ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Bradyrhizobium japonicum ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения для сои.

Наиболее близким к изобретению является штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D, используемый для приготовления соевого нитрагина (Патент РФ на изобретение №2413762 от 10.03.11. Прототип).

Известный штамм обладает сравнительно низким уровнем амидазной и каталазной активности, не устойчив к высоким дозам аммиачной селитры, что ограничивает его применение в производственных условиях.

При создании изобретения ставилась задача получения штамма, обладающего более высокой ферментативной активностью, устойчивостью к высоким дозам аммиачной селитры, повышающего семенную продуктивность растения-хозяина.

Задача решается новым штаммом клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum MM - 117, который выделен в 1996 году из клубеньков сои сорта Октябрь-70, выращенной на бурых лесных почвах Мазановского района Амурской области.

Полученный штамм депонирован и хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-2629D и коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сои под номером ММ - 117.

Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками:

Культурально-морфологические признаки.

В молодом возрасте бактерии штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ В-2629D подвижные, представляют собой удлиненные палочки размером (2,3…2,5)×0,4 мкм. Грамотрицательные. Медленнорастущая культура. В чашках Петри на маннитно-соевой твердой питательной среде указанные бактерии вырастают на 10 сутки после посева, образуя выпуклые, молочно-белые, слизистые колонии диаметром 1,0…2,0 мм. Бактерии Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D хорошо растут и на других питательных средах:

Среда Норриса, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 0,2; FeCl₃ - 0,01; дрожжевой экстракт - 2,0; маннит - 10,0.

Соевая среда с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с глюкозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; глюкоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с сахарозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; сахароза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с мальтозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; мальтоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с лактозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; лактоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Навеску соевой муки получают путем размола пророщенных соевых семян, заливают 1 л воды и кипятят в течение 30 мин. В фильтрат, доведенный до 1 л, вносят соли.

При выращивании штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D в пробирках на всех вышеперечисленных средах (при температуре 28°C в течение 480 ч) отмечен обильный рост штриха пастообразной молочно-белой консистенции. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4°C консистенция штриха штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D не изменяется.

Физиологе-биохимические признаки.

Аэроб.

Температурный диапазон роста 27-30°С. Оптимальная температура роста 27-28°C.

Оптимум рН 7,0.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет на сахарозе, глюкозе, мальтозе, лактозе, манните с образованием продуктов щелочного характера.

Признаки штамма устойчивые. Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 месяцев. Хранится в пробирках на маннитно-соевом агаре при температуре 4-5°C.

Штамм ВКМ В-2629D идентифицирован по «Определителю» Берги (1984) как штамм вида Bradyrhizobium japonicum.

Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ В-2629D отличается от штамма-прототипа (Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D) высокой амидазной, каталазной активностью, а также устойчивостью к высоким дозам аммиачной селитры (дает рост на маннитно-соевой твердой питательной среде с содержанием NH₄NO₃ 40 г/л).

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D.

Пример

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках с агаризованной питательной соевой средой с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 27-28°C на 20 суток. За это время в пробирках на косячке плотной питательной среды отмечается обильное нарастание бактериальной массы испытываемого штамма.

Для инокуляции семян в день посева сои готовят бактериально-молибденовую смесь. Для этого в пробирки со штрихом испытываемого штамма клубеньковых бактерий сои вносят по 2,5 мл заранее приготовленного 1,25% раствора молибдена (25 г/л молибдата аммония). Штрих с косяка питательной среды смывают раствором молибдена. Путем встряхивания пробирки получают однородную бактериально-молибденовую смесь, которой сразу же обрабатывают семена сои. Полученный объем суспензии (2,5 мл) используют для предпосевной обработки 250 г семян сои. После нанесения суспензии семена сои тщательно перемешивают, подсушивают в тени и высевают в подготовленную почву.

В таблице приводятся данные об эффективности штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D в зависимости от условий года, полученные в результате проведения полевых экспериментов. Опыты проводили на лугово-черноземовидных почвах с сортом сои Гармония. Бактеризованные семена высевали в день обработки. Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D по сравнению с контролем (фон - естественная инокуляция) стабильно повышал урожайность семян сои в течение трех лет испытаний в среднем на 1,9 ц/га.

Эффективность штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Предложен штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D для изготовления бактериального удобрения под сою. Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D обладает устойчивостью к высоким дозам аммиачной селитры, повышает урожай семян сои. 1 табл., 1 пр.

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D для изготовления бактериального удобрения под сою.