СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ УГЛЕВОДОВ И КРАХМАЛА ИЗ ОДНОЙ НАВЕСКИ Российский патент 2010 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции растений для изучения углеводного статуса тканей и органов растений в онтогенезе; в пищевой и фармацевтической промышленности для оценки качества урожая и лекарственного сырья по содержанию крахмала и растворимых сахаров.

Аналогами способа определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески являются следующие методики.

1. Определение растворимых углеводов фотометрически с пикриновой кислотой (модификация Соловьева): Практикум по агрохимии // Под редакцией акад. РАСХН Минеева В.Г. - М.: Изд-во МГУ, 2001. 2-изд. С.419-422.

2. Определение крахмала в растениях методом кислотного гидролиза: Практикум по агрохимии // Под редакцией Ягодина Б.А. - М.: Агропромиздат, 1987. С.191-197.

В ходе роста, развития, созревания, послеуборочного дозревания и хранения сельскохозяйственной продукции растворимые (сахара) и нерастворимые (крахмал) углеводы претерпевают взаимные превращения, вследствие чего важно для оценки качества продукции одновременно определять количество обоих компонентов. Методика №1 позволяет определять только содержание растворимых углеводов, в то время как методика №2 - только содержание крахмала.

Предлагаемый способ позволяет определять в одной навеске растительного материала количество моносахаров, сумму водорастворимых углеводов и количество крахмала, что ранее было невозможно. Данная методика сравнительно проста, быстра и надежна.

Среди углеводов различают моносахариды, дисахариды и полисахариды. Моносахариды хорошо растворимы в воде. Ди- и полисахариды образуются из моносахаридов в процессе полимеризации. Большинство из них (вплоть до инулина) также хорошо растворимы в воде. Крахмал нерастворим в воде или образует коллоидные растворы.

Одновременное определение разных форм углеводов в растительном материале открывает более широкие возможности для установления закономерностей обмена этих веществ при вегетативном росте, формировании урожая, созревании и хранении сельскохозяйственной продукции, а также при адаптации растений в новых условиях произрастания и выживания в неблагоприятных условиях среды.

Ход работы

Из анализируемого растительного материала формируют среднюю пробу, из которой выделяют навеску массой 2-5 г, в зависимости от ожидаемого содержания углеводов, измельчают в ступке до однородной массы с добавлением дистиллированной воды, переносят в колбу емкостью 100 мл, доливают до половины дистиллированной водой и ставят на водяную баню. Экстракцию ведут при 40-50°С в течение 1 часа.

После экстракции растворимых углеводов проводят осаждение белков в растворе. Для этого при анализе зерна и зеленых частей растений в колбу с экстрактом приливают 5-6 капель 10%-ного уксуснокислого свинца и 12-14 капель насыщенного раствора Na₂SO₄, тщательно перемешивают и оставляют на 20 мин для созревания осадка, затем доводят до метки дистиллированной водой.

После осаждения белков одержимое колбы переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 мин при 4000 g (об./мин). Надосадочную жидкость переливают в чистую колбу емкостью 100 мл. Осадок, сформировавшийся после центрифугирования, тщательно переносят в другую колбу емкостью 100 мл, приливают 50 мл 2%-ного НСl и ставят в кипящую водяную баню на 1,5-2 часа для гидролиза крахмала. Окончание гидролиза устанавливают по отсутствию синего окрашивания гидролизуемого раствора с раствором йода в KJ: для проверки берут 2-3 капли гидролизата и добавляют 1 каплю раствора йода.

По окончании гидролиза крахмала повторно проводят осаждение белков 10%-ным уксуснокислым свинцом, доливают дистиллированной водой до метки и оставляют на 20 мин для созревания осадка.

Фильтруют раствор через бумажный фильтр средней плотности в колбу на 100 мл.

Определение моносахаридов

В сухую химическую пробирку емкостью 20-40 см³ берут пипеткой 1-3 см³ надосадочной жидкости (аликвоту), полученной после центрифугирования (в зависимости от ожидаемого количества водорастворимых углеводов). Если аликвота менее 3 см³, то до этого объема доводят дистиллированной водой.

В пробирку приливают 3 см³ насыщенного раствора пикриновой кислоты и 3 см³ 20%-ного раствора На₂СО₃ (соотношение компонентов 1:1:1), тщательно перемешивают и ставят пробирку в кипящую водяную баню на 30 мин. Уровень воды должен быть не ниже 2/3 высоты объема смеси в пробирках.

Через 30 мин пробирки вынимают и охлаждают, содержимое пробирок через воронку без фильтра переносят в мерные колбы на 50 см³, ополаскивая несколько раз пробирки дистиллированной водой. Содержимое колбочек доводят до метки дистиллированной водой. Раствор колориметрируют (спектрофотометрируют) при длине волны 490 нм.

Контрольный раствор готовят одновременно. В колбу 100 см³ наливают 50 см³ дистиллированной воды, добавляют 0,7 см³ уксуснокислого свинца и 1,4 см насыщенного раствора Na₂SO₄, доводят до метки дистиллированной водой. Из колбы берут 3 см раствора в пробирку, приливают 3 см насыщенного раствора пикриновой кислоты и 3 см³ 20%-ного раствора Na₂CO₃, перемешивают, выдерживают 30 мин в кипящей водяной бане. Охлаждают и переносят в мерную колбу на 50 см³. Раствор, полученный таким образом, используют как раствор сравнения при колориметрировании.

Расчет:

где С - количество глюкозы по графику, мг; Р - разведение (100/3); Н - навеска материала, г.

Определение суммы водорастворимых углеводов

В сухую пробирку пипеткой берут 1 см³ надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования, прибавляют 1 см³ 10%-ного раствора НС1 и ставят в кипящую водяную баню на 5 мин для гидролиза полисахаридов. После окончания гидролиза содержимое пробирок охлаждают, добавляют 1 см³ 20%-ного раствора Na₂CO₃ для нейтрализации соляной кислоты. Добавляют в пробирку 3 см³ насыщенного раствора пикриновой кислоты и 3 см³ 20%-ного раствора Nа₂СО₃, перемешивают. Ставят пробирку в кипящую водяную баню на 30 мин, охлаждают, через воронку без фильтра переносят в мерную колбу на 50 см³, доводят до метки дистиллированной водой, колориметрируют при 490 нм.

Сумма водорастворимых углеводов рассчитывается по формуле, приведенной выше.

Количество полисахаридов определяется по разнице: содержание полисахаридов (%) = (сумма водорастворимых углеводов % минус содержание моносахаридов %)×0,95, где 0,95 - коэффициент пересчета глюкозы в полисахариды.

Определение содержания крахмала

В сухую химическую пробирку пипеткой берут 1-3 см³ фильтрата, полученного после гидролиза крахмала (в зависимости от ожидаемого количества). Если аликвота менее 3 см³, то до этого объема доводят дистиллированной водой. Далее поступают как при определении моносахаридов.

Содержание крахмала определяют по формуле:

где С - количество глюкозы по графику, мг; Р - разведение (100/3); Н - навеска материала, г; К - коэффициент пересчета глюкозы в крахмал.

Построение калибровочного графика

1 г высушенной в течение 2 ч при температуре 60-70°С глюкозы растворяют в 1 дм дистиллированной воды. Для построения графика набирают в пробирки 0,2; 0,4;

0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6 см³ стандартного раствора, доводят до 3 см³ водой и далее поступают так же, как в случае определения моносахаридов. При построении графика и колориметрировании углеводов сравнение ведут по контрольному раствору.

Реактивы

1. Насыщенный раствор пикриновой кислоты: 20-30 г пикриновой кислоты заливают примерно 500 см³ дистиллированной воды. Тщательно перемешивают в течение 5-10 мин. Для работы из этого объема отфильтровывают необходимое количество надосадочной жидкости, а в исходный раствор периодически доливают воду, до тех пор, пока на дне есть осадок не растворившейся пикриновой кислоты. Раствор в емкости из темного стекла хранится неопределенно долго.

2. 20%-ный раствор Na₂CO₃: 200 г соды растворяют в 800 см³ дистиллированной воды, после растворения соды раствор фильтруют.

3. 10%-ный раствор РbСН₃СООН: 10 г уксуснокислого свинца растворяют в 100 см³ дистиллированной воды.

4. 10%-ный раствор НС1: 236,8 см³ концентрированной НСl (d=1,19) выливают в мерную колбу объемом 1 дм³, предварительно налив туда 500 см³ воды, доводят до метки.

5. 2%-ный раствор НС1: 45,2 см³ концентрированной НСl выливают в мерную колбу объемом 1 дм³, предварительно налив туда 500 см³ воды, доводят до метки.

6. Насыщенный раствор Na₂SO₄: 165 г Na₂SO₄ растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды.

Для апробации предлагаемого способа определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески был проанализирован усредненный образец из запасающих чешуи луковиц Tulipa bifloriformis L. (образцы отобраны осенью 2003 г.) в 5-кратной повторности. Полученные результаты статистически обработаны и представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Содержание моносахаридов, водорастворимых полисахаридов и крахмала в луковицах Tulipa bifloriformis L. в 1 мг/г сухого вещества.   Содержание моносахаридов Содержание водорастворимых полисахаридов Содержание крахмала Значения 8,83 30,40 563,10 9,01 26,95 598,20 13,90 21,96 506,10 9,51 32,30 443,10 11,30 30,40 390,40 Среднее значение, мг/г 10,51 28,40 500,18 Среднее квадратическое отклонение 2,13 4,09 79,55 Средняя ошибка 0,95 1,83 35,51 Интервал среднего результата, мг/г 10,51±0,95 28,40±1,83 500,18±35,51 Показатель точности, % 9,04 6,43 7,10 Коэффициент вариации, % 20,27 14,40 15,90

Как видно из табл.1, показатель точности и коэффициент вариации предлагаемого способа определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески не превышают допустимых значений (Р% меньше 10%; V% меньше 25-30%).

Для оценки точности предлагаемого способа определения крахмала было также определено содержание крахмала по методу кислотного гидролиза. Анализы проводились в 3-кратной повторности на усредненном образце клубней картофеля сорта Никулинский (урожай 2003 г.). Результаты статистически обработаны и представлены в табл.2.

Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ определения содержания крахмала позволяет получать результаты, практически совпадающие с показателями, полученными методом кислотного гидролиза. При этом средняя ошибка, показатель точности анализа и коэффициент вариации данных, полученных предлагаемым способом определения содержания крахмала, ниже, чем аналогичные показатели, полученные методом кислотного гидролиза.

Таблица 2.
Содержание крахмала в клубнях картофеля сорта Никулинский в % от сырой массы.   Содержание крахмала по предлагаемому способу определения Содержание крахмала по методу кислотного гидролиза Значения 14,28 13,80 13,00 13,70 14,63 17,40 Среднее значение, мг/г 13,97 14,97 Среднее квадратическое отклонение 0,86 2,11 Средняя ошибка 0,50 1,22 Интервал среднего результата, мг/г 13,97±0,50 14,97±1,22 Показатель точности, % 3,56 8,15 Коэффициент вариации, % 6,16 14,09

Результаты, приведенные в табл. 1 и 2, свидетельствуют, что предлагаемый способ определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески может применяться в качестве унифицированного метода при работе с растительными объектами. Статистические характеристики предлагаемого способа свидетельствуют о надежности и воспроизводимости результатов анализа.

Применение предлагаемого способа определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески позволило провести одновременное определение разных форм углеводов в растительном материале таких объектов, как лапчатка белая (Potentilla alba L), шалфей мускатный (Salvia Sclarea L.), подснежник снежный (Galanthus nivalis L.), дикие виды и культурные сорта тюльпанов. Результаты этих исследований опубликованы в следующих работах:

1. Воронкова Т.В. Пул запасных углеводов и элементы анатомического строения зимующих растений шалфея мускатного // VI съезд об-ва физиологов растений России. Матер. Международн. научн. конф. «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Ч.2. Сыктывкар, Респ. Коми, 2007. С.79-81.

2. Воронкова Т.В., Семенова М.В., Олехнович Л.С. Динамика фитогормонов и углеводов в луковичных чешуях подснежника снежного (Galanthus nivalis L.) в зимний период при интродукции в Средней полосе России // Матер. Международн. научн. конф. «Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства» Т.2. Минск: Эдит В.В, 2007. С.107-109.

3. В.В.Кондратьева, О.В.Шелепова, Т.В.Воронкова, Н.Н.Данилина. Физиолого-биохимические основы многоцветковости у различных групп и сортов культурных и видовых тюльпанов. // Матер. V Международн. научной конференции «Цветоводство без границ». Харьков, 2006. С.66-69.

4. Шелепова О.В., Воронкова Т.В. Динамика углеводного обмена, баланса элементов минерального питания и анатомическое строение корневищ Potentilla alba L. в процессе зимовки // Матер. Международн. научн. конф. «Теоретические и прикладные аспекты интродукции растений как перспективного направления развития науки и народного хозяйства». Т.2. Минск: Эдит В.В, 2007. С.166-167.

Способ определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески относится к сельскому хозяйству и может быть использован в селекции растений для изучения углеводного статуса тканей и органов растений в онтогенезе, а также в пищевой и фармацевтической промышленности для оценки качества урожая и лекарственного сырья, так как позволит одновременно определять содержание крахмала и растворимых сахаров. Предложенный способ определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески растительного материала основан на термической экстракции водным раствором измельченной навески с последующим центрифугированием и кислотным гидролизом осадка, содержащего крахмал. Определение содержания углеводов проводится в двух растворах: в надосадочной жидкости - водорастворимых углеводов и в растворе после гидролиза осадка - крахмала, колориметрически по интенсивности изменения окраски вследствие химического взаимодействия углеводов с пикриновой кислотой в щелочной среде при нагревании в кипящей водяной бане, а расчет ведется по калибровочному графику в сравнении с контрольным раствором. Данная методика проста, быстра и надежна. 2 табл.

Способ определения водорастворимых углеводов и крахмала из одной навески растительного материала, основанный на термической экстракции водным раствором измельченной навески с последующим центрифугированием и кислотным гидролизом осадка, содержащего крахмал, при этом определение содержания углеводов проводится в двух растворах: в надосадочной жидкости - водорастворимых углеводов, и в растворе после гидролиза осадка - крахмала, колориметрически по интенсивности изменения окраски вследствие химического взаимодействия углеводов с пикриновой кислотой в щелочной среде при нагревании в кипящей водяной бане, а расчет ведется по калибровочному графику в сравнении с контрольным раствором.