ХРОМОГЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ КЛЕБСИЕЛЛ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/22 

Изобретение относится к медицине, а именно к санитарной и клинической микробиологии, и может быть использовано при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды при подозрении на клебсиеллез.

Известно, что на протяжении последних десятилетий во всех экономически развитых странах мира отмечаются существенные изменения в структуре инфекционной патологии человека: на фоне снижения уровня заболеваемости рядом классических инфекций фиксируется рост заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, в числе которых одно из ведущих мест принадлежит клебсиеллам (1, 3, 5, 6, 11, 12). Описывают обнаружение клебсиелл и в окружающей среде: в воде, пищевых продуктах, на поверхности инструментов в медучреждениях, одежде медперсонала и т.д.

Известно довольно широкое распространение клебсиелл в окружающей среде, в связи с чем возрастает их значимость и как индикаторных микроорганизмов, и как потенциально патогенных, вызывающих патологию у человека.

Клебсиеллы способны вызвать внутрибольничные инфекции с тяжелым течением заболевания, нередко с летальным исходом, они обладают высокой устойчивостью к дезинфектантам, а также к антибактериальным препаратам. Последнее затрудняет лечение и снижает его эффективность (1, 3, 5, 10).

Наибольшую роль в патологии человека среди микроорганизмов рода Klebsiella играют K.pneumoniae, K.oxytoca, K.mobilis (1, 11).

В связи с отсутствием особенностей клинической картины заболеваний, вызываемых клебсиеллами, правильный и своевременный диагноз клебсиеллеза может быть поставлен только на основании бактериологической диагностики (5, 12).

Известны питательные среды для выделения клебсиелл - это обычные дифференциально-диагностические питательные следы, в которых заложен принцип ферментации лактозы (среда Эндо, Левина, Плоскирева, Мак-Конки). Однако на этих средах отличить клебсиеллы от других бактерий группы кишечной палочки (БГКП) невозможно, т.к. все они расщепляют лактозу (8, 12).

Известна среда для выделения клебсиелл, содержащая антибиотик карбенициллин в качестве селективного агента (4), ингибирующего сопутствующую микрофлору. Однако большинство энтеробактерий слабочувствительны к этому антибиотику, вследствие чего селективные свойства его недостаточны, чтобы подавить рост всех БГКП, создав предпочтительные условия для роста только клебсиелл. А содержащаяся в среде сахароза, расщепляемая всеми БГКП, не дает возможность отличить их друг от друга.

Другая среда, основанная на принципе ингибиции сопутствующей микрофлоры - это среда Бойко О.В. с соавторами (2). Она содержит мясопептонный агар, лактозу и сафранин Т. Последний, являясь окислительно-восстановительным индикатором, не обеспечивает полного подавления сопутствующей микрофлоры, которые, разлагая лактозу, вырастают колониями разного размера, но одинаковыми по цвету с клебсиеллами, что затрудняет дифференцировку.

Известны среды для выделения клебсиелл по признаку расщепления инозита (3, 9). Но эти среды поддерживают рост не только K.pneumoniae, но и Serratia spp: те и другие виды микроорганизмов растут в виде средних и больших, ядрообразных, гладких колоний желтого цвета. Дифференциация клебсиелл от серраций по морфологии колоний весьма затруднительна (3).

Поэтому для определения принадлежности выделенных культур к клебсиеллам необходима постановка целого ряда подтверждающих тестов, а следовательно, значительного времени и материальных затрат (3, 5). Это - тесты на подвижность, сероводород, мочевину, фенилаланиндезаминазу, цитрат Симмонса, малонат, лизиндекарбоксилазу, инозит. Общие затраты времени от 3-х до 5-ти суток.

В то же время при проведении микробиологических исследований важным условием является быстрота получения результатов, что способствует ранней диагностике, своевременному проведению терапевтических и противоэпидемиологических мероприятий.

Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является питательная среда для выделения клебсиелл (7). Принцип действия этой среды основан на ферментации клебсиеллами инозита. В состав среды входят в г/л:

Гидролизат казеиново-дрожжевой 19,7 Мезоинозит 7,0 Индикатор бромтимоловый синий 0,5 2,4-динитрофенол 0,001 Калия сульфат 1,0 Магния сульфат 1,0 Агар микробиологический 1,0

Причиной, препятствующей достижению указанного ниже технического результата при использовании сухой питательной среды для выделения клебсиелл, принятой за прототип, является способность расщеплять инозит и другими представителями семейства Enterobacteriaceae, а именно Serratia marcescens, Yersiniae enterocolitica, Proteus rettgeri, Providencia (12), которые вырастают на этой среде трудно отличимыми по цвету от клебсиелл колониями, что не обеспечивает четкой дифференциации между ними (см. таблицу).

Цель изобретения - получение питательной среды для выделения и идентификации клебсиелл на основе выявления их родоспецифического фермента - 5-аминосалицилатдекарбоксилазы.

Для достижения указанного технического результата при осуществлении изобретения в качестве питательной основы для поддержания роста клебсиелл и других УПЭ в состав среды введен сухой питательный агар, содержащий аминного азота - 2,5±0,5%, хлоридов - 18±2%, прочность студня, г, - 300±35, остаточная влажность не более 7%, pH среды - 7,3±0,2, независимо от его модификации и происхождения сырья. Для выявления уникального внутриклеточного родоспецифического фермента клебсиелл - 5-аминосалицилатдекарбоксилазы, которую ни один другой представитель семейства Enterobacteriaceae не вырабатывает, в состав среды введена 5-аминосалициловая кислота (5-АСК), которая под воздействием 5-аминосалицилатдекарбоксилазы клебсиелл расщепляется с образованием продукта коричневого цвета, окрашивающего только колонии клебсиелл и среду вокруг них в коричневый цвет (13, 14).

Для микроорганизмов, не продуцирующих 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, в состав среды введены глюкоза и индикатор бромтимоловый синий, которые позволяют выявить образование кислоты из глюкозы при росте указанных микроорганизмов, окрашивающихся в желтый цвет в отличие от колоний клебсиелл коричневого цвета. С целью компенсации ингибиторного действия 5-АСК на клебсиеллы в среду введены стимуляторы бактериального роста - экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) и парааминобензойная кислота (ПАБК). А также среда содержит дистиллированную воду как необходимый элемент для приготовления питательной среды, предназначенной для выращивания микроорганизмов.

Идентификация клебсиелл на предлагаемой среде осуществляется одновременно с их выделением, т.е. одноэтапно. Постановка дополнительных идентификационных тестов не требуется, что сокращает время установления диагноза до 24 ч вместо нескольких суток, необходимых для подтверждения или исключения принадлежности выделенной инозитположительной культуры к роду клебсиелла, при использовании среды, взятой за прототип. Грамположительные микроорганизмы подавляются при посеве из разведения 10^-1 в результате введения в среду бриллиантового зеленого.

Состав предлагаемой среды ДагХром Клебсиелла агар в г/л дистиллированной воды:

Питательный агар, сухой 35,0-40 Глюкоза ГОСТ 6038-79 5,0-6,0 5-аминосалициловая кислота фирмы «Sigma» 2,0-3,0 Экстракт кормовых дрожжей ФС42-3441-97 3,0-5,0 Парааминобензойная кислота, фирма «Sigma» 0,01-0,02 Бромтимоловый синий ТУ 6-09-5430-90 0,08-0,09 Трис-буфер ТУ6-09-4292-76 1,0-1,5 Натрий углекислый ГОСТ 5100-73 0,6-0,7 Бриллиантовый зеленый, з-д химреактив.   г.Шостка 0,0001-0,0002 Агар микробиологический ГОСТ 17206-84 2,5-3,0

Данный состав среды обеспечивает четкую дифференциацию клебсиелл (коричневые) по цвету от других БГКП и протеев (желтые), что не представляется возможным при использовании традиционных лактозосодержащих сред (Эндо, Левина и др.) или сред с инозитом.

Питательную среду для выделения и ускоренной идентификации клебсиелл - ДагХром Клебсиелла агар получают следующим образом.

Пример 1. В 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 35,0 г сухого питательного агара, 3,0 г экстракта кормовых дрожжей, 0,01 г парааминобензойной кислоты, 0,08 г бромтимолового синего, 2,5 г агара микробиологического, 5,0 г глюкозы, 2,0 г 5-аминосалициловой кислоты, 1,0 г трис-буфера, 0,6 г натрия углекислого и 0,0001 г бриллиантового зеленого. Смесь тщательно перемешивают, трехкратно кипятят по 1-2 мин при помешивании, не допуская пригорания агара, до появления крупнопузырчатой пены. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, после чего разливают в стерильные чашки Петри. После застывания агаровой пластинки чашки со средой подсушивают в термостате при 37°С в течение 50-60 мин с соблюдением правил асептики. Готовая к употреблению среда прозрачная, бутылочно-зеленого цвета, pH среды 7,4±0,2. Исследуемый материал наносят на поверхность среды и растирают стерильным шпателем. Инкубируют посев при температуре 37°С в течение 24 ч.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 37,0 г сухого питательного агара, 4,0 г экстракта кормовых дрожжей, 0,015 г парааминобензойной кислоты, 0,085 г бромтимолового синего, 2,7 г агара микробиологического, 5,5 г глюкозы, 2,5 г 5-аминосалициловой кислоты, 1,25 г трис-буфера, 0,65 г натрия углекислого и 0,00015 г бриллиантового зеленого. Далее - по примеру 1.

Пример 3. Отличается от примера 1,2 тем, что в 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 40 г сухого питательного агара, 5,0 г экстракта кормовых дрожжей, 0,02 г парааминобензойной кислоты, 0,09 г бромтимолового синего, 3,0 г агара микробиологического, 6,0 г глюкозы, 3,0 г 5-аминосалициловой кислоты, 1,5 г трис-буфера, 0,7 г натрия углекислого и 0,0002 г бриллиантового зеленого. Далее - по примеру 1, 2.

Предлагаемая среда поддерживает рост всех БГКП. Через 24 ч инкубации посевов (при 37±1°C) на предлагаемой среде K.pneumoniae, K.oxytoca и K.mobilis формируют типичные колонии коричневого цвета, диаметром от 1,5 до 2,0 мм в S-форме. При этом вокруг колоний клебсиелл четко виден коричневый преципитат. Колонии остальных энтеробактерий - эшерихий, цитробактера, энтеробактера, серраций, протея и др. вырастают в виде типичных для каждого вида колоний желтого цвета на фоне бутылочно-зеленого цвета питательной среды. Коричневый преципитат вокруг этих колоний отсутствует (см. таблицу).

Использование предлагаемой среды позволяет значительно сократить сроки идентификации клебсиелл и снизить материальные затраты.

Библиографические данные

1. Бондаренко В.М., Баркус М.М. Энтеротоксичная способность штаммов родов Klebsiella и Enterobacter, выделенных при острых кишечных заболеваниях у детей. ЖМЭИ, 1986, 7, с.28-32.

2. Бойко О.В., Николаев А.А., Бойко А.В., Луцкий Д.А. Питательная среда для выделения клебсиелл. Бюллетень "Изобретения, полезные модели", М., 2003, № 34, ч.2, с.522.

3. Горченина Л.В., Киселева Б.С. Среды для выделения клебсиелл. ЖМЭИ, 1985, 1, с.19-22.

4. Ибрагимов Ф.Х. и др. Селективная питательная среда для выделения клебсиелл БИПМ, 2004, № 30, 1 ч., с.140.

5. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. Клебсиллезные инфекции. М., 1996, с.9-39, 47, 63-64, 69-70, 79, 114.

6. Мари П.Р., Шей И.Р. Клиническая микробиология. Краткое руководство. Пер. с англ. М., 2006, с.52-72, 386.

7. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М., 2003, с.63-64.

8. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. Под редакцией А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С.Ещиной, М., 2004., 525, 535-546.

9. Сандра Ф.Д. и др. (США). Питательная среда для выделения Klebsiell / Enterobacter. Патент № 708998. БИПМ, 1980, № 1, с.260.

10. Саркулова М.Н. Микробиологическая характеристика возбудителей внутрибольничных инфекций у урологических больных. ЖМЭИ, 2005, 5, с.101-103.

11. Сидоренко С.В., Резван С.П., Еремина Л.В. и др. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и антибиотикорезистентность среди их возбудителей. Ж. Антибиотики и химиотерапия. 2005, 2-3, т.50, с.33-41.

12. Энтеробактерии. Руководство для врачей. Под ред. В.И.Покровского. М., 1985, с.171-175, 181-193, 186.

13. Ellens, D.J. and Gielkens, A.L.J. J. Immunol. Meth. 37, 325 (1980).

14. "Sigma". Каталог реактивов для биохимии и исследований в области естественных наук. 2002-2003, с.157.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ПРЕДЛАГАЕМОЙ СРЕДЫ И ИЗВЕСТНОЙ, ВЗЯТОЙ ЗА ПРОТОТИП.

Тест - штаммы Известная среда Предлагаемая среда Инозит Цвет колоний 5-аминосалициловая кислота Цвет колоний 1. K. pneumoniae 3534/51 + желтый + Коричневый преципитат 2. K. oxytoca + желтый + Коричневый преципитат 3. K. mobilis + желтый + Коричневый преципитат 4. S. marcescens 1 + желтый - желтый 5. P. rettgori + желтый - желтый 6. Y. enterocolitica + желтый - желтый 7. E.coli Su 3912/41 O55 K:59 - синий - желтый 8. E. cloacae 10005 - синий - желтый 9. С. freundii 101/57 - синий - желтый 10. S. aureus 25923 рост отсутствует рост отсутствует рост отсутствует рост отсутствует

Изобретение относится к микробиологии, в частности к клинической и санитарной микробиологии, и может быть использовано при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды при подозрении на клебсиеллез. Питательная среда содержит сухой питательный агар, глюкозу, 5-аминосалициловую кислоту, экстракт кормовых дрожжей, парааминобензойную кислоту, бромтимоловый синий, трис-буфер, натрий углекислый, бриллиантовый зеленый и агар микробиологический. Изобретение позволяет сократить сроки идентификации клебсиелл. 1 табл.

Хромогенная питательная среда для выявления и идентификации клебсиелл, содержащая источник азота, 5-аминосалициловую кислоту, бромтимоловый синий, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит глюкозу, парааминобензойную кислоту, экстракт кормовых дрожжей, трис-буфер, натрий углекислый, бриллиантовый зеленый, а в качестве источника азота - сухой питательный агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:
питательный агар, сухой 35,0-40 глюкоза 5,0-6,0 5-аминосалициловая кислота 2,0-3,0 экстракт кормовых дрожжей 3,0-5,0 парааминобензойная кислота 0,01-0,02 бромтимоловый синий 0,08-0,09 трис-буфер 1,0-1,5 натрий углекислый 0,6-0,7 бриллиантовый зеленый 0,0001-0,0002 агар микробиологический 2,5-3,0