ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Sinorhizobium fredii ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения для сои.

Наиболее близким к изобретению является штамм Sinorhizobium fredii КБ-11 ВКМ B-2457D, используемый для приготовления соевого нитрагина (Патент РФ на изобретение №2413707 от 10.03.11. Прототип).

Известный штамм не устойчив к высоким дозам аммиачной селитры, что ограничивает его применение в производственных условиях.

При создании изобретения ставилась задача получения штамма, обладающего устойчивостью к высоким дозам аммиачной селитры.

Задача решается новым штаммом клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii ТБ-508, который выделен в 1999 году из клубеньков сои сорта Харьковская-66, выращенной на луговой черноземовидной почве Тамбовского района Амурской области.

Полученный штамм депонирован и хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-2631D и коллекции ФГБНУ Всероссийского научно-исследовательского института сои под номером ТБ-508.

Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ B-2631D характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

В молодом возрасте бактерии штамма Sinorhizobium fredii ВКМ B-2631D подвижные, представляют собой удлиненные палочки размером (2,3…2,5)×0,4 мк. Грамотрицательные. Быстрорастущая культура. В чашках Петри на маннитно-соевой твердой питательной среде указанные бактерии вырастают на 2-е сутки после посева, образуя выпуклые, желтоватые, слизистые колонии диаметром 1,0…3,1 мм. Бактерии Sinorhizobium fredii ВКМ B-2631D хорошо растут и на других питательных средах:

Мясо-пептонный агар, г/л: агар сухой питательный - 20,0; агар-агар - 10,0.

Среда Норриса, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 0,2; FeCl₃ - 0,01; дрожжевой экстракт - 2,0; маннит - 10,0.

Соевая среда с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20; соевая мука - 10,0; агар - агар - 15,0.

Соевая среда с глюкозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; глюкоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар - агар - 15,0.

Соевая среда с сахарозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; сахароза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар - агар - 15,0.

Соевая среда с мальтозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; мальтоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар - агар - 15,0.

Соевая среда с лактозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; лактоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар - агар - 15,0.

Навеску соевой муки получают путем размола пророщенных соевых семян, заливают 1 литром воды и кипятят в течение 30 минут. В фильтрат, доведенный до 1 литра, вносят соли.

При выращивании штамма Sinorhizobium fredii ВКМ B-2631D в пробирках на всех вышеперечисленных средах (при температуре 28°C в течение 72 часов) отмечен обильный рост штриха пастообразной, желтоватой консистенции. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4°C консистенция штриха штамма Sinorhizobium fredii ВКМ В-2631D не изменяется.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб.

Температурный диапазон роста 27-39°С. Оптимальная температура роста 27-28°С.

Оптимум pH 7,0; диапазон pH 6,0-8,0.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет на сахарозе глюкозе, мальтозе, лактозе, манните с образованием продуктов кислотного характера.

Осмоустойчив, дает хороший рост на средах с концентрацией NaCl 0,4µ. Признаки штамма устойчивые. Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 месяцев. Хранится в пробирках на маннитно-соевом агаре при температуре 4-5°C.

Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ B-2631D, отличается от штамма-прототипа (штамм Sinorhizobium fredii КБ-11 ВКМ B-2457D) устойчивостью к высоким дозам аммиачной селитры (дает рост на маннитно-соевой твердой питательной среде с содержанием NH₄NO₃ 40 г/л).

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Sinorhizobium fredii ВКМ B-2631D.

Пример

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках с агаризованной питательной соевой средой с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20,0; соевая мука - 10,0; агар - агар - 15,0.

После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 27-28°C на 5 суток. За это время в пробирках на косяке плотной питательной среды отмечается обильное нарастание бактериальной массы испытываемого штамма.

Для инокуляции семян в день посева сои готовят бактериально-молибденовую смесь. Для этого в пробирки со штрихом испытываемого штамма клубеньковых бактерий сои вносят по 2,5 мл заранее приготовленного 1,25% раствора молибдена (25 г/л молибдата аммония). Штрих с косяка питательной среды смывают раствором молибдена. Путем встряхивания пробирки получают однородную бактериально-молибденовую смесь, которой сразу же обрабатывают семена сои. Полученный объем суспензии (2,5 мл) используют для предпосевной обработки 250 г семян сои. После нанесения суспензии семена сои тщательно перемешивают, подсушивают в тени и высевают в подготовленную почву.

В таблице приводятся данные об эффективности штамма ВКМ В-2631D в зависимости от условий года, полученные в результате проведения полевых экспериментов. Опыты проводили на луговых черноземовидных почвах, с сортом сои Гармония. Бактеризованные семена высевают в день обработки. Штамм Sinorhizobium fredii ВКМ В-2631D по сравнению с контролем (фон - естественная инокуляция) стабильно повышал урожайность семян сои в течение 3-х лет из четырех лет испытаний, в среднем на 1,1 ц/га.

Эффективность штамма Sinorhizobium fredii ВКМ В-2631D

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii ТБ-508, обладающий устойчивостью к высоким дозам аммиачной селитры, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под регистрационным ВКМ В-2631D. Изобретение обеспечивает повышение урожайности семян сои. 1 табл., 1 пр.

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Sinorhizobium fredii ВКМ В-2631D для изготовления бактериального удобрения под сою.