СЕЛЕКТИВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕБСИЕЛЛ Российский патент 2005 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/22 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в лабораториях при бактериологической диагностике заболеваний, вызываемых клебсиеллами, а также для выделения этих бактерий из различных объектов при санитарно-микробиологических исследованиях.

Клебсиеллы часто являются возбудителями заболеваний людей (пневмонии, озена, отиты, циститы, гастроэнтериты и др.) и животных (маститы, пневмонии, септицемии и др.). Клебсиеллы относят и к группе возбудителей внутрибольничных инфекций. Клинические проявления этих заболеваний разнообразны, что определяет значимость результатов бактериологического исследования. Ввиду высокой изменчивости резистентности к антибиотикам и других биологических свойств клебсиелл выделение чистых культур необходимо для диагностики, оценки их патогенности, разработки тактики рационального лечения и др. (Семина Н.А., Ковалева Е.П., Тихомиров Е.Д. Внутрибольничные инфекции //Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. - М: Медицина, 1983, - том 1, - с.463-465.)

Из практики медицины известно, что для выделения клебсиелл используют дифференциально-диагностическую среду Эндо, содержащую питательный агар, лактозу и буферную систему. Среда предназначена для выделения энтеробактерий, оказывает ингибирующее действие только на грамположительную микрофлору.

На этой среде клебсиеллы образуют лактозоположительные колонии, напоминающие колонии других бактерий. Колонии клебсиелл могут быть различных размеров, формы и окраски (бесцветные, белые, бежевые, желтые).

Недостатком этой среды является то, что на этой среде помимо клебсиелл хорошо растут эшерихии, протеи и другие бактерии, что затрудняет отбор колоний для дальнейшей идентификации (Б.С.Киселева в кн. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1985, с.171).

Известен способ выделения клебсиелл на среде Плоскирева, используемой для выделения в основном шигелл и сальмонелл. В состав среды входит питательный агар, лактоза, нейтральный красный, буферная система и ингибирующие вещества (соли желчных кислот, иод, бриллиантовый зеленый), которые подавляют рост грамположительной микрофлоры, задерживают роение протея, угнетают размножение эшерихий и некоторых других бактерий (Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И., Поздеева O.K. ГЭОТАР. М.: Медицина, 1998, с.392-393; Н.А.Хоменко в кн. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1985, с.265-266).

Недостатком этой среды также является то, что на ней помимо клебсиелл хорошо растут энтеробакторы и другие бактерии, образующие сходные по размеру и цвету колонии, что затрудняет их идентификацию (Б.С.Киселева в кн. Энтеробактерии. М.: Медицина 1985, с.178).

Наиболее близкой к заявляемой является агаровая среда К-2. В состав среды К-2 входят агар-агар, хлорид натрия, сульфат магния, сульфат калия, двузамещенный фосфат калия, однозамещенный фосфат калия, рафиноза, бромтимоловый синий, кристаллический фиолетовый, мочевина. На этой среде после 16-18 часовой инкубации клебсиеллы образуют блестящие слизистые колонии. Окраска колоний различная - от желтых или зеленых с желтым центром до голубых (Г.П.Калина. Среды узконаправленного действия для обнаружения клебсиелл // Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1980, - №6, - с.28-32).

Сходство данной среды с предлагаемой заключается в том, что обе они являются специальными средами для выделения клебсиелл и основаны на способности этих бактерий размножаться в среде с единственными источниками азотного и углеводного питания.

Однако среда К-2 имеет следующие недостатки:

- недостаточная селективность, обусловленная неполным подавлением роста энтеробактеров, цитробактеров и некоторых других бактерий, что при посеве субстратов с обилием сопутствующей микрофлоры приводит к увеличению числа отсеваемых для идентификации колоний;

- отсутствие четкого отличия колоний клебсиелл по цвету;

- сложный многокомпонентный состав.

Цель изобретения - повышение селективных и дифференциально-диагностических свойств плотной агаровой среды, предназначенной для выделения клебсиелл.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - создание в агаровой среде условий, благоприятных для размножения клебсиелл и неблагоприятных для роста других бактерий. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата.

Решение поставленной задачи заключается в том, что для обеднения органическим субстратом в составе среды вместо органического источника азота (мочевина) используется минеральный (нитрат калия). Среда содержит антибиотик карбенициллин и не содержит хлорида натрия с целью усиления неблагоприятных условий для роста посторонней микрофлоры. Сахароза служит источником углеводного питания и вместе с бромтимоловым синим составляет индикаторную систему. Эти признаки являются существенными и отличительными от прототипа.

Для приготовления среды используются компоненты в следующих количествах, г:

Агар-агар15.0-20.0Нитрат калия1.8-2.0Сульфат магния0.15-0.20Сахароза15.0-20.0Бромтимоловый синий0.04-0.05Карбенициллин0.010-0.015Вода дистиллированная, млДо 1000рН среды7.6-7.8

Навески всех компонентов, за исключением сахарозы, карбенициллина и бромтимолового синего, растворяют в воде и доводят до кипения. Устанавливают рН и стерилизуют при 0.5 атм в течение 20 мин. В таком состоянии среда может храниться при комнатной температуре в течение 3 месяцев. Перед использованием среду расплавляют, при температуре 45-50°С вносят остальные компоненты и разливают в чашки Петри. Цвет среды - синий. Через 18 часов инкубации при 37°С клебсиеллы формируют слизистые колонии круглой формы, оранжевого цвета, диаметром 1,5-2,5 мм, четко контрастирующие на синем фоне среды.

Предлагаемая среда прошла апробацию при исследованиях 147 образцов в микробиологической лаборатории НИИ Краевой инфекционной патологии Астраханской медицинской академии, в микробиологической лаборатории НПМК «Экологическая медицина» и лаборатории экологии и индикации возбудителей природноочаговых инфекций Астраханской противочумной станции МЗ РФ в течение 2000-2002 годов. Ниже приводятся результаты сравнительной оценки качества предлагаемой среды и прототипа (примеры 1 и 2).

Пример 1.

Для определения ростовых качеств предлагаемой среды производили посев односуточных культур K.pneumoniae (4 штамма) и K.oxytoca (4 штамма) на предлагаемую среду (агар-агар 15.0, нитрат калия 1.8, сульфат магния 0.15, сахароза 15.0, бромтимоловый синий 0.04, карбенициллин 0.01, вода дистиллированная до 1.0 л, рН среды 7.6-7.8), среду К-2, среду Эндо и питательный агар АГВ. Посевная доза 100 клеток. Посев культур в объеме 0.2 мл производили на 5 чашек Петри каждой среды. Через 18 часов инкубации при 37°С число колоний на предлагаемой среде составило 92.0±4.6%; на среде К-2 выросло 82.4±3.8%; на среде Эндо 88.2±3.6% от числа колоний, сформированных на питательном агаре.

Для оценки селективных свойств производили посев на предлагаемую среду и среду К-2 различных видов бактерий в количестве 100 клеток. Результаты представлены в таблице 1. Данные таблицы 1 показывают, что селективные качества обеих сред высокие, но в отношении E.coli, E.cloacae, E.aerogenes, C.freundii это свойство предлагаемой среды более выражено, чем у среды К-2.

При посеве микробной смеси, состоящей из E.coli, P.vulgaris, K.pneumoniae в количестве 10⁵, 10⁵, и 10² клеток соответственно на предлагаемую среду и среду К-2, через 18 часов на предлагаемой среде выросли только колонии клебсиелл. На среде К-2 выросли колонии клебсиелл, незначительное количество очень мелких колоний эшерихий и единичные P.vulgaris. Причем выделение чистых культур клебсиелл было затруднено из-за примеси эшрихий и протеев.

Результаты опытов с чистыми культурами бактерий (таблица 1.) свидетельствуют о высоких ростовых для клебсиелл качествах предлагаемой среды и значительном преимуществе в сравнении с прототипом по способности подавлять размножение других бактерий.

Пример 2.

5 образцов испражнений здоровых лиц искусственно заражали K.pneumoniae в количестве 10, 10² и 10³ клеток в 0.1 мл. Посев материала производили в объеме 0.1 мл. на предлагаемую среду (агар-агар 20.0, нитрат калия 2.0, сульфат магния 0.20, сахароза 20.0, бромтимоловый синий 0.05, карбенициллин 0.015, вода дистиллированная до 1.0 л, рН среды 7.6-7.8), и среду К-2. Через 18 часов инкубации при 37°С клебсиеллы были выделены на обеих средах из проб, содержащих более 10 клеток в 0.1 мл. При дозе 10 клеток единичные колонии клебсиелл выросли из посевов 5 образцов на предлагаемой среде и 3 на среде К-2.

На предлагаемой среде выросли только колонии клебсиелл, идентификация которых была облегчена ввиду их оранжевой окраски.

Для оценки качества предлагаемой среды проводили исследование материала от больных различными воспалительными заболеваниями и проб речной воды. Пробы речной воды предварительно разводили в 10 раз кипяченой водопроводной водой и сеяли в объеме 0.5 мл на чашку.

Результаты этих исследований, представленные в таблице 2, показывают преимущества предлагаемой среды в сравнении с прототипом - средой К-2 при посеве материала с обилием сопутствующей микрофлоры (испражнения больных, речная вода). При использовании других, умеренно обсемененных сопутствующей микрофлорой субстратов отличий не выявлено. Следует отметить, что во всех случаях клебсиеллы были выделены из одних и тех же проб параллельно на двух средах.

Таким образом, предлагается селективная дифференциально-диагностическая плотная питательная среда для выделения клебсиелл, в которой минеральный источник азота (нитрат калия) и углевод (сахароза) создают условия для размножения клебсиелл. Карбенициллин и отсутствие органических соединений, хлорида натрия, препятствуют росту других бактерий. Дифференцирование колоний клебсиелл по цвету достигается индикаторной системой сахароза-бромтимоловый синий.

Преимущества предлагаемой среды в сравнении с прототипом состоят:

- в повышении чувствительности и селективности;

- в выраженном отличии колоний клебсиелл по окраске, что облегчает идентификацию;

- в меньшем количестве компонентов среды

Предлагаемая среда может быть рекомендована для выделения клебсиелл из материала от больных людей и других субстратов, а также для отделения клебсиелл из смешанных культур различных бактерий.

Таблица 1
Интенсивность роста бактерий на предлагаемой среде и среде К-2Вид бактерийЧисло штаммовКоличество выделенных культур и характер ростаПредлагаемая средаСреда К-2УдовлетворительныйСлабыйОтсутствуетУдовлетворительныйСлабыйОтсутствуетK.pneumoniae8800800E.coli8008044P.vulgaris4000000P.mirabilis4000000E.cloacae8017062E.aerogenes6006051C.freundii40.04040S.sonnei4004004S.flexneri4004004S.typhimurium6006006St.aureus1000100010

Примечание:

Удовлетворительный рост - размеры колоний соответствуют таковым на питательном агаре.

Слабый рост - колонии диаметром 0.5 мм и менее.

Таблица 2
Высеваемость клебсиелл из различных субстратовИсследуемый субстратЧисло пробКоличество положительных пробПредлагаемая средаСреда К-2Испражнения больных5811 (18,9%)7 (12%)Мокрота223 (13,6%)2 (9%)Моча304 (13,3%)3 (10%)Отделяемое ран282 (7,1%)3 (11,7%)Отделяемое женских половых органов213 (14,3%)2 (9,5%)Отделяемое из ушей142 (14,2%)2 (14,2%)Речная вода206 (30%)4 (20%)

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к бактериологической диагностике вызываемых клебсиеллами заболеваний, а также к санитарной микробиологии. Изобретение касается плотной агаровой среды, на которой удовлетворительно растут клебсиеллы. Состав питательной среды обеднен и органический азотный субстрат заменен на минеральный. Среда содержит антибиотик карбенициллин и не содержит хлорида натрия для усиления неблагоприятных для роста посторонней микрофлоры условий. Сахароза служит источником углеводного питания и вместе с бромтимоловым синим составляет индикаторную систему, благодаря которой среда имеет синий цвет. Колонии клебсиелл на данной среде оранжевого цвета. Чувствительность среды - 10 клеток. Рост сопутствующей микрофлоры угнетен или отсутствует. Использование среды упрощает идентификацию клебсиелл, приобретающих при росте на среде специфическое окрашивание. 2 табл.

Селективная питательная среда для клебсиелл, включающая агар-агар, сульфат магния, бромтимоловый синий, углевод, источник азота и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит антибиотик карбенициллин, в качестве углевода она содержит сахарозу, а в качестве источника азота - нитрат калия при следующем количественном соотношении компонентов:

Агар-агар15,0-20,0 гСульфат магния0,15-0,20 гНитрат калия1,8-2,0 гСахароза15,0-20,0 гБромтимоловый синий, 1% водный раствор4,0-5,0 млКарбенициллин0,010-0,015 гДистиллированная водаДо 1000 мл,рН7,6-7,8