ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Escherichia coli V32 ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ Escherichia coli СЕРОГРУППЫ О157 Российский патент 2011 года по МПК C12N7/00 C12R1/19 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для эпидемических учреждений как дополнительное средство при идентификации бактерий Escherichia coli серогруппы О157.

В последние годы появилось большое количество сообщений о вспышках у людей геморрагического гастроэнтерита, вызванного бактериями Escherichia coli О157. Решение проблемы во многом зависит от своевременной диагностики возбудителя. В России отсутствуют коммерческие препараты для выявления данных патогенов.

Известна питательная среда (1), которая является полуселективной для выделения сорбитолнегативных колоний Escherichia coli из клинического материала и продуктов питания. Чтобы выявить среди них бактерии Escherichia coli серогруппы O157, требуются дополнительные исследования.

Также предложен набор для идентификации энтерогеморрагических эшерихий (2), состоящий из иммуномагнитной разделительной тест-системы и тест-системы для постановки мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Набор обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Однако его применение требует специального оборудования и обученного персонала. Кроме того, в некоторых случаях получаются не однозначные результаты, связанные с широким распространением в природе генов, используемых для тестирования.

За рубежом для детекции Е.coli O157 обычно используют три метода: микробиологические, ПЦР и иммунный анализы. Кроме этого предложен меченный рекомбинантный бактериофаг РРO1, который позволяет при наличии флюоресцентного микроскопа обнаружить бактерии Е.coli O157 в течение 10 минут (3).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование для идентификации бактерий Е.coli O157 высокоспецифичного вирулентного бактериофага Escherichia coli V32.

Штамм бактериофага Escherichia coli V32 выделен из стоков коровника, расположенного в Московской области, и депонирован в коллекции музея микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ (Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии") под номером Ph25.

Штамм бактериофага Escherichia coli V32 рекомендуется использовать на стадии анализа подозрительных сорбитолнегативных колоний микроорганизмов, выросших на среде MacConkey с сорбитолом или на среде (1).

Использование такого бактериофага позволит легко, без привлечения специального оборудования и обучения персонала идентифицировать бактерии Escherichia coli серогруппы O157.

Штамм бактериофага Escherichia coli V32 характеризуется следующими свойствами:

- морфология негативных колоний: на чувствительном бактериальном штамме формирует прозрачные негативные колонии диаметром около 2-3 мм, с четким краем. Вторичный рост отсутствует;

- относится к лямбдоидной группе фагов;

- вирулентен для 100% бактерий Е. coli O157, используемых для проверки;

- специфичен для бактерий Е. coli O157. Не активен для других серотипов эшерихий, видов шигелл и иерсиний;

- не содержит факторов патогенности Е. coli O157:Н7 (rfb, stxl, stx2, еае и fliC);

- не формирует устойчивых лизогенов;

- геном имеет двунитевую ДНК размером около 62 тысяч пар оснований (kb). ДНК не гидролизуется ферментами SalG1, EcoRI, BamHI, PstI. Эндонуклеаза HindIII расщепляет ДНК на 28 фрагментов, EcoRV - на 13.

- хранение в виде фаголизата, либо в лиофильно высушенном состоянии.

Пример 1. Получение фаголизата штамма бактериофага Escherichia coli V32.

К 1 мл ночной бульонной культуры Е. coli O157:Н7 EDL933 добавляют 4 мл бульона Лурия и 1 мкл суспензии штамма бактериофага Escherichia coli V32 с концентрацией 5×10⁹ БОЕ/мл. Смесь инкубируют на качалке при 37°С до наступления просветления бактериальной культуры. Добавляют 0,5 мл хлороформа и интенсивно перемешивают в смесителе в течение 20 мин. Низкоскоростным центрифугированием (10000g, 15 мин) удаляют обломки бактериальных клеток и титруют фаголизат. Полученный фаголизат содержит более 10⁹ частиц фага в 1 мл.

Пример 2. Проверка специфичности штамма бактериофага Escherichia coli V32.

Специфичность штамма бактериофага Escherichia coli V32 проверяют методом спот-тестов. Для этого по 0,5 мл ночных бульонных бактериальных культур, указанных в табл.1, смешивают с 4 мл полужидкого агара (бульон Лурия с 0,7% агара) при температуре 47°C и распределяют по поверхности чашки Петри, содержащей богатую питательную среду (например, Nutrient Agar, HIMEDIA). Через 20 мин на поверхность наносят каплю штамма бактериофага V32 (около 10⁷ БОЕ/мл) и инкубируют при температуре 37°C в течение ночи. При визуальном осмотре только на чашках с культурами Е. coli O157:Н7 и Е. coli O157 рост бактериального газона отсутствует в местах внесения штамма бактериофага Escherichia coli V32 (прозрачное пятно лизиса). Во всех остальных случаях таких зон не обнаруживается.

Таблица 1 Специфичность штамма бактериофага Escherichia coli V32 (спот-тесты). Бактериальные штаммы Пятно лизиса Escherichia coli   O157:Н7 (60*) + O157:Н^-(8*) + Другие серотипы Е. Coli (26**) - Salmonella   cholerae suis (15*) - gallinarum pullorum (9*) - typhimurium (2*) - dublin(1*) - enteritidis (3*) - Shigella dysenteriae (1*) - Shigella sonnei (1 *) - Yersinia   enterocolitica (3*) - pseudotuberculosis (4*) - В скобках: *, количество штаммов данного вида, используемых при тестировании;
**, штаммы Е. coli серотипов O1, O2, O4, O6, O8, O15, O18, O19, O20, O23, O26, O28, O29, O33, O55, O78, O79, O110, O111, O113, O117, O119, O127, O139, О140 и O142;
«+», лизис; «-», нет лизиса.

Пример 3. Ферментативный гидролиз ДНК штамма бактериофага Escherichia coli V32.

Составляют рестрикционную смесь, содержащую 0,1 мкг/мл ДНК штамма бактериофага Escherichia coli V32, 1 мкл 10-кратного рестрикционного буфера, 1 единицу соответствующего фермента, деионизованную воду - до общего объема 10 мкл. Смесь инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Электрофорез проводят в горизонтальном электрофорезном аппарате при постоянной силе тока 150 мА в течение 1 часа. После 15 мин окрашивания в растворе 0,4 мкг бромистого этидия гель визуализируют под УФ-лампой (см. чертеж).

Пример 4. Использование штамма бактериофага Escherichia coli V32 для анализа бактериальных колоний методом спот-теста.

Бактериальные колонии анализируемых бактерий индивидуально суспендируют в 0,1 мл стерильного физиологического раствора и переносят на чашки с питательной средой Nutrient Agar. Суспензии досуха втирают стерильным шпателем в поверхность агара и, разделив чашку на 2 сектора, в один из них капают пипеткой каплю штамма бактериофага Escherichia coli V32, в другой - каплю физиологического раствора. Чашки инкубируют ночь при 37°С. При визуальном осмотре только на чашках с чувствительными к фагу Escherichia coli V32 бактериальными культурами (Е.coli O157:Н7 или Е.coli О157:Н^-) рост бактериального газона отсутствует на месте внесения бактериофага. Во всех остальных случаях таких зон нет.

Пример 5. Использование штамма бактериофага Escherichia coli V32 для анализа бактериальных колоний методом фаговой "дорожки".

Каплю штамма бактериофага Escherichia coli V32 наносят на поверхность питательного агара Nutrient Agar и, наклонив чашку Петри, распределяют ее по диаметру. Фаговую "дорожку" высушивают. Для этого чашку, приоткрыв крышку, помещают на 15 мин в термостат при 37°С. После этого суспензии колоний анализируемых бактерий переносят бактериологической петлей на поверхность питательного агара таким образом, чтобы они перпендикулярно пересекали фаговую "дорожку". Чашки инкубируют ночь при температуре 37°С. При визуальном осмотре только культуры Е.coli O157:Н7 и Е.coli O157:Н^- растут прерывистой полосой из-за отсутствия роста в зоне фаговой "дорожки". Остальные культуры растут сплошной непрерывной полосой.

Таким образом, штамм бактериофага Escherichia coli V32 является специфичным и вирулентным для бактерий Escherichia coli серогруппы О157. Использование предлагаемого штамма бактериофага для идентификации бактерий Escherichia coli серогруппы O157 является простым и общедоступным методом, не требующим больших затрат времени и материалов.

Источники информации

1. Патент RU №2139343, C12Q 1/20. Бюл. №28, 1999 г.

2. Патент RU №2270253, C12Q 1/68. Бюл. №5, 2006 г.

3. Oda М., Morita М., Unno Н., Tanji Y. Applied Environmental Microbiol. 2004; 70:1:527-534.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к методам идентификации и дифференциации культур с использованием бактериофага. Штамм бактериофага Escherichia coli V32 депонирован в коллекции музея микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ под номером Ph25, является специфичным и вирулентным для бактериофага, и используют его как дополнительное средство при идентификации бактерий Escherichia coli серогруппы O157 на стадии анализа бактериальных колоний. Использование штамма является простым и общедоступным средством, не требующим больших затрат времени и материалов. 1 ил.

Штамм бактериофага Escherichia coli V32 для идентификации бактерий Escherichia coli серогруппы O157, депонированный в коллекции музея микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ под номером Ph25.