КОМПОЗИЦИЯ С ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2004 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунофармакологии, и может быть использовано в качестве основы для создания комбинированных лекарственных препаратов - иммуностимуляторов.

В качестве иммуностимуляторов используют различные лекарственные средства, полученные как из природного сырья (тималин, нуклеинат натрия, продигиозан), так и путем химического синтеза (левамизол, метилурацил). Все эти препараты обладают рядом общих положительных свойств: способностью повышать общую сопротивляемость организма, стимулировать неспецифические факторы защиты. Однако влияние этих средств на иммунитет ограничивается эффектами на определенные иммунные реакции - преимущественно на Т-клеточный иммунитет (например, тималин), либо на В-клеточный (гуморальный) иммунитет, либо на фагоцитарное звено (продигиозан). Препараты, обладающие стимулирующим влиянием на все звенья иммунитета, участвующие в полноценном иммунном ответе, т.е. одновременно влияющие на фагоцитарное звено, Т- и В-системы иммунитета, отсутствуют. По-видимому, на данном этапе развития иммунофармакологии этим требованиям могут отвечать композиции из препаратов, обладающие разносторонним влиянием на системы иммунитета.

Известны препараты эхинацеи пурпурной, представляющие собой спиртовые настойки травы, а также препараты на основе свежего сока растения. Получены данные, подтверждающие способность препаратов из эхинацеи влиять на иммунный ответ организма, в основном на фагоцитарное звено [1, 2]. По данным [2] при хронических неспецифических заболеваниях органов дыхания (пневмония, бронхиты) под влиянием эхинацеи у людей наблюдали повышение исходно сниженных показателей гуморального и клеточного иммунитета. Вместе с тем, по литературным данным в экспериментах на животных твердоустановленными являются эффекты эхинацеи на врожденный (естественный) иммунитет (увеличение количества и функциональной активности гранулоцитов, моноцитов/макрофагов и натуральных киллерных клеток), на продукцию цитокинов. Описаны стимулирующие эффекты эхинацеи на приобретенный (клеточный) иммунитет, тогда как данные по гуморальному иммунному ответу противоречивы [3, 4]. Более того, по данным [5] при определенных условиях выявляется иммуносупрессивный эффект эхинацеи на антителообразование у крыс.

Известно применение эхинацеи в составе лекарственного средства с иммуностимулирующим и противовоспалительным действием [6]. В описанных лекарственных средствах эхинацея выступает в качестве активного начала. Известна композиция [7] с иммуностимулирующим действием, где каждый из компонентов проявляет себя как агент, активно воздействующий на иммунную систему. Все компоненты (экстракт эхинацеи - Echinacea Angustofolia), лизоцим, бромелайн) являются продуктами природного происхождения.

Имеются данные о возникновении побочных эффектов в результате совместного применения известных химических препаратов и растительных лекарственнных средств (снижение концентрации в крови синтетических препаратов, возникновение бредовых состояний, межменструальных кровотечений, снижение кровяного давления) [8]. Не отмечено возникновения каких-либо побочных эффектов совместного применения препаратов эхинацеи на фармакологическую активность синтетических лекарственных средств.

Известен лекарственный препарат Трекрезан (трис-(2-оксиэтил)-аммоний-орто-крезоксиацетат) - получен химическим путем [9], который является адаптогеном широкого спектра действия. Есть данные об иммунотропных свойствах трекрезана [10] и о его иммуностимулирующей активности в отношении гуморального иммунного ответа [11].

Задачей предлагаемого изобретения является получение нового лекарственного средства, активно воздействующего на все звенья иммунного ответа (фагоцитарные реакции, клеточный и гуморальный иммунный ответ).

Указанная задача решается созданием композиции из двух лекарственных средств.

Два известных препарата, один из которых имеет растительное происхождение и получен из эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea) - спиртовая настойка эхинацеи, а другой получен синтетическим путем - трекрезан (трис-(2-оксиэтил)-аммоний-орто-крезоксиацетат), смешиваются между собою следующим образом: в 1 мл настойки эхинацеи растворяется трекрезан в количестве 100 мг (соответственно в 1 л настойки эхинацеи растворяется 100 г трекрезана и т.д. в аналогичной пропорции). Иммуностимулирующие свойства композиции проверялись в экспериментах на мышах. Однократная доза на одну мышь составляла: 1 мкл композиции (1 мкл настойки эхинацеи, содержаший трекрезан в дозе 5 мг/кг).

В качестве спиртовой настойки эхинацеи пурпурной использовалась настойка Галено Фарм (Echinacea-Galeno Pharm). Трекрезан был предоставлен Иркутским институтом химии СО РАМН.

В работе использовали здоровых половозрелых животных мышей-гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10 недельного возраста, массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром). Средние величины (2-3 опыта, не менее 10 мышей) сравнивали с помощью непараметрического критерия U Манна-Уитни.

Пример 1. IgM антителообразование in vivo. Опытной группе животных вводили внутрижелудочно ежедневно в течение 5 дней композицию (1 мкл композиции, содержащей трекрезан в дозе 5 мг/кг, растворяли в 0,5 мл воды). Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду) в объеме 0,5 мл. Кроме того, еще одной группе животных вводили трекрезан в дозе 5 мг/кг (в 0,5 мл воды в течение 5 дней), другой - настойку эхинацеи (1 мкл растворяли в 0,5 мл воды; вводили 5 дней). В день последнего введения композиции животных иммунизировали внутривенно эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 0,5×10⁷/мышь. Количество IgM АОК в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом Cunningham (1968). Результаты выражали в абсолютном количестве IgM АОК в селезенке (таблица 1).

Как видно из данных таблицы 1, настойка эхинаци практически не влияет на первичный гуморальный иммунный ответ, трекрезан на 59% стимулирует антителообразование, а введение композиции (достоверно) в 2,2 раза стимулирует гуморальный иммунитет по сравнению с контролем.

Пример 2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo. Опытной группе животных вводили внутрижелудочно ежедневно в течение 5 дней: композицию (1 мкл) в объеме 0,5 мл воды, настойку эхинацеи (1 мкл в 0,5 мл воды) и трекрезан (5 мг/кг в 0,5 мл воды). В день последнего введения композиции сенсибилизировали мышей внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл, на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowie, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах (таблица 2, 3).

Как видно из данных таблицы 2, трекрезан в дозе 5 мг/кг стимулирует ГЗТ на 32%, настойка эхинацеи стимулирует ГЗТ на 39%, а композиция - на 51% по сравнению с контролем.

Пример 3. Fc-рецептор опосредованный фагоцитоз. Фагоцитарную активность макрофагов под влиянием композиции определяли спектрофотометрическим микрометодом (Rummage et al., 1985). Опытной группе животных вводили внутрижелудочно ежедневно в течение 5 дней композицию 1 мкл в объеме 0,5 мл воды, трекрезана в дозе 5 мг/ кг в 0,5 мл воды и настойку эхинацеи 1 мкл в 0,5 мл воды. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). В день последнего введения композиции животным внутрибрюшинно вводили 10%-ный р-р пептона. На 4-е сутки после забоя мышей получали клетки перитонеального экссудата. Макрофаги брюшной полости, стимулированные пептоном, культивировали в концентрации 2×10⁶/мл в течение 24 часов в 24-луночных пластиковых планшетах в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина при температуре 37°С в атмосфере высокой влажности с содержанием 5% СО₂ в воздухе. Затем к монослою макрофагов добавляли 1 мл 2,5% опсонизированных ЭБ и культивировали в тех же условиях в течение 40 минут. После этого нефагоцитированные ЭБ лизировали гипотоническим раствором NaCl. Для разрушения макрофагов и фагоцитированных ими ЭБ в каждую лунку добавляли 0,6 мл 1%-ного р-ра содиум додецил сульфата (детергент), после чего количество гемоглобина, вышедшего из разрушенных ЭБ, определяли спектрофотометрически на “MULTISCAN” при длине волны 405 нм. Фагоцитарная активность определялась индивидуально у каждой мыши.

Как видно из данных таблицы 3, настойка эхинацеи на 20% по сравнению с контролем стимулирует фагоцитоз (р<0.01), композиция при введении в течение 5 дней достоверно на 52% по сравнению с контролем стимулирует фагоцитоз (р<0.01). Трекрезан не оказывает влияния на фагоцитоз.

Таким образом, проведенные нами исследования и полученные нами данные показали достоверную возможность получения нового уникального иммуноактивного средства, которое обладает стимулирующей активностью в отношении всех трех видов иммунитета - гуморального (В-лимфоциты - антителообразование), клеточного (Т-лимфоциты - гиперчувствительность замедленного типа), фагоцитарного (макрофаги - фагоцитарная активность). Установленные свойства заявленной композиции позволят получить препарат с уникальными лечебными свойствами для коррекции расстройств иммунной системы супрессорного характера.

Литература.

1. 3аявка ЕПВ 0464298, МКИ А 61 К 35/78, oпyбл. 08.01.92 г.

2. Патент РФ 2137490, МКИ А 61 К 35/78, oпyбл. 20.09.99 г.

3. J. Leukoc Biol. 2000 oct; 68 (4):503-10. Immunopharmacological activity of Echinacea preparation following simulated digestion on murine macrophages and human blood mononuclear cells. Rininger J.A., Kickner S. et al.

4. Biochem. Pharmacol, 2000, Jul. 15; 60(2):155-8. Use of echinacea in medicine. Percival SS.

5. Immunopharmacol Immunoxicol 2001, Aug; 23(3):411-21. Multiple immune function in rats fed Echinacea extracts.

6. Патент 2180586.

7. Патент США 6096307, опубл. 01.08.2000 г.

8. Drugs 2001; 61 (15):2163-75. Interaction between herbal medicines and prescribed drugs: a systematic review. Izzo A.A, Emst E.

9. A.с. СССР 515742, МКИ С 07 С 215/40, 1973 г.

10. Патент 2098088, МКИ А 61 К 31/205, С 07 С 215/40, опубл. 10.12.97 г.

11. В.С.Ширинский и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1993, № 3, с.42.

Изобретение относится к области создания лекарственных средств, обладающих иммуностимулирующим действием. Предложена композиция, представляющая собой смесь 100 мг трекрезана и 1 мл настойки эхинацеи пурпурной. 3 табл.

Композиция, обладающая иммуностимулирующим действием, на основе эхинацеи, отличающаяся тем, что она представляет собой смесь 100 мг трекрезана и 1 мл настойки эхинацеи пурпурной.