотка, компоненты матрикса, механические воздействия), которые вызывали дифференцировку донорских клеток, приводили к снижению образования MMP, особенно секретируемых форм, и наряду с этим подавления процессов пересадки.

Биоматериалы трансплантатов, особенно НА, как было показано ex vivo и in vivo, поддерживали свойства стволовости в клетках. Поскольку трансплантаты лишены известных сигналов, которые могут активировать детерминацию направления дифференцировки, то результаты в отношении донорских клеток, которые созревали в различимые направления дифференцировки зрелых клеток, в зависимости от того, помещали ли трансплантат в печень или в поджелудочную железу, предполагали локальное микроокружение ткани хозяина в качестве логического источника соответствующих факторов для процессов созревания.

Количества клеток, которые могут быть пересажены, являлись значительными (> 10⁸) и обусловлены размерами трансплантата, количествами клеток и репертуаром секретируемых и ассоциированных с плазматической мембраной ММР. Эти результаты отличаются от ограниченных количеств клеток (например, 10⁵-10⁶), пригодных в случае сосудистой доставки или путем инъекции трансплантата.

Осуществление пересадки трансплантата в виде заплаты представляет собой безопасную стратегию, с помощью которой трансплантируют большие количества клеток в солидный орган, в том числе внутренние органы, и может оказаться пригодной для лечения пациентов, особенно если пересадка может происходить в значительной степени в условиях заболевания. Несмотря на это, существует опасение того, что может произойти аберрантная пересадка, если ткань является фиброзной или пораженной циррозом. Соответственно, в данном документе предусмотрены примеры для определения эффективности трансплантатов в виде заплаты для аспектов способа.

Пример 2. Лечение заболевания печени

В данном примере описан иллюстративный способ лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение печени, с использованием трансплантата в виде заплаты. Донорские клетки получали в виде органоидов из стволовых клеток желчных протоков (BTSC), предшественников печени и поджелудочной железы, агрегированных с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), состоящих из ангиобластов и их потомков на ранней стадии дифференцировки, предшественников клеток эндотелия и предшественников звездчатых клеток, как описано в данном документе. Органоиды BTSC/ELSMC включали в мягкие гиалуронановые гидрогели (< 200 Па), помещенные на подложку, которую связывали с целевым участком печени субъекта.

После введения трансплантата в виде заплаты субъекта контролировали в отношении улучшения функции печени. Широко используемые исследования для проверки функции печени включали без ограничения исследования аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), щелочной фосфатазы (ALP), альбумина и билирубина. С помощью исследований ALT и AST измеряли уровни ферментов, которые высвобождаются в ответ на повреждение или заболевание. С помощью исследований альбумина и билирубина измеряли насколько эффективно печень образует альбумин, белок, а также насколько эффективно она избавляется от билирубина, побочного продукта крови. Ожидалось, что через от приблизительно 2 недель до приблизительно 36 недель будет выявлено улучшение в функции печени. Улучшение определяли с помощью выявления улучшенного значения одного или более из функциональных исследований печени по сравнению со значением до введения трансплантата и/или нормализации или ослабления одного или более симптомов заболевания или нарушения печени.

Пример 3. Лечение заболевания поджелудочной железы

В данном примере описан иллюстративный способ лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение поджелудочной железы, с использованием трансплантата в виде заплаты. Донорские клетки получали в виде органоидов из стволовых клеток желчных протоков (BTSC), агрегированных с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), состоящих из ангиобластов и их потомков на ранней стадии дифференцировки, предшественников клеток эндотелия и предшественников звездчатых клеток, как описано в данном документе. Органоиды BTSC/ELSMC включали в мягкие гиалуронановые гидрогели (< 200 Па), помещенные на подложку, которую связывали с целевым участком поджелудочной железы субъекта.

После введения трансплантата в виде заплаты субъекта контролировали в отношении улучшения функции поджелудочной железы. Широко используемые исследования для проверки функции поджелудочной железы включают без ограничения исследования крови в отношении уровней ферментов амилазы и липазы поджелудочной железы, прямое исследование функции поджелудочной железы после введения секретина или холецистокинина, исследование фекальной эластазы, КТ-исследование с контрастным красителем, ультразвуковое исследование брюшной полости, эндоскопическую ретроградную холангиопанкреатографию (ERCP), эндоскопическое ультразвуковое исследование и магнитно-резонансную холангиопанкреатографию. Ожидалось, что через от приблизительно 2 недель до приблизительно 36 недель будет выявлено улучшение в функции поджелудочной железы. Улучшение определяли с помощью выявления улучшенного значения одного или более из функциональных исследований поджелудочной железы по сравнению со значением до введения трансплантата и/или нормализации или ослабления одного или более симптомов заболевания или нарушения поджелудочной железы.

Пример 4. Лечение заболевания почки

В данном примере описан иллюстративный способ лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение почки, с использованием трансплантата в виде заплаты. Донорские клетки получали в виде органоидов из стволовых клеток желчных протоков (BTSC), агрегированных с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), состоящих из ангиобластов и их потомков на ранней стадии дифференцировки, предшественников клеток эндотелия и предшественников звездчатых клеток, как описано в данном документе. Органоиды BTSC/ELSMC включали в мягкие гиалуронановые гидрогели (< 200 Па), помещенные на подложку, которую связывали с целевым участком почки субъекта.

После введения трансплантата в виде заплаты субъекта контролировали в отношении улучшения функции почки. Широко используемые исследования для проверки функции почки включают без ограничения клинически значимые конечные точки функции почек, известные из уровня техники. Ожидалось, что через от приблизительно 2 недель до приблизительно 36 недель будет выявлено улучшение в функции почек. Улучшение определяли с помощью выявления улучшенного значения одного или более из функциональных исследований почки по сравнению со значением до введения трансплантата и/или нормализации или ослабления одного или более симптомов заболевания или нарушения почки.

Пример 5. Лечение заболевания GI

В данном примере описан иллюстративный способ лечения субъекта, имеющего заболевание или нарушение желудочно-кишечного тракта, с использованием трансплантата в виде заплаты. Донорские клетки получали в виде органоидов из стволовых клеток желчных протоков (BTSC), агрегированных с мезенхимальными клетками на ранней стадии дифференцировки (ELSMC), состоящих из ангиобластов и их потомков на ранней стадии дифференцировки, предшественников клеток эндотелия и предшественников звездчатых клеток, как описано в данном документе. Органоиды BTSC/ELSMC включали в мягкие гиалуронановые гидрогели (< 200 Па), помещенные на подложку, которую связывали с целевым участком кишечника субъекта.

После введения трансплантата в виде заплаты субъекта контролировали в отношении улучшения функции кишечника. Широко используемые исследования для проверки функции кишечника включают без ограничения клинически значимые конечные точки функции кишечника, известные из уровня техники. Ожидалось, что через от приблизительно 2 недель до приблизительно 36 недель будет выявлено улучшение в функции кишечника. Улучшение определяли с помощью выявления улучшенного значения одного или более из функциональных исследований кишечника по сравнению со значением до введения трансплантата и/или нормализации или ослабления одного или более симптомов заболевания или нарушения желудочно-кишечного тракта.

Таблица 1

Индекс Хирургический подход 1 Хирургический подход 2 Хирургический подход 3 Хирургический подход 4 Подробности для лечения Непосредственно на поверхность печени наносят пластырь Непосредственная инъекция в паренхиму печени Перидуктальная инъекция в бифуркацию протоков Непосредственная инъекция под капсулу вокруг желчных протоков (например, общий желчный проток) Животное в группе N=23 N=3 N=3 N=3 Клеток на трансплантаты* 0,5-5 E7 на мл 0,5-5 E7 на мл путем многократных инъекций 0,5-2 E7 на 0,5 мл 0,5-2 E7 на 0,5 мл Результаты Хорошо Хорошо Хорошо, но ограниченно Плохо Ограничения/противопоказания Безопасно для нормальной печени и для животного организма с повреждением, эффективно для доставки большого количества донорских клеток в печень; компоненты трансплантатов в виде заплаты могут быть адаптированы в связи со стадиями дисфункции печени Количество клеток/на инъекцию ограничено**; несколько инъекций могут вызвать более высокий риск кровотечения Количество клеток на инъекцию ограничено из-за ограничения надлежащих участков для инъекции у хозяев. Несколько инъекций не могут быть достигнуты Приводит к окклюзии протоков и последующим симптомам холестаза Показания для применения Какие-либо нарушения функций печени, особенно врожденные ошибки метаболизма Потенциал, который можно использовать для врожденных ошибок метаболизма и цирроза на ранней стадии Рекомендуется для левых долей трансплантатов Не рекомендуется *Клеток на трансплантаты представляет собой количества клеток на мл перекрестносшитого HA
**В данном исследовании для здоровых реципиентов-подсвинков с весом тела 10 кг было обнаружено не более чем 0,5 мл на инъекцию.
*

Таблица 2. Сравнение подложек, исследуемых в отношении трансплантатов в виде заплаты

Подложки Удобство в применении Неблагоприятные реакции Проявления адгезии Информация на подложке Каркасы из хирургическо-го шелка SERI® Да Нет Минимальный* Шелк шелкопряда,
Дэвид Каплан (Университет Тафтса, Бостон, Массачусетс, США),
Sofragen (Бостон, Массачусетс, США) Vetrix BioSIS
ECM Да Склонен к смещению и сгибанию; некроз, обесцвечивание, фиброз 2-3 Технол. регенеративной медицины Surgisis®ES™,
трансплантат из мягкой ткани Да 2-3 www.cooksurgical/1470 Alloderm Да 2-3 Децеллюляризованная ткань дермы человека Вязанная викриловая сетка Да Сильная Ethicon Seprafilm Слишком хрупкий Нет 2 https://www.seprafilm.us/ Reglyde Слишком хрупкий Нет 2 http://www.biotimeinc)com/technologies/hystem-hydrogels/ **Проявления адгезии: варьировали по степени тяжести. Авторы изобретения присвоили номер чтобы указать, что степень тяжести: 0 = отсутствие проявлений адгезии; 1 = тонкие и легко разрушаемые проявления адгезии; 2 = проявления адгезии, требующие диссекции тупым предметом для разрушения; 3 = плотные проявления адгезии, которые исчезали только при прикладывании значительного усилия, что приводило в результате к частичному или общему травмированию внутренних органов. *Нитчато-губчатая версия шелка Seri вызывала значительные проявления адгезии. Наиболее сильные проявления адгезии, наблюдаемые при использовании любой из подложек, применяемых в комбинации с «belly jelly» - карбоксиметилцеллюлозой. Покрытие серозной поверхности подложки более концентрированным HA уменьшало и минимизировало проявления адгезии Иммуносупрессия. Все свиньи получали дозы иммуносупрессорных препаратов такролимуса (0,5 мг/кг) и микофенолата (500 мг) дважды в день, начиная за 24 часа до хирургического вмешательства, и непрерывно получали тщательное лечение после хирургического периода.

Таблица 3. Антитела

Первичные антитела

Категория Антитело Хозяин Клонирование/
конъюгация Изотип Поставщик Номер по каталогу Разбавление/применение Плюрипотентные OCT4 Gt Поли, неконъюгированные IgG Биотехнология Санта-Круз SC-9081 IHC-P (1:100) Мультипо-тентные эндотермические EpCAM Rb Поли, неконъюгированные IgG Abcam ab71916 IHC-P (1:200) IF (1:200) SOX9 Rb Поли, неконъюгированные IgG Chemicon AB5535 ICC (1: 800) IF (1:500) PDX1 Gt Поли, неконъюгированные IgG R&D System AF2419 IHC-P/ICC (1:200) IF (1:50) NIS Ms Моно-C №: SPM186 IgG1 Abcam ab17795 IHC-P/ICC (1:50) SOX17 Ms Моно-C №: OTI3B10 IgG1 Abcam ab84990 IHC-P (1:100) IF/ICC (1:50) Y-хромосома RBMY1 Rb Поли, неконъюгированные IgG Биотехнология Санта-Круз sc-28727 IHC-P (1:400) GFP GFP Rb Поли, неконъюгированные IgG Novus Biologicals NB600-308 IHC-P (1:500) IF (1:200) GFP-555 Метка GFP Rb Поли, Alexa-555 IgG Thermo Fisher Scientific A-31851 IF-P/ IF-F/ ICC (1:350) Маркеры поджелудочной железы Инсулин Gp Поли, неконъюгированные IgG Abcam Ab195956 IF (1:100) Глюкагон Ms Моно- IgG1 Sigma-Millipore G2654 IF (1:100) Альфа-амилаза Rb Поли, неконъюгированные Sigma-Millipore A8273 IF (1:200) Матриксные металлопротеиназы MMP1 Gt Поли, неконъюгированные IgG Sigma-Millipore M4696-100UG 10 мкг/мл MMP 2 (С-тер-минал) Ms Моно-C №: 6E3F8 IgG Abcam ab86607 IHC-P (1:300)

Таблица 3. Антитела (продолжение)

Вторичные антитела

Флюороген-ный анализ
(перекрест-ное поглощение) Антитело к Gt-488 Dk Поли, DyLight 488 IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific SA5-10086 1:1000 Антитело к Rb-594 Dk Поли, DyLight 594 IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific SA5-10040 1:1000 Антитело к Ms-488 Dk Поли, DyLight 488 IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific SA5-10166 1:1000 Антитело к Gt-350 Dk Поли, DyLight 350 IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific SA5-10085 1:1000 Антитело к Rb-488 Dk Поли, Alexa Fluor 488 IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A21206 1:400 Антитело к Gp-647 Dk Поли, Alexa Fluor 647 IgG (H+L) Jackson Immuno Research 706-605-148 1:400 Антитело к Ms-594 Dk Поли, Alexa Fluor 594 IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A21207 1:400 Хромогенный анализ Набор для выявления антител к Rb Hs Микрополимер HRP IgG Vector laboratories MP-7401 Готово к применению Набор для выявления антител к Ms Hs Микрополимер HRP IgG Vector laboratories MP-7402 Готово к применению Набор для выявления антител к Gt Hs Микрополимер HRP IgG Vector laboratories MP-7405 Готово к применению Набор для выявления антител к Ms Hs Микрополимер HRP IgG Vector laboratories MP-7402 Готово к применению Сокращения
• Хозяин: Gt, коза; Rb, кролик; Dk, осел; Hs, лошадь; Мс, мышь; Gp, морская свинка.
• Клонирование или конъюгация: Поли, поликлональное моно-C №, количество моноклональных.
• Приложение: IHC, иммуногистохимический анализ; IHC-F, иммуногистохимически замороженные срезы; IHC-P, иммуногистохимические образцы, залитые в парафин; ICC, иммуноцитохимический анализ; IF, иммунофлуоресценция; HRP, пероксидаза хрена.

Таблица 4. Праймеры (количественная ПЦР)

Категория Название Номер доступа Последовательность (от 5' до 3') Длина (п. о.) Tm (°C) Ген «домашнего хозяйства» GAPDH NM_001206359.1 Смысловая последовательность: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC 473 60°C Антисмысловая последовательность: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG Плюрипотентные гены Nanog NM_001129971.1 Смысловая последовательность: TTCCTTCCTCCATGGATCTG 214 62°C Антисмысловая последовательность: ATCTGCTGGAGGCTGAGGTA Sox2 NM_001123197 Смысловая последовательность: GCCCTGCAGTACAACTCCAT 216 60°C Антисмысловая последовательность: GCTGATCATGTCCCGTAGGT Oct4 JN633978.1 Смысловая последовательность: CGAAGCTGGACAAGGAGAAG 176 60°C Антисмысловая последовательность: GCTGAACACCTTCCCAAAGA Эндодермальные примитивные гены EpCAM NM_214419.1 Смысловая последовательность: ACCAGAGAATGCTATCCAGAAC 314 53°C Антисмысловая последовательность: CTCACTCGCTCCAAACAGG Lgr5 NM_001315762.1 Смысловая последовательность: CCTTGGCCCTGAACAAAATA 110 60°C Антисмысловая последовательность: ATTTCTTTCCCAGGGAGTGG Sox9 NM_213843.2 Смысловая последовательность: CGGTTCGAGCAAGAATAAGC 229 60°C Антисмысловая последовательность: GTAATCCGGGTGGTCCTTCT Bmi1 NM_001285971.1 Смысловая последовательность: TCATTGATGCCACAACCATT 189 60°C Антисмысловая последовательность: TGAAAAGCCCCGGAACTAAT Гены, связанные с GI-трактом Muc2 NC_010444.3 Смысловая последовательность: GGCTGCTCATTGAGAGGAGT 249 60°C Антисмысловая последовательность: ATGTTCCCGAACTCCAAGG CDX2 NC_010453.4 Смысловая последовательность: AGAACCCCCAGGTCTCTGTCTT 115 56°C Антисмысловая последовательность: CAGTCCGAAACACTCCCTCACA Гены, связанные с паренхимальными печеночными клетками AFP NM_214317.1 Смысловая последовательность: CGCGTTTCTGGTTGCTTACAC 609 60°C Антисмысловая последовательность: ACTTCTTGCTCTTGGCCTTGG Альбумин AY663543.1 Смысловая последовательность: AGTCTGCCAAGCTGCTGATA 115 60°C Антисмысловая последовательность: AGCCTTGGGAAATCTCTGGC Гены, относящиеся к поджелудочной эндокринной железе PDX-1 NM_001141984.2 Смысловая последовательность: AGTGATACTGGATTGGCGTTG 139 62°C Антисмысловая последовательность: TAGGGAGCCTTCCAATGTGT MAFA NC_010446.4 Смысловая последовательность: GCTTCAGCAAGGAGGAGGTC 120 62°C Антисмысловая последовательность: TCTCGCTCTCCAGAATGTGC

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к трансплантатам в виде заплаты для трансплантации клеток в солидные органы. Трансплантаты можно применять для восстановления пораженных органов или для создания моделей болезненных состояний у экспериментальных хозяев. Трансплантат покрыт биоразлагаемой, биосовместимой, биорассасываемой подложкой, применяемой для прикрепления трансплантата к целевому участку. Клетки в трансплантате мигрируют в ткань и по всей ткани таким образом, что в течение двух недель они однородно распределяются в ткани реципиента. Механизмы, с помощью которых осуществляют пересадку и интеграцию донорских клеток в орган или ткань, предусматривают многочисленные мембраноассоциированные и секретируемые формы MMP. 7 н. и 36 з.п. ф-лы, 15 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Трансплантат в виде заплаты для поддержания и сохранения смешанной популяции клеток, содержащий:

(a) смешанную популяцию из двух или более типов клеток, причем клетки по меньшей мере одного из них находятся на ранней стадии дифференцировки, на которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде в гидрогеле, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной смешанной популяции в пределах этого гидрогеля или в целевой орган или ткань, когда указанный гидрогель накладывается на целевой орган или ткань, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции через указанную подложку,

и при этом гидрогель, поддерживающий смешанную популяцию клеток, выполнен с возможностью поддержания и сохранения указанной смешанной популяции с обеспечением подавления дифференцировки или дальнейшего созревания клеток указанного по меньшей мере одного типа, находящихся на ранней стадии дифференцировки, до более поздней стадии дифференцировки, при которой они больше не способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые MMP, и

(с) гидрогель, накладываемый на серозную поверхность указанной подложки, причем серозная поверхность расположена противоположно по отношению к поверхности, находящейся в контакте с указанной смешанной популяцией, причем гидрогель, накладываемый на серозную поверхность указанной подложки, имеет вязкоупругость от около 250 до 400 Па.

2. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором указанная подложка содержит пористую сетку, заполненную гидрогелем.

3. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором гидрогель, поддерживающий смешанную популяцию клеток, содержит один или более гиалуронанов.

4. Трансплантат в виде заплаты по п. 2, в котором гидрогель, которым заполнена пористая сетка, содержит один или более гиалуронанов.

5. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором гидрогель, накладываемый на серозную поверхность указанной подложки, содержит один или более гиалуронанов.

6. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором указанная среда представляет собой среду Кубота.

7. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором указанная смешанная популяция содержит мезенхимальные клетки и эпителиальные клетки.

8. Трансплантат в виде заплаты по п. 7, в котором мезенхимальные клетки включают мезенхимальные клетки на ранней стадии дифференцировки (ELSMC).

9. Трансплантат в виде заплаты по п. 8, в котором указанные ELSMC включают одно или более из ангиобластов, предшественников клеток эндотелия, или предшественников звездчатых клеток, или мезенхимальных стволовых клеток (MSC).

10. Трансплантат в виде заплаты по п. 7, в котором указанные эпителиальные клетки включают эпителиальные стволовые клетки.

11. Трансплантат в виде заплаты по п. 7, в котором указанные эпителиальные клетки включают стволовые клетки желчных протоков (BTSC).

12. Трансплантат в виде заплаты по п. 7, в котором указанные эпителиальные клетки включают коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки.

13. Трансплантат в виде заплаты по п. 12, в котором указанные коммитированные и/или зрелые эпителиальные клетки включают зрелые паренхимные клетки.

14. Трансплантат в виде заплаты по п. 13, в котором указанные зрелые паренхимные клетки представляют собой одно или более из гепатоцитов, холангиоцитов и островковых клеток.

15. Трансплантат в виде заплаты по п. 7, в котором как указанные мезенхимальные клетки, так и эпителиальные клетки включают стволовые клетки.

16. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором указанная смешанная популяция включает аутологичные и/или аллогенные клетки.

17. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором клетки одного или более типов являются генетически модифицированными.

18. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором подложка содержит пористую сетку, каркас или мембрану.

19. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором подложка содержит непористый материал.

20. Трансплантат в виде заплаты по п. 19, в котором непористый материал выбран из шелка, амниона, плаценты, сальника, синтетической ткани, производных вышеуказанного или их комбинаций.

21. Трансплантат в виде заплаты по п. 1, в котором подложка связывает указанный трансплантат в виде заплаты с целевым органом или тканью и обеспечивает устойчивость к механическим воздействиям со стороны других тканей или органов.

22. Трансплантат в виде заплаты по п. 2, в котором гидрогель, которым заполнена пористая сетка, имеет вязкоупругость по меньшей мере 250 Па.

23. Трансплантат в виде заплаты для применения в способе пересадки клеток в целевую ткань, предусматривающем приведение целевой ткани в контакт с указанным трансплантатом в виде заплаты, причем указанный трансплантат в виде заплаты содержит:

(a) смешанную популяцию из двух или более типов клеток, причем по меньшей мере клетки одного из них находятся на ранней стадии дифференцировки, на которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде в гидрогеле, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной смешанной популяции в направлении целевой ткани и в целевую ткань, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции за пределы целевой ткани и через указанную подложку.

24. Трансплантат в виде заплаты по п. 23, дополнительно предусматривающий обеспечение возможности включения в ткань клеток, содержащихся в трансплантате в виде заплаты.

25. Трансплантат в виде заплаты по п. 23, где целевая ткань выбрана из группы, состоящей из ткани печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, желудочно-кишечного тракта, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, спинного мозга, кожи, матки, почки, мышцы, кровеносного сосуда, сердца, хряща, сухожилий и кости.

26. Трансплантат в виде заплаты по п. 25, где целевая ткань представляет собой ткань печени.

27. Трансплантат в виде заплаты по п. 25, где целевая ткань представляет собой ткань поджелудочной железы.

28. Трансплантат в виде заплаты по п. 25, где целевая ткань представляет собой ткань желчных протоков.

29. Трансплантат в виде заплаты по п. 25, где целевая ткань представляет собой ткань желудочно-кишечного тракта.

30. Трансплантат в виде заплаты по п. 25, где целевая ткань представляет собой ткань почки.

31. Трансплантат в виде заплаты по п. 25, где целевая ткань представляет собой орган.

32. Трансплантат в виде заплаты по п. 31, где орган представляет собой орган скелетно-мышечной системы, пищеварительной системы, дыхательной системы, мочевыделительной системы, женской репродуктивной системы, мужской репродуктивной системы, эндокринной системы, кровеносной системы, лимфатической системы, нервной системы или покровной системы.

33. Трансплантат в виде заплаты по п. 31, где орган выбран из группы, состоящей из печени, поджелудочной железы, желчных протоков, щитовидной железы, тимуса, кишечника, легкого, предстательной железы, молочной железы, головного мозга, мочевого пузыря, спинного мозга, кожи, матки, почки, мышцы, кровеносного сосуда, сердца, хряща, сухожилия и кости.

34. Трансплантат в виде заплаты для применения в способе пересадки клеток в целевую ткань, предусматривающем приведение целевой ткани в контакт с указанным трансплантатом в виде заплаты, причем указанный трансплантат содержит:

(a) популяцию клеток, в том числе одну популяцию, характеризующуюся ранней стадией дифференцировки, содержащую один тип или несколько типов клеток, поддерживаемых в среде в гидрогеле, имеющем реологические свойства, достаточные для обеспечения миграции клеток популяции в пределах или за пределы трансплантата в виде заплаты, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, имеющий реологические свойства, достаточные для подавления миграции клеток популяции через указанную подложку,

при этом трансплантат в виде заплаты выполнен с возможностью поддержания и сохранения указанной популяции клеток с подавлением дифференцировки или дальнейшего созревания указанной одной популяции, характеризующейся ранней стадией дифференцировки, до более поздней стадии дифференцировки.

35. Трансплантат в виде заплаты по п. 34, где указанная одна популяция, находящаяся на ранней стадией дифференцировки, способна экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP).

36. Трансплантат в виде заплаты для применения в способе лечения субъекта с заболеванием или расстройством печени, предусматривающем приведение в контакт печени субъекта с указанным трансплантатом в виде заплаты, причем указанный трансплантат содержит:

(a) смешанную популяцию из двух или более типов клеток, причем клетки по меньшей мере одного из них находятся на ранней стадии дифференцировки, на которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде в гидрогеле, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной смешанной популяции в направлении целевой ткани и в нее, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции в направлении от целевой ткани и через указанную подложку и обеспечения возможности включения клеток, содержащихся в трансплантате в виде заплаты, в печень с восстановлением тем самым определенной функции печени.

37. Трансплантат в виде заплаты по п. 36, где заболевание или расстройство печени представляет собой фиброз печени, цирроз печени, гематохроматоз, рак печени, атрезию желчных протоков, неалкогольную жировую болезнь печени, гепатит, вирусный гепатит, аутоиммунный гепатит, фасциолез, алкогольную болезнь печени, недостаточность альфа-1-антитрипсина, болезнь накопления гликогена II типа, наследственный амилоидоз, связанный с транстиретином, синдром Жильбера, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, синдром Бадда-Киари, повреждение печени или болезнь Вильсона.

38. Трансплантат в виде заплаты для применения в способе лечения субъекта с заболеванием или расстройством поджелудочной железы, предусматривающем приведение в контакт поджелудочной железы субъекта с указанным трансплантатом в виде заплаты, причем указанный трансплантат содержит:

(a) смешанную популяцию из двух или более типов клеток, причем клетки по меньшей мере одного из них находятся на ранней стадии дифференцировки, на которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде в гидрогеле, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной смешанной популяции в направлении целевой ткани и в нее, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции в направлении от целевой ткани и через указанную подложку и обеспечения возможности включения клеток, содержащихся в трансплантате в виде заплаты, в поджелудочную железу с восстановлением тем самым определенной функции поджелудочной железы.

39. Трансплантат в виде заплаты по п. 38, при котором заболевание или расстройство поджелудочной железы представляет собой сахарный диабет, экзокринную недостаточность поджелудочной железы, панкреатит, рак поджелудочной железы, дисфункцию сфинктера Одди, кистозный фиброз, разделенную поджелудочную железу, кольцевидную поджелудочную железу, повреждение поджелудочной железы или кровотечение из протока поджелудочной железы.

40. Трансплантат в виде заплаты для применения в cпособе лечения субъекта с заболеванием или расстройством желудочно-кишечного тракта, предусматривающем приведение в контакт одной или более частей кишечника субъекта с указанным трансплантатом в виде заплаты, причем указанный трансплантат содержит:

(a) смешанную популяцию из двух или более типов клеток, причем клетки по меньшей мере одного из них находятся на ранней стадии дифференцировки, на которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде в гидрогеле, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной смешанной популяции в направлении целевой ткани и в нее, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции в направлении от целевой ткани и через указанную подложку и обеспечения возможности включения клеток, содержащихся в трансплантате в виде заплаты, в кишечник с восстановлением тем самым определенной функции кишечника.

41. Трансплантат в виде заплаты по п. 40, где заболевание или расстройство желудочно-кишечного тракта представляет собой гастроэнтерит, рак желудочно-кишечного тракта, илеит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, пептическую язвенную болезнь, целиакию, фиброз, ангиодисплазию, болезнь Гиршпрунга, псевдомембранозный колит или повреждение желудочно-кишечного тракта.

42. Трансплантат в виде заплаты для применения в способе лечения субъекта с заболеванием или расстройством почки, предусматривающем приведение в контакт одной или более почек субъекта с указанным трансплантатом в виде заплаты, причем указанный трансплантат содержит:

(a) смешанную популяцию из двух или более типов клеток, причем клетки по меньшей мере одного из них находятся на ранней стадии дифференцировки, на которой они способны экспрессировать мембраноассоциированные и/или секретируемые матриксные металлопротеиназы (MMP), при этом указанная смешанная популяция поддерживается в среде в гидрогеле, характеризующемся вязкоупругостью, достаточной для обеспечения миграции указанной смешанной популяции в направлении целевой ткани и в нее, причем этот гидрогель имеет вязкоупругость от около 0,1 до 200 Па, и

(b) подложку, содержащую биосовместимый биоразлагаемый материал, характеризующийся вязкоупругостью, достаточной для подавления миграции указанной смешанной популяции в направлении от целевой ткани и через указанную подложку и обеспечения возможности включения клеток, содержащихся в трансплантате в виде заплаты, в почку с восстановлением тем самым определенной функции почки.

43. Трансплантат в виде заплаты по п. 42, где заболевание или расстройство почки представляет собой нефрит, нефроз, нефритический синдром, нефротический синдром, хроническое заболевание почки, острую почечную недостаточность, повреждение почки, кистозную болезнь почки, поликистозное заболевание почки, гломерулонефрит, IgA-нефропатию, волчаночный нефрит, рак почки, синдром Альпорта, амилоидоз, синдром Гудпасчера или гранулематоз Вегенера.