ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Sinorhizobium fredii ВКМ В-2458D ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения для сои.

Известны штаммы клубеньковых бактерий сои 639А, 648А, используемые для приготовления соевого нитрагина, относящиеся к медленнорастущему виду Bradyrhizobium japonicum.

Недостатками этих штаммов является то, что они растут только при pH 7 и температуре 27-28°С (оптимальные условия для выращивания клубеньковых бактерий сои), в качестве источника углеродного питания используют только маннит.

Задачей изобретения является получение более технологичного штамма, обладающего высокими адаптационными возможностями, быстрым наращиванием биомассы в условиях, отличных от оптимальных.

Задача решается новым штаммом клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii BKM B-2458D, который выделен в 1992 году из клубеньков дикорастущей сои, произрастающей на бурых лесных почвах Благовещенского района Амурской области.

Полученный штамм депонирован и хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К.Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером BKM B-2458D и в коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сои под номером ББ-49к.

Штамм Sinorhizobium fredii BKM B-2458D характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Культурально-морфологические признаки.

В молодом возрасте бактерии штамма Sinorhizobium fredii BKM B-2458D подвижные, представляют собой удлиненные палочки размером (2,3÷2,5)×0,4 мк. Грамотрицательные. Быстрорастущая культура. В чашках Петри на маннитно-соевой твердой питательной среде указанные бактерии вырастают на 3-4 сутки после посева, образуя выпуклые, прозрачные, слизистые колонии диаметром 1,0…7,0 мм. Бактерии Sinorhizobium fredii BKM B-2458D хорошо растут и на других питательных средах:

Среда Норриса, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 0,2; FeCl₃ - 0,01; дрожжевой экстракт - 2,0; маннит - 10,0.

Соевая среда с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20; соевая мука 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с глюкозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; глюкоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с сахарозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; сахароза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с мальтозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; мальтоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с лактозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; лактоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Навеску соевой муки, полученную путем размола пророщенных соевых семян, заливают 1 литром воды и кипятят в течение 30 минут. В фильтрат, доведенный до 1 литра, вносят соли.

При выращивании штамма BKM B-2458D в пробирках на всех вышеперечисленных средах (при температуре 28°С в течение 72 часов) отмечен обильный рост штриха гелеобразной прозрачной консистенции. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4°С консистенция штриха штамма ВКМ B-2458D не изменяется.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб.

Температурный диапазон роста 27-32°С. Оптимальная температура роста 27-28°С.

Оптимум pH 7,0; диапазон pH 6,0-8,0.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет на сахарозе, глюкозе, мальтозе, лактозе, манните с образованием продуктов кислотного характера.

Осмоустойчив, дает обильный рост на средах с концентрацией NaCl 0,4 мк.

Признаки штамма устойчивые. Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 месяцев. Хранится в пробирках на маннитно-соевом агаре при температуре 4-5°С.

Штамм ВКМ B-2458D идентифицирован по «Определителю» Берги (1980) как штамм вида Sinorhizobium fredii.

Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ В-2458D отличается от ранее известных штаммов клубеньковых бактерий сои способностью использовать различные источники углеродного питания, хорошо расти в широком температурном и pH диапазоне.

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Sinorhizobium fredii ВКМ B-2458D.

Пример.

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках с агаризованной питательной соевой средой с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 27-28°С на 5 суток. За это время в пробирках на косяке плотной питательной среды отмечается обильное нарастание бактериальной массы испытываемого штамма.

Для инокуляции семян в день посева сои готовят бактериально-молибденовую смесь. Для этого в пробирки со штрихом испытываемого штамма клубеньковых бактерий сои вносят по 2,5 мл заранее приготовленного 1,25% раствора молибдена (25 г/л молибдата аммония). Штрих с косяка питательной среды смывают раствором молибдена. Путем встряхивания пробирки получают однородную бактериально-молибденовую смесь, которой сразу же обрабатывают семена сои. Полученный объем суспензии (2,5 мл) используют для предпосевной обработки 250 г семян сои. После нанесения суспензии семена сои тщательно перемешивают, подсушивают в тени и высевают в подготовленную почву.

В таблице приводятся данные об эффективности штамма ВКМ В-2458D в зависимости от условий года, полученные в результате проведения полевых экспериментов.

Эффективность штамма Sinorhizobium fredii ВКМ В-2458D

Штамм Урожайность семян сои по годам, ц/га Средняя урожайность, ц/га 2001 г. 2002 г. 2004 г. 2005 г. 2006 г. Контроль (без обработки) 32,0 26,7 11,9 26,0 18,8 23,1 ББ-49к (ВКМ B-2458D) 32,7 28,2 13,8 27,5 23,5 25,14

Опыты проводили на лугово-черноземовидных почвах, с сортом сои Соната. Бактеризованные семена высевают в день обработки. Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ В-2458D по сравнению с контролем (фон - естественная инокуляция) стабильно повышал урожайность семян сои в течение 5-и лет испытаний, в среднем на 2,0 ц/га.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для изготовления бактериального удобрения под сою. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii выделен из природной популяции клубеньковых бактерий, распространенной в почвах южной зоны Амурской области, и депонирован в BKM под номером B-2458D, а также хранится в коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сои под номером ББ-49к. Штамм Sinorhizobium fredii BKM В-2458D является микробиологическим средством, стабильно повышающим урожай семян сои в среднем на 2,0 ц/га. 1 табл.

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Sinorhizobium fredii BKM B-2458D для изготовления бактериального удобрения под сою.