СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КРАХМАЛА ПО СОДЕРЖАНИЮ ГЛЮКОЗЫ С УЧЕТОМ ИНДИВИДУАЛЬНОГО КОЭФФИЦИЕНТА ПЕРЕСЧЕТА В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2010 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве крахмалосодержащих растений (картофеля, луковичных, бобовых и злаковых культур) для выявления сортовых и видовых отличий, а также оценки качества сырья по содержанию крахмала для пищевой, винокуренной и фармацевтической промышленности.

Аналогами способа определения крахмала по содержанию глюкозы в растительном материале являются методики:

1. Определение крахмала в растениях методом кислотного гидролиза: Практикум по агрохимии. // Под редакцией Ягодина Б.А. М.: Агропромиздат, 1987. С.191-197.

2. Определение растворимых углеводов фотометрически с пикриновой кислотой (модификация Соловьева): Практикум по агрохимии. // Под редакцией акад. РАСХН Минеева В.Г. М.: Изд-во МГУ, 2001. 2-изд. С.419-422.

Крахмал принадлежит к сложным углеводам, является наиболее распространенным видом запасных веществ и накапливается в запасающих органах растений в виде крахмальных зерен. Основными составляющими компонентами крахмальных зерен являются амилоза и амилопектин - полимеры глюкозы. Кроме того, в его состав входят жирные кислоты, минеральные соединения и вода, соотношение которых специфично для разных видов и сортов растений.

Ранее предложенные методики определения содержания крахмала основаны на его гидролизе и определении в гидролизате содержания глюкозы с последующим пересчетом с использованием единого коэффициента, что зачастую приводит к большим отклонениям полученных таким способом результатов от реальных данных. Созданный нами способ определения крахмала предполагает использование индивидуального коэффициента пересчета содержания глюкозы в крахмал для каждого образца растительного материала.

Ход работы

Извлечение крахмала из растительного материала

Растительный материал (50-100 г) измельчают, промывают водой через несколько слоев марли в конический (с узким дном и широким горлышком) химический стакан и оставляют для отстаивания крахмала. Затем надосадочную жидкость сливают. Для удаления белков крахмал заливают 10%-ным раствором NaCl и дают отстояться в течение 2 час. Жидкость сливают, а крахмал отмывают от хлористого натрия сначала холодной водой, а затем дистиллированной путем взмучивания и последующего отстаивания осадка крахмала.

Определение глюкозы в крахмале

Полученный крахмал высушивают в течение 2 час при температуре 40-50°С. Навеску массой 0,1±0,0001 г помещают в колбу емкостью 100 см³, заливают 50 мл 2%-ной HCl и помещают на кипящую водяную баню на 1,5 часа для гидролиза.

По окончании гидролиза колбу вынимают из бани, охлаждают и проводят осаждение белков в растворе. Для этого в колбу добавляют 5-6 капель 10%-ного уксуснокислого свинца и 12-14 капель насыщенного раствора Na₃SO₄, тщательно перемешивают и оставляют на 20 мин для формирования осадка. Затем содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и фильтруют раствор через сухой фильтр средней плотности.

В сухую химическую пробирку емкостью 20-40 см³ берут 1 см³ фильтрата, добавляют 2 см дистиллированной воды, 3 см³ насыщенного раствора пикриновой кислоты и 3 см³ 20%-ного раствора соды. Тщательно перемешивают и помещают пробирку в кипящую водяную баню на 30 мин. Уровень воды должен быть не ниже 2/3 высоты объема смеси в пробирке.

Через 30 мин пробирку вынимают и охлаждают. Содержимое пробирки переносят в мерную колбу на 50 см³, доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают. Содержание глюкозы в растворе определяют колориметрически (спектрофотометрически) при 490 нм.

Одновременно готовят контрольный раствор. В колбу емкостью 100 см³ приливают 50 см³ 2%-ного раствора HCl, добавляют 5-6 капель уксуснокислого свинца и 10-12 капель насыщенного раствора Na₂SO₄, доводят до метки дистиллированной водой. Из колбы берут 1 см³ раствора в пробирку, добавляют 3 см³ насыщенного раствора пикриновой кислоты и 3 см³ 20%-ного раствора соды. Перемешивают, выдерживают 30 мин на кипящей водяной бане, охлаждают, переносят в мерную колбу на 50 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный таким образом раствор используют как контрольный при колориметрировании.

Расчет

Содержание глюкозы в крахмале -

С - количество глюкозы по графику, мг; Р - разведение (100/3); Н - навеска материала, г.

Коэффициент пересчета количества глюкозы в крахмал -

А - содержание глюкозы в крахмале (%).

Построение калибровочного графика

1 г просушенной при 60-70°С глюкозы растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды. Для построения графика набирают в пробирки 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6 см³ стандартного раствора, доводят до 3 см³ водой и далее поступают, как при определении глюкозы. При построении графика и определении глюкозы в крахмале сравнение ведут по контрольному раствору.

Реактивы

1. Насыщенный раствор пикриновой кислоты: 20-30 г пикриновой кислоты заливают примерно 500 см³ дистиллированной воды. Тщательно перемешивают в течение 5-10 мин. Для работы из этого объема отфильтровывают необходимое количество надосадочной жидкости, а в исходный раствор периодически доливают воду до тех пор, пока на дне есть осадок нерастворившейся пикриновой кислоты. Раствор в емкости из темного стекла хранится неопределенно долго.

2. 20%-ный раствор Na₂CO₃: 200 г соды растворяют в 800 см³ дистиллированной воды, после растворения соды раствор фильтруют.

3. 10%-ный раствор PbCH₃COOH: 10 г уксуснокислого свинца растворяют в 100 см³ дистиллированной воды.

4. 10%-ный раствор HCl: 236,8 см³ концентрированной HCl (d=1,19) выливают в мерную колбу объемом 1 дм³, предварительно налив туда 500 см³ воды, доводят до метки.

5. 2%-ный раствор HCl: 45,2 см³ концентрированной HCl выливают в мерную колбу объемом 1 дм³, предварительно налив туда 500 см³ воды, доводят до метки.

6. Насыщенный раствор Na₂SO₄: 165 г Na₂SO₄ растворить в 1 дм³ дистиллированной воды.

Для апробации предлагаемого способа определения содержания крахмала по содержанию глюкозы с учетом индивидуального коэффициента пересчета были проанализированы в 6-кратной повторности каждые 4 следующих образца крахмала, предварительно высушенные в течение 2-х часов при температуре 70°С:

а) - образец 1 - растворимый фирмы Merck-starch soluble, cat. №1252;

б) - образец 2 - кукурузный фирмы VINH THUAN-REF.: 107603, Вьетнам;

в) - образец 3 - картофельный фирмы ООО "МКФ Группа Продекс", ГОСТ 7699-78;

г) - образец 4 - усредненный образец из запасающих чешуи луковиц тюльпана сорта Crystal Beauty.

Полученные результаты статистически обработаны и представлены в таблице.

Содержание крахмала в стандартных и опытном образцах в % от сухой массы   Образец 1 Образец 2 Образец 3 Образец 4 I* II** I* II** I* II** I* II** Значения 98,51 79,02 99,64 95,40 94,85 69,57 99,00 99,00 94,71 69,30 99,19 98,10 96,16 72,36 99,96 88,20 99,99 91,08 96,16 72,36 96,94 74,25 88,10 58,95 99,44 83,25 99,19 98,10 97,75 76,50 98,04 102,60 96,00 72,00 99,64 95,40 97,24 75,06 98,6 100,80 99,91 92,70 96,39 72,9 95,84 71,64 92,71 65,70 Среднее значение 98,09 81,23 98,37 88,71 96,46 73,23 96,06 85,88 Среднее квадратическое отклонение 2,22 9,66 1,64 12,52 0,96 2,30 4,25 17,38 Средняя ошибка 0,91 3,94 0,67 5,11 0,39 0,94 1,74 7,09 Интервал среднего результата, % 98,09±0,91 86,23±3,94 98,37±0,67 88,71±5,11 96,46±0,39 73,23±0,94 96,06±1,74 85,88±7,09 Показатель точности (Р), % 0,93 4,85 0,68 5,76 0,41 1,28 1,81 8,26 Коэффициент вариации (V), % 2,27 11,89 1,66 14,11 1,00 3,14 4,42 20,24

Примечание: I* - содержание крахмала, полученное по предлагаемому нами способу с учетом индивидуального коэффициента пересчета содержания глюкозы в крахмал; II** - содержание крахмала, полученное по методу кислотного гидролиза с использованием постоянного коэффициента пересчета содержания глюкозы в крахмал.  

Как видно из таблицы, предлагаемый нами способ определения крахмала позволяет получать более репрезентативные результаты: средняя ошибка, показатель точности опыта и коэффициент вариации данных, полученные апробируемым способом, значительно меньше, чем аналогичные показатели, полученные методом кислотного гидролиза. При этом показатель точности и коэффициент вариации предлагаемого способа значительно ниже пределов допустимых значений (Р% меньше 10%; V% меньше 25-30%). Анализ опытного образца (№4 - усредненный образец из запасающих чешуи луковиц тюльпана сорта Crystal Beauty) предлагаемым нами способом также позволил получить более точные результаты по сравнению с методом кислотного гидролиза.

Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый способ определения крахмала по содержанию глюкозы с учетом индивидуального коэффициента пересчета может применяться в качестве унифицированного метода при работе с растительными объектами. Статистические характеристики предлагаемого способа свидетельствуют о надежности и воспроизводимости результатов анализа.

Применение предлагаемого способа определения крахмала по содержанию глюкозы с учетом индивидуального коэффициента пересчета позволило провести точное определение содержания крахмала в таких растительных объектах, как луковицы тюльпанов, клубни 3 сортов картофеля разных сроков уборки и др.

Источники информации

1. Фарук А.А., Кириченко Е.Б., Воронкова Т.В., Шелепова О.В., Олехнович Л.С. Динамика пулов углеводов и полифенолов при созревании клубней картофеля: сортовая специфика формирования патоустойчивости. // Доклады Академии наук. 2004. Т.396. №5. С.714-717.

2. Кондратьева В.В., Шелепова О.В., Воронкова Т.В., Данилина Н.Н. Физиолого-биохимические основы многоцветковости у различных групп и сортов культурных и видовых тюльпанов. // Матер. V Межд. Научной конференции «Цветоводство без границ». Харьков, 2006. С.66-69.

Способ определения крахмала по содержанию глюкозы с учетом индивидуального коэффициента пересчета относится к сельскому хозяйству и может быть использован в селекции и семеноводстве крахмалосодержащих растений (картофеля, луковичных, бобовых и злаковых культур) для выявления сортовых и видовых отличий, а также для оценки качества сырья по содержанию крахмала для пищевой, винокуренной и фармацевтической промышленности. В предложенном способе крахмал извлекают из образца растительного материала, очищают от примесей, высушивают и подвергают кислотному гидролизу до глюкозы, определение содержания которой проводится колориметрически по интенсивности изменения окраски раствора вследствие химического ее взаимодействия с пикриновой кислотой в щелочной среде при нагревании в кипящей водяной бане. Расчет содержания глюкозы в крахмале проводят по калибровочному графику в сравнении с контрольным раствором и полученный результат используют для расчета индивидуального коэффициента пересчета глюкозы в крахмал по формуле: , где А - содержание глюкозы в крахмале (%), а содержание крахмала в образце (%)=K×A. Созданный способ позволяет более точно определять количество крахмала в растительном материале, сравнительно прост, быстр и надежен. 1 табл.

Способ определения крахмала, извлеченного из образца растительного материала, очищенного от примесей, высушенного и подвергнутого кислотному гидролизу до глюкозы, определение содержания которой проводится колориметрически по интенсивности изменения окраски раствора вследствие химического ее взаимодействия с пикриновой кислотой в щелочной среде при нагревании в кипящей водяной бане, а расчет содержания глюкозы в крахмале проводят по калибровочному графику в сравнении с контрольным раствором и полученный результат используют для расчета индивидуального коэффициента пересчета глюкозы в крахмал по формуле: , где A - содержание глюкозы в крахмале (%), а содержание крахмала в образце (%)=K·A.