ШТАММ БОРРЕЛИЙ ГЕНОТИПА BORRELIA GARINII NT 29, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БОРРЕЛИЙ И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 G01N33/531 

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм боррелий «Т6/Р51» на основании изучения фенотипических и генотипических признаков отнесен к порядку Spirochaetales семейству Spirochaetaceae роду Borrelia генокомплексу Borrelia burgdorferi sensu lato генотипу Borrelia garinii NT 29.

Штамм боррелий «Т6/Р51» выделен посевом на среду BSK-H в 2003 году из имаго клещей Ixodes persulcatus, собранных с растительности в окрестностях с.Холдеево Томского района Томской области.

Штамм боррелий «Т6/Р51» хранится в музее боррелий Центра по боррелиозам Министерства здравоохранения России при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под инвентарным номером Д-Т6/Р51 от 2 апреля 2008 г. По результатам изучения и сравнения нуклеотидных последовательностей межспейсерного участка 5S-23S рибосомальной РНК штамм отнесен к генотипу Borrelia garinii NT 29. Нуклеотидная последовательность депонирована в GenBank №AY 603349.

Известно, что иксодовые клещевые боррелиозы вызывают боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato. В Западной Сибири основное эпидемическое значение имеют B.afzelii и B.garinii, широко распространенные в пределах лесной зоны. Диагностика заболеваний часто затруднена из-за клинического полиморфизма симптомов. Единственным надежным признаком болезни, позволяющим диагностировать заболевание, является появление мигрирующей эритемы (МЭ) после присасывания клеща. В случае отсутствия МЭ диагноз может быть поставлен только на основании бактериологических или иммунологических, в том числе серологических, исследований с учетом углубленного клинического обследовании больного и детализации характера развития заболевания. В настоящее время наибольшее распространение в учреждениях практического здравоохранения получили серологические методы выявления специфических антител к боррелиям: реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) с корпускулярным антигеном и иммуноферментный анализ (ИФА). Однако получаемые результаты указанных серологических тестов не всегда корректны, что может быть связано с различиями антигенов, используемых в диагностических препаратах, и штаммов боррелий, циркулирующих в природных очагах Западно-Сибирского региона. Проведенные нами исследования по изучению чувствительности и специфичности РНИФ с использованием антигена из Западно-Сибирского штамма «Т6/Р51» при лабораторной диагностике ИКБ у госпитализированных с подозрением на клещевые нейроинфекции больных Омской области позволили верифицировать большее количество случаев заболеваний в комплексе с другими методами лабораторной диагностики (чувствительность РНИФ с использованием антигена из штамма «Т6/Р51» при определении суммарных антител составила 74,0±3,1%), провести адекватные лечебные мероприятия и снизить вероятность возникновения хронических форм заболевания.

Задача изобретения - оригинальный штамм боррелий «Т6/Р51» генотипа Borrelia garinii NT 29, характеризующий популяцию боррелий, циркулирующих в природных очагах Западной Сибири.

Технический результат - использование штамма боррелий «Т6/Р51» генотипа Borrelia garinii NT 29 в качестве антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции позволяет проводить более полную и достоверную лабораторную диагностику иксодовых клещевых боррелиозов у больных в Западно-Сибирском регионе.

Выделенный штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. При темнопольной микроскопии бактерии типичной спиралевидной формы имеют около 10 завитков, подвижные с вращательно-поступательным движением. Грамотрицательны. При окраске по Романовскому-Гимзе окрашиваются в светло-фиолетовый цвет.

Кулътуралъные свойства. Успешно культивируются на комплексной среде BSK-H (производства фирмы SIGMA, США) в плотно закрытых пробирках, заполненных на 1/10 средой при температуре 33°C. Накопление культуры 10⁷ на 1 мл в течение 14 дней.

Пассажная характеристика. Периодичность пересевов и число предыдущих пассажей с момента выделения: после выделения - 1 пассаж через 14 дней, далее хранился при -70°C до января 2008 г., после размораживания - 2 пассажа с интервалом 14 дней на среде BSK-H (Sigma) депонирован в музее.

Антигенная характеристика. Антигенные детерминанты выявляются методом флуоресцирующих антител с гипериммунными сыворотками. Поверхностный OspA антиген выявляется в ПЦР с праймерами SL (5'-AATAGGTCTAATAATAGCCTTAATAGC-3'; 5'-CTAGTGTTTTGCCATCTTCTTTGAAAA-3').

Патогенные свойства. По патогенности для человека относится к III группе возбудителей инфекционных болезней человека.

Штамм боррелий «Т6/Р51» при иммунизации лабораторных животных (белые мыши, кролики) вызывает выработку специфических антител, в РНИФ титр составил 1:40-1:80.

Генотипическая характеристика. Для проведения типирования боррелий в изоляте использовали ПЦР с праймерами, соответствующими консервативным участкам генов 5S и 23S РНК с последующим определением нуклеотидной последовательности или анализом полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДРФ) полученного фрагмента ПНР. Для проведения анализа ПДРФ продукты амплификации гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Tru9 I (Postic, 1994). Разделение фрагментов ДНК осуществляли в 12% полиакриламидном геле (ПААГ). Для определения размеров фрагментов рестрикции использованы молекулярные маркеры Hi-Lo™ ДНК (Minnesota Molecular Inc., США) и pBR322/BsuRI (СибЭнзим, Новосибирск).

Определена последовательность нуклеотидов межспейсерного участка 5S-23S рибосомальной РНК длиной 253 п.о. штамма боррелий «Т6/Р51»:

1 ctgcgagttc gcgggagagt aagttattgc cagggttttt attttatact ttaaacattg

61 attttatttt ttatgttttt agatgttcat gtttttgaat gttttattta aataatataa

121 aaaataaaat atatattgac atggattaaa caaagatata tattattcta tgttgcataa

181 acaaattggc aaaatagaga tggaagataa aaatatggtc aaagtaataa gagtctatgg

241 tgaatgccta gga

Таким образом, на основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Spirochaetales семейству Spirochaetaceae роду Borrelia генокомплексу Borrelia burgdorferi sensu lato генотипу Borrelia garinii NT 29.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение диагностических препаратов. Диагностический препарат - корпускулярный антиген из штамма «Т6/Р51» получают путем культивирования боррелий на среде BSK-H (производства фирмы SIGMA, США) в плотно закрытых пробирках, заполненных на 1/10 средой при температуре 33°C в течение 14 дней. После завершения культивирования клетки боррелий осаждают центрифугированием в течение 30 мин на центрифуге с охлаждением до +4°C при 18 тыс.об/мин. Затем трехкратно отмывают от среды забуференным физиологическим раствором путем ресуспендирования с последующим центрифугированием при описанных выше условиях. Полученный осадок разводят забуференным физиологическим раствором до концентрации 50 боррелий на поле зрения при темнопольной микроскопии. Готовый жидкий корпускулярный антиген наносят на стекла с лунками для люминесцентной микроскопии в количестве 20 мкл, высушивают на воздухе, высушенные препараты фиксируют ацетоном и хранят при температуре - 20°C.

Пример 2. Лабораторная диагностика ИКБ. Сыворотки крови от больных людей из эндемичных территорий Омской области, взятые в начальном периоде заболевания и в динамике инфекционного процесса (через 14 дней), исследуют в РНИФ по общепринятым методикам с использованием антигена из штамма «Т6/Р51» и в ИФА с коммерческими тест-системами. Исследовано 423 сыворотки крови, из них положительными в РНИФ в диагностических разведениях (1:40 и выше) - 114 проб (26,9%), в ИФА соответственно - 80 проб (18,9%), совпадение результатов обеих реакций - в 67 пробах (15,9%). Чувствительность РНИФ при определении суммарных антител составила 74,0±3,1%, специфичность 56,4±3,5%.

Пример 3. При изучении популяционного иммунитета жителей эндемичных территорий к возбудителям ИКБ применяют РНИФ с антигеном из штамма «Т6/Р51». С целью изучения частоты контакта населения с возбудителем ИКБ в различных ландшафтных зонах исследуют сыворотки крови лиц, проживающих в г.Омске и в различных административных районах Омской области, приуроченных к этим ландшафтам. В каждой зоне выборка составила не менее 300 жителей. Всего в РНИФ с целью обнаружения антител к боррелиям было исследовано 1798 сывороток крови лиц в возрасте от 17 до 73 лет. Серологическое обследование населения эндемичных районов свидетельствует о значительных показателях инфицирования. Так, у населения районов, расположенных в зоне южной тайги, антитела к боррелиям выявлены в 27,9±2,2% случаев, средне-геометрический титр (СГТ) антител 1:20, в подзоне осиново-березовых лесов - в 29,1±2,4% случаев, СГТ 1:23. Более низкий показатель наблюдался в зонах северной лесостепи - 19,5±2,6%, СГТ 1:14 и южной лесостепи - 16,1±1,4%, СГТ 1:16.

Таким образом, на основании приведенных выше примеров показана возможность применения штамма «Т6/Р51» в качестве продуцента для получения диагностических препаратов (пример 1), а также для лабораторной диагностики ИКБ в реакции непрямой иммунофлуоресценции в Западно-Сибирском регионе (примеры 2, 3). Все сказанное свидетельствует об оптимизации лабораторной диагностики иксодовых клещевых боррелиозов, их лечения и профилактики.

Новый штамм боррелий «Т6/Р51» относится к порядку Spirochaetales семейству Spirochaetaceae роду Borrelia генокомплексу Borrelia burgdorferi sensu lato генотипу Borrelia garinii NT 29. Штамм депонирован под №Д-Т6/Р51 от 2 апреля 2008 г. в музее боррелий Центра по боррелиозам МЗ РФ при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Оригинальный штамм боррелий «Т6/Р51» генотипа Borrelia garinii NT 29 характеризует популяцию боррелий, циркулирующих в природных очагах Западной Сибири. Методы исследования и результаты, доказывающие видовую принадлежность - ПЦР с последующим секвенированием. Нуклеотидная последовательность межспейсерного участка 5S-23S рибосомальной РНК депонирована в GenBank № AY 603349. Штамм боррелий «Т6/Р51» может быть использован в качестве продуцента диагностических препаратов, а также для оптимизации лабораторной диагностики иксодовых клещевых боррелиозов. Его использование в качестве антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции позволяет проводить более полную и достоверную лабораторную диагностику иксодовых клещевых боррелиозов у больных в Западно-Сибирском регионе.

Штамм боррелий «Т6/Р51» порядка Spirochaetales семейства Spirochaetaceae рода Borrelia генокомплекса Borrelia burgdorferi sensu lato генотипа Borrelia garinii NT 29, депонированный под № Д-Т6/Р51 от 2 апреля 2008 г. в музее боррелий Центра по боррелиозам Министерства здравоохранения России при ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, используемый для идентификации боррелий и получения диагностических препаратов.