ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ВИДА Sinorhizobium fredii КБ-11 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ Российский патент 2011 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения для сои.

Известны штаммы клубеньковых бактерий сои 639А, 648А, используемые для приготовления соевого нитрагина, относящиеся к медленнорастущему виду Bradyrhizobium japonicum.

Недостатками этих штаммов является то, что они растут только при рН 7 и температуре 27-28°С (оптимальные условия для выращивания клубеньковых бактерий сои) и в качестве источника углеродного питания используют только маннит.

Задачей изобретения является получение более технологичного штамма, обладающего высокими адаптационными возможностями, быстрым наращиванием биомассы в условиях, отличных от оптимальных.

Задача решается новым штамом клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii КБ-11, который выделен в 1989 году из клубеньков среднеспелого сорта сои ВНИИС-1, выращиваемой на лугово-черноземовидной почве Константиновского района Амурской области.

Полученный штамм депонирован и хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К.Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-2457D и коллекции ГНУ Всероссийского научно - исследовательского института сои под номером КБ-11.

Штамм Sinorhizobium fredii BKM B-2457D характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологе-биохимическими признаками

Культурально-морфологические признаки

В молодом возрасте бактерии штамма Sinorhizobium fredii КБ-11 подвижные, представляют собой удлиненные палочки размером (2,3…2,5)×0,4 мк. Грамотрицательные. Быстрорастущая культура. В чашках Петри на маннитно-соевой твердой питательной среде указанные бактерии вырастают на 3-4 сутки после посева, образуя выпуклые, прозрачные, слизистые колонии диаметром 1,0…3,1 мм. Бактерии Sinorhizobium fredii КБ-11 хорошо растут и на других питательных средах:

Среда Норриса, г/л: К₂НРO₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 0,2; FеСl₃ - 0,01; дрожжевой экстракт - 2,0; маннит - 10,0.

Соевая среда с маннитом, г/л: К₂НРO₄ - 0,5; КН₂РO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с глюкозой, г/л: К₂НРO₄ - 0,5; КН₂РO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; глюкоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с сахарозой, г/л: К₂НРO₄ - 0,5; КН₂РO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; сахароза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с мальтозой, г/л: К₂НРO₄ - 0,5; КН₂РO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; мальтоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с лактозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; КН₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; лактоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Навеску соевой муки получают путем размола пророщенных соевых семян, заливают 1 литром воды и кипятят в течение 30 минут. В фильтрат, доведенный до 1 литра, вносят соли.

При выращивании штамма КБ-11 в пробирках на всех вышеперечисленных средах (при температуре 28°С в течение 72 часов) отмечен обильный рост штриха гелеобразной прозрачной консистенции. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4°С консистенция штриха штамма КБ-11 не изменяется.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб.

Температурный диапазон роста 27-39°С.Оптимальная температура роста 27-28°С.

Оптимум рН 7,0; диапазон рН 6,0-8,0.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет на сахарозе глюкозе, мальтозе, лактозе, манните с образованием продуктов кислотного характера.

Осмоустойчив, дает хороший рост на средах с концентрацией NaCl 0,4µ. Признаки штамма устойчивые. Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 месяцев. Хранится в пробирках на маннитно-соевом агаре при температуре 4-5°С.

Штамм ВКМ B-2457D идентифицирован по «Определителю» Берги (1980) как штамм вида Sinorhizobium fredii.

Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ В-2457D отличается от ранее известных штаммов клубеньковых бактерий сои способностью использовать различные источники углеродного питания, хорошо расти в широком температурном и рН диапазоне.

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Sinorhizobium fredii ВКМ B-2457D.

Пример

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках с агаризованной питательной соевой средой с маннитом, г/л: К₂НРO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 27-28°С на 5 суток. За это время в пробирках на косяке плотной питательной среды отмечается обильное нарастание бактериальной массы испытываемого штамма.

Для инокуляции семян в день посева сои готовят бактериально-молибденовую смесь. Для этого в пробирки со штрихом испытываемого штамма клубеньковых бактерий сои вносят по 2,5 мл заранее приготовленного 1,25% раствора молибдена (25 г/л молибдата аммония). Штрих с косяка питательной среды смывают раствором молибдена. Путем встряхивания пробирки получают однородную бактерию - молибденовую смесь, которой сразу же обрабатывают семена сои. Полученный объем суспензии (2,5 мл) используют для предпосевной обработки 250 г семян сои. После нанесения суспензии семена сои тщательно перемешивают, подсушивают в тени и высевают в подготовленную почву.

В таблице приводятся данные об эффективности штамма ВКМ B-2457D в зависимости от условий года, полученные в результате проведения полевых экспериментах. Опыты проводились на лугово-черноземных почвах, с сортом сои Соната. Бактеризованные семена высевают в день обработки. Штамм Sinorhizobium fredii КБ-11, ВКМ B-2457D по сравнению с контролем (фон - естественная инокуляция) стабильно повышал урожайность семян сои в течение 8-ми лет

Штамм Урожайность семян сои по годам Средняя урожайность 1992 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 Контроль без обработки 18,8 32,0 26,7 16,5 11,9 26,0 18,8 18,8 27,3 22,0 21,9 КБ-11 ВКМВ-2457D 18,8 32,7 30,2 16,5 14,7 26,8 21,4 21,4 28,1 24,2 23,5

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Sinorhizobium fredii КБ-11, ВКМ В-2457D для изготовления бактериального удобрения под сою является высокотехнологичным, обладает ускоренным ростом на различных источниках углеродного питания.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к изготовлению бактериального удобрения под сою. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii КБ-11 выделен из природной популяции клубеньковых бактерий, распространенной в почвах южной зоны Амурской области и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером В-2457D. Изобретение позволяет повысить урожай семян сои и улучшить его качество. 1 табл.

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Sinorhizobium fredii КБ-11, ВКМ B-2457D для изготовления бактериального удобрения под сою.