Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека Советский патент 1992 года по МПК A61K39/02 A61K35/74 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаратам для профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами.

Целью изобретения является повышение эффективности профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека.

Препарат биоспорин содержит в качестве живых микробных культур Bacillus subtllls 3 (ВКПМ № В-2335) и Bacillus- llchenlformls 31 (ВКПМ № В-2336) и наполнитель.

В качестве наполнителя препарат содержит предпочтительно сахарозу - желатиновую смесь.

Входящие в состав препарата живые микробные культуры характеризуются следующими свойствами.

B.subtilis 3 (ВКПМ Ns В-2335) - грампо- ложительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На сусло-агаре, среде Громыко, стрептомицетном агаре растут обильно, образуя матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями, легко снимаются петлей.

В мазках из колоний, выросших на МЛА, через 18 ч обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 2,7x0,8 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются. После роста на глю- козном агаре з протоплазме не обнаруживаются включения поли-/3-оксимасляной кис/юты. На МП Б культура образует пленку. Не растет в анаэробных условиях, не гидро- лизует мочзвину, не образует газ из нитратов в анаэробных условиях, не продуцирует

аргининдигидролазу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет в присутствии 7% NaCI. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину, Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью.

B.lfchenlformis 31 (ВКПМ № 8-2336) - грамположительные клетки, палочковидные, размером 2,5x0,6 мкм. Клетки подвижны, перитрихи, располагаются, в основном, в виде цепочек. Споры овальной формы, располагаются в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваются. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли- /3-оксимасляной кислоты.

На МПА колонии с тусклой грубой по- . верхностыо, непрозрачные, плотно прикреплены к агару; нередко на поверхности обнаруживается слизь. На МПБ образуется морщинистая пленка, иногда с кремовым оттенком.

Культура образует каталазу, характеризуется способностью расти на агаре в анаэробных условиях. Даёт положительную реакцию Фогес-Проскаузра, растет при 7% NaCI. Гидролизует крахмал, казеин, не гид- ролизует мочевину. Желатин разжижает медленно. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, в анаэробных условиях из нитратов образует газ. Продуцирует аргининдигидролазу, Me обладает коагулазной и лецитиназной активностью.

Пример 1. Из штаммов В. subtilis 3 и B.llcheniformis 31 с типичными морфологи- ческими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены три варианта препарата биоспорин с различным содержанием микробных клеток в составе препарата.

Вариант,

Препарат, содержащий

следующие компоненты, об.%:

Биомасса В.subtilis

ВКПМ №В-2335 4 млрд.

живых микробных клеток

в 1 мл физиологического

раствора47

Биомасса B.llcheniformis

ВКПМ №В-2336 200 млн.

живых микробных клеток

в 1 мл физиологического

раствора47

НаполнительОстальное

до 100

Вариант II,

Препарат, содержащий

следующие компоненты, об.%:

Биомасса B.subtllls ВКПМ

№В-2335 10 млрд. живых

микробных клеток в 1 мл

физиологического раствора 47

Биомасса B.llcheniformis

ВКПМ №В-2336 1,6 млрд.

живых микробных клеток в

1 мл физиологического

раствора47

НаполнительОстальное

. до 100

Вариант 111.

Препарат, содержащий

следующие компоненты, об.%:

Биомасса B.slbtltls ВКПМ

NsB-2335 16 млрд. живых

микробных клеток в 1 мл

физиологического

раствора47

Биомасса B.llcheniformis

ВКПМ МгВ-2336 3 Млрд.

живых микробных клеток

в 1 мл физиологического

раствора47

НаполнительОстальное

до 100

Результаты испытания вариантов препарата биоспорин НИ на безвредность и антагонистическую активность представлены в табл.1.

Как видно из представленных в табл. 1 данных, оптимальные количества живых микробных клеток в 1 мл составляют для В.subtilis ВКПМ №В-2335 4-10 млрд и для B.llchenlformis ВКПМ NbB-2336200млн-1,6 млрд при их объемном соотношении 47% : 47%. Дальнейшее .увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Пример 2. Эффективность препарата биоспорин, содержащее различные соотношения культур В.subtilis 3 и B.Hchenlformls 31 оценена путем воздействия их на Staph. aureus.

Результаты опытов представлены в табл.2.

Результаты табл. 2 также подтверждают, что наиболее оптимальным сочетанием культур В.subtilis ВКПМ NsB-2335 и B.llchenlformis ВКПМ №В-2336 является соотношение между ними соответственно 47% и 47%. При таком соотношении культур регистрируется наиболее быстрое и наиболее полное подавление стафилококка. Сходныв данные получены и при изучении воздействия различных вариантов препарата биоспорин на патогенные для человека эше- рихии, сальмонеллы, шигеллы и другие болезнетворные микроорганизмы.

Пример 3. Культуры, нходящие в состав препарата биослорин, безвредны для лабораторных животных. Введение даже значительных доз препарата .не вызывает, гибели и патологических изменений у животных. Против.опоказаний к применению препарата нет.

Результаты исследования безвредности штаммов B.subtllis 3 и B.llchenlformls 31, входящих в состав препарата биоспорин, представлены в табл . 3 и 4.

П р и м е р. 4. Антагонистическую активность биоспорина определяют методом отсроченного антагонизма, Для этого содержимое ампулы растворяют в 1 мл физиологического раствора, Полученную взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри с агазированиой средой Гаузе №2 (или в центре чашки) петлей диаметром 3,5 мм. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течение 72 ч. Затем к выросшей ассоциации культур подсевают штрихом посевной материал тест-микроорганизмов (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводят через 18 ч инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служит их параллельный посев на чашки с агаризованной средой Га- узе № 2 без исследуемой ассоциации культур.

Данные об антагонистической активности препарата биоспорин представлены в табл. А.

Пример 5. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов животных проводят по Лабинской (1968).

Опыты проводят на кроликах массой 2,5-2,8 кг, которым вводят перорально препарат на протяжении 10 дней. Пробы крови исследуют по фагоцитарной активности в различные сроки после пероральиого введения препарата (до опыта, через 5 дней, 10 дней и 15 дней и через один месяц).

Контрольным животным вводят перо-, рально физиологический раствор или яичный белок (200 мг).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов проводят в отношении различных текст-культур возбудителей желудочно- кишечных заболеваний человека.

Клинические наблюдения за экспериментальными животными, проведенные и процессе пероральиого введения препарата, а также на протяжении двух месяцев после окончания введения показывают: все животные остаются активными, полностью поедают пищевой рацион, физиологические 5 отправления у них не нарушаются, поведение обычное, изменений со стороны шерстного покрова не отмечается.

При исследовании показателе фагоцитоза (по отношению к энтеропатогенным

0 штаммам E.coll и сальмонеллам) отмечается существенное повышение афгоцитарной активности лейкоцитов кроликов, которым вводят препарат перорально (табл.5).

Число фагоцитируемых клеток E.coli

5 увеличивается почти вдвое, а число фагоцитируемых сальмонелл - в полтора раза. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови кроликов, получавших перорально препарат биоспорин, по отношению к разным бак0 териям представлены в табл. 6.

Таким образом полученные данные свидетельствуют о том, что пероральное введение препарата вызывает существенное повышение фагоцитарной активности лей5 коцитов животных.

Пример 6, С целью проверки .индукции интерферона биоспорин вводят через рот подопытным мышам весом 18-20 г. В контроле две группы по 30 животных. Одной

0 группе вводят физиологический раствор, другой - вирус болезни Ньюкасла (2-10 БОЕ/мл). Через различные промежутки времени мышей декапитируют и собирают пул сывороток от 5-6 животных одной группы.

5 Сыворотки центрифугируют в течение 1 мин при 3000 об/мин, затем обрабатывают 0,1N HCI (доводя рН их до 2,2) и выдерживают 3 сут при температуре 4°С. Затем рН сывороток доводят с помощью 0,1N NaOH до нейт0 рального значения..Эту операцию проводят с целью инактивации, индукторов интерферона, которые могут быть в сыворотке крови.

Для определения интерферонной ак5 тивности.полученных сывороток их титруют на культуре мышиных клеток линии «против вируса индуктора -вируса везикулярного стоматита (штамм Индиана). С этой целью пробы раститрованных сывороток наносят

0 на монослой клеток линиисг, выдерживают 18-20 ч при 37°С, затем отмывают их раствором Хенкса и вводят 100 ТЦДбО вируса индикатора. Учет проводят через 24 ч. За титр интерферона принимают наибольшее раз5 ведение сыворотки, которое угнетает репродукцию вируса в культуре клеток.

Для подтверждения интерферонной активности полученных сывороток их выдерживают на монослое клеток ав

присутствии антибиотика актиномицина Д, который используют в концентрации 5 мкг/мл в качестве ингибитора транскрипции. Затем в реакционную систему вносят вирус индикатора (100 ТЦДбо). Отсутствие антивирусного действия сывороток свидетельствует об их интерферонной активности.

Результаты опыта представлены в табл.7.

Данные, представленные в табл. 7, свидетельствуют о том, что пероральное введение препарата биоспорин существенно индуцирует продукцию эндогенного интерферона.

Пример 7. Препарат биоспорин применен на людях, показана его абсолютная безвредность, хорошая переносимость и высокая эффективность.

Пациент В-в, 57 лет. Жалобы на частый .стул с примесью слизи, боли в животе. При обследовании отмечается болезненность по ходу толстого кишечника. Диагноз - обострение хронического колита, дисбактериоз кишечника. Принимает биоспорин по 2 дозы 4 раза в день. Уже через несколько часов после применения препарата отмечается исчезновение тошноты, болей в животе. После 3 дней приема препарата состояние хорошее, стул нормализовался, живот мягкий, безболезненный. Таким образом препарат биоспорин оказывает выраженное лечебное действие, причем действие его наступает быстрее и значительно эффективнее, чем действие употребляемых пациентом ранее в подобных случаях препаратов (бисептола, фуразолидона и др.).

Таким образом препарат биоспорин может быть использован для профилактики и лечения дисбактериозов и других желудочно-кишечных заболеваний человека, вызванныхпатогеннымии0 условно-патогенными микроорганизмами. Формула изобретения Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека, содержащий живую культуру 5 штамма Bacillus Subtllls и наполнитель, о т- л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения эффективности препарата за счет усиления фагоцитарной активности крови и индукции интерферона, дополнительно со- 0 держит штамм Bacillus Ilchenlformls ВКПМ №В-2336 в количестве 2-10в-3-109 кл/мл. а в качестве культуры Bacillus Subtllls штамм Bacillus Subtllls ВКПМ NsB-2335 о количестве 4-109-16109 кл/мл при следующем соот- 5 ношении компонентов, об.%: Штамм Bacillus Subtills ВКПМ №8-2335 в количестве 4-103-16 109 кл/мл Штамм Bacillus llchenl- 0 form Is ВКПМ NsB-2336 в количестве 2«108-3-109 кл/мл Наполнитель

47

47 До

100

Использование: медицина, дисбактери- озы, профилактика и лечение желудочно-кишечных заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Сущность изобретения: живые штаммы Bacillus Subtiiis ВКПМ № В- 2335 и Bacillus llchenlformis ВКПМ №В-233б с типичными свойствами смешивают в количестве соответственно 4-109-16-109 и 2-108-3 «109 кл/мл по 47 об.% каждого, доводят наполнителем до 100%. Препарат проверяют на безвредность и антагонистическую активность, определяют фагоцитарную активность лейкоцитов и индукцию интерферона, Препарат испытан на людях, 7 табл.

Таблица 1

taблицa2

и

12

1722502

Таблица.

Определение токсичности фильтратов и центрифугатов культур, выращенных на среде Гаузе W 2 при 37°С в течение

8 сут

12

Примечание. Интервалы значений составляли рт + 0,01 ,21.

Таблицаб

Таблица 7