ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Sinorhizobium fredii ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ Российский патент 2017 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения для сои.

Наиболее близким к изобретению является штамм Sinorhizobium fredii ВКМ B-2458D, используемый для приготовления соевого нитрагина (патент РФ на изобретение №2415924 от 10.04.11. Прототип).

Недостатком прототипа является малый диапазон температур для оптимального роста.

Техническая проблема, решаемая данным изобретением, состоит в получении более технологичного штамма, обладающего высокими адаптационными возможностями, стимулирующего быстрое наращивание биомассы и увеличивающего урожайность бобовых культур.

Данная проблема решается новым штаммом клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii ВКМ B-3152D АмБ-17, который выделен в 2014 году из клубеньков дикорастущей сои, произрастающей на лесных почвах Благовещенского района Амурской области.

Полученный штамм депонирован и хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ В-3152D.

Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ B-3152D характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Подвижные удлиненные палочки размером (2,3÷2,5)×0,4 мк. Грамотрицательный. Быстрорастущая хемогетеротрофная культура, питается и размножается в органических субстратах при отсутствии света, в аэробных условиях. В чашках Петри на глюкозно-пептонной агаризованной среде указанные бактерии вырастают на 2-4 сутки после посева, образуя выпуклые прозрачные слизистые колонии диаметром 1,0…7,0 мм. Бактерии Sinorhizobium fredii ВКМ B-2458D хорошо растут и на других питательных средах.

Питательные среды для штамма АмБ-17, г/л, рН 6-8, содержащие различные углеводы:

1. Соевая мука - 10; дрожжевой экстракт - 5 г; К₂НРО₄ - 2; КН₂РО₄ - 1; MgSO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,2; NaCl - 0,5; глюкоза - 20.

2. Пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5 г; К₂НРО₄ - 2; КН₂РО₄ - 1; MgSO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,2; NaCl - 0,5; глюкоза - 20.

3. Пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5 г; К₂НРО₄ - 2; КН₂РО₄ - 1; MgSO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,2; NaCl - 0,5; маннит - 20.

4. Соевая мука - 10; дрожжевой экстракт - 5 г; К₂НРО₄ - 2; КН₂РО₄ - 1; MgSO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,2; NaCl - 0,5; маннит - 20.

5. Пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5 г; К₂НРО₄ - 2; КН₂РО₄ - 1; MgSO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,2; NaCl - 0,5; сахароза - 20.

6. Соевая мука - 10; дрожжевой экстракт - 5 г; K₂HPO₄ - 2; KH₂PO₄ - 1; MgSO₄ - 0,2; MnSO₄ - 0,2; (NH₄)₂SO₄ - 0,2; CaCl₂ - 0,2; NaCl - 0,5; сахароза - 20.

Стерилизация среды при 111°C в течение 30 мин.

Навеску соевой муки, полученную путем размола пророщенных соевых семян, заливают 1 литром воды и кипятят в течение 30 минут. В фильтрат, доведенный до 1 литра, вносят соли.

При выращивании штамма ВКМ B-3152D в пробирках на всех вышеперечисленных средах (при температуре 28°C в течение 72 часов) отмечен обильный рост штриха гелеобразной мутноватой консистенции. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4°C консистенция штриха штамма ВКМ B-3152D не изменяется.

Физиолого-биохимические признаки

Прототрофный микроорганизм, аэробный фиксатор, температурный диапазон роста 23-32°C. Оптимальная температура роста 24-26°C. При 0°C и 37°C рост приостанавливается. Микроаэрофилы, развивающиеся при незначительных количествах кислорода в среде, хорошо растут при глубинном посеве. Оптимум рН 7,0; диапазон рН 6,0-8,0.

Отношение к источникам углерода: хемогетеротрофная бактерия, хорошо усваивает и растет на органических субстратах: сахарозе, глюкозе, мальтозе, манните, с образованием продуктов щелочного характера. В качестве источника азота бактерии используют разнообразные минеральные и органические азотсодержащие соединения.

Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 месяцев. Хранится в пробирках на маннитно-соевом или глюкозно-пептонном агаре при температуре 4-5°C.

Штамм ВКМ B-3152D идентифицирован по «Определителю» Берги (1980) как штамм вида Sinorhizobium fredii.

Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ B-3152D отличается от ранее известных штаммов клубеньковых бактерий сои способностью использовать различные источники углеродного питания, хорошо расти в широком температурном и рН диапазоне. Кроме того, в отличие от прототипа, имеющего оптимальную температуру роста 27-28°C, заявляемый штамм имеет оптимальную температуру роста 24-26°C, что больше соответствует основной летней температуре Амурского региона.

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Sinorhizobium fredii ВКМ В-3152D.

Пример

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках с агаризованной питательной соевой средой с глюкозой, г/л: К₂НРО₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,2; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; глюкоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 20,0.

После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 27-28°C на 7 суток. За это время в пробирках на косяке плотной питательной среды отмечается обильное нарастание бактериальной массы испытываемого штамма.

Для инокуляции семян в день посева сои готовят бактериальную смесь. Для этого в пробирки со штрихом испытываемого штамма клубеньковых бактерий сои вносят по 3 мл деионизированный (очищенной) воды. Путем встряхивания пробирки получают однородную бактериальную смесь, которой сразу же обрабатывают семена сои. Полученный объем суспензии (3 мл) используют для предпосевной обработки 300 г семян сои. После нанесения суспензии семена сои тщательно перемешивают, подсушивают в тени и высевают в подготовленную почву.

В таблице приводятся данные об эффективности штамма ВКМ B-3152D в зависимости от условий года, полученные в результате проведения полевых экспериментов.

Опыты проводили на лугово-черноземовидных почвах с сортом сои МК-100. Бактеризованные семена высевают в день обработки. Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ B-3152D по сравнению с контролем (фон - естественная инокуляция) стабильно повышал урожайность семян сои в течение 3-х лет испытаний в среднем на 2,5 ц/га.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii АмБ-17 депонирован в ВКМ под регистрационным номером ВКМ B-3152D. Штамм может быть использован при изготовлении бактериального удобрения под сою. Изобретение позволяет повысить урожайность сои. 1 табл.

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Sinorhizobium fredii, депонированный в коллекции ФГБУН ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ B-3152D, для изготовления бактериального удобрения под сою.