МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ЭНДО ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12Q1/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к санитарной и клинической микробиологии, и может быть использовано при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды на наличие как патогенных, так и условно-патогенных энтеробактерий.

Как известно, питательная среда Эндо является одной из наиболее широко используемых сред в бактериологической практике для первичного посева исследуемого материала с целью выявления как патогенных, так и условно-патогенных энтеробактерий (5, 10, 2, 8). Также назначением среды Эндо, согласно действующим САНПиН, является использование ее при санитарном микробиологическом контроле объектов окружающей среды, в том числе воды и пищевых продуктов (6). Питательная среда Эндо - это традиционная дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения грамотрицательных бактерий, в которой заложен принцип ферментации лактозы. Однако недостаток среды заключается в том, что среда Эндо не подавляет «роение» протея, в силу чего в случае наличия в микробной ассоциации «роящихся» форм протеев (Proteus mirabilis, Proteus vulgaris) невозможно выделить изолированную колонию, а также произвести подсчет числа выросших колоний, вследствие образования сплошной пленки протеев на поверхности среды. Следует отметить, что именно эти два вида протеев наиболее часто выделяются как при клинических, так и при санитарных исследованиях (7). Разработанные ранее многочисленные модификации среды Эндо не устраняют этого недостатка (4, 9).

При проведении исследований по избавлению от этого недостатка нами было обнаружено, что только при сочетанном внесении в среду Эндо натриевых солей желчных кислот и L-триптофана обеспечивается рост «роящихся» форм протеев в О-Н-форме (т.е. без «роения»), а также выявляется специфический фермент протеев триптофандезаминаза.

В состав известной среды Эндо, согласно каталогам различных производителей, входят в г/л (1,3):

Причиной, препятствующей достижению указанного ниже технического результата при использовании сухой питательной среды для выделения энтеробактерий, принятой за прототип, является образование пленки протеями (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis), что не дает возможности провести количественный учет выросших колоний и выделить культуры в чистом виде (Табл. 1)

Задачей изобретения является создание модифицированной питательной среды Эндо, позволяющей подавить «роение» протеев, что в случае наличия их в исследуемой микробной ассоциации позволит проводить эффективный количественный учет энтеробактерий.

Для достижения поставленной задачи в известную среду Эндо добавляют натриевые соли желчных кислот и L-триптофан в определенных концетрациях, сочетание которых позволяет подавить «роение» протеев и выявить специфический фермент протеев - триптофандезаминазу. Под воздействием триптофандезаминазы протеев L-триптофан расщепляется с образованием продукта вишнево-коричневого цвета, окрашивающего только колонии протеев и среду вокруг них в вишнево-коричневый цвет.

Для микроорганизмов, не продуцирующих триптофандезаминазу, в составе среды присутствуют лактоза и фуксин, которые позволяют выявить образование кислоты из лактозы при росте указанных микроорганизмов, вследствие чего они окрашиваются в красный цвет в отличие от колоний протеев вишнево-коричневого цвета. Лактозоотрицательные энтеробактерии вырастают на среде бесцветного цвета. Идентификация протеев на предлагаемой среде осуществляется одновременно с их выделением, т.е. одноэтапно. «Роение» протеев ингибируется, в отличие от традиционной среды Эндо, взятой за прототип. Грамположительные микроорганизмы подавляются при посеве из разведения 10^-1 в результате введения в среду фуксина основного.

Состав предлагаемой среды Эндо в г/л дистиллированной воды:

Гидролизат кильки панкреатический 15,0-16,0 Экстракт дрожжей кормовых 0,65-0,7 Лактоза 10,5-11,0 Фуксин основной 0,2-0,25 Натрия сульфит 0,8-0,85 Натрия хлорид 4,0-5,0 Натрия карбонат 0,025-0,035 Натриевые соли желчных кислот (фирма «Oxoid») 1,4-1,6 L-триптофан 4,0-5,0 Агар микробиологический 7,0-7,8

Данный состав среды обеспечивает четкую дифференциацию по цвету протеев (вишнево-коричневого с таким же преципитатом) от патогенных энтеробактерий (бесцветных) и условно-патогенных энтеробактерий (красных), что не представляется возможным при использовании традиционной среды Эндо.

Заявляемую питательную среду Эндо для выявления и идентификации энтеробактерий получают следующим образом.

Пример 1. В 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 15,0 г гидролизата кильки панкреатического, 0,65 г экстракта кормовых дрожжей, 10,5 г лактозы, 0,2 г фуксина основного, 7,0 г агара микробиологического, 4,0 г L-триптофана, 1,4 г натриевых солей желчных кислот, 0,8 г натрия сульфита, 4,0 г натрия хлорида и 0,025 г натрия карбоната. Смесь тщательно перемешивают, трехкратно кипятят по 1-2 мин при помешивании, не допуская пригорания агара, до появления крупнопузырчатой пены. Среду охлаждают до температуры 45-50°C, после чего разливают в стерильные чашки Петри. После застывания агаровой пластинки чашки со средой подсушивают в термостате при 37°C в течение 50-60 мин с соблюдением правил асептики. Готовая к употреблению среда прозрачная, бледно-розового цвета, pH среды 7,4±0,2. Исследуемый материал наносят на поверхность среды и растирают стерильным шпателем. Инкубируют посев при температуре 37°C в течение 24 ч.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 15,5 г гидролизата кильки панкреатического, 0,67 г экстракта кормовых дрожжей, 10,7 г лактозы, 0,23 г фуксина основного, 7,04 г агара микробиологического, 4,5 г L-триптофана, 1,5 г натриевых солей желчных кислот, 0,83 г натрия сульфита, 4,5 г натрия хлорида и 0,03 г натрия карбоната. Далее - по примеру 1.

Пример 3. Отличается от примеров 1 и 2 тем, что в 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 16,0 г гидролизата кильки панкреатического, 0,7 г экстракта кормовых дрожжей, 11,0 г лактозы, 0,25 г фуксина основного, 7,8 г агара микробиологического, 5,0 г L-триптофана, 1,6 г натриевых солей желчных кислот, 0,85 г натрия сульфита, 5,0 г натрия хлорида и 0,035 г натрия карбоната. Далее - по примеру 1.

Через 24 ч инкубации посевов (при 37±1°C) на предлагаемой среде патогенные энтеробактерии (Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Shigella sonnei S-form) формируют типичные колонии бесцветного цвета, диаметром от 1,5 до 2,0 мм в S-форме. Колонии протеев вырастают вишнево-коричневого цвета, в O-H форме, диаметром 2,5-3,0 мм. При этом вокруг колоний протеев четко виден преципитат вишнево-коричневого цвета. Колонии условно-патогенных энтеробактерий - эшерихий, клебсиелл, цитробактера, энтеробактера, серраций вырастают в виде типичных для каждого вида колоний красного цвета, иногда с металлическим блеском, на фоне бледно-розового цвета питательной среды (Табл. 1).

Использование предлагаемой среды позволяет выделить культуру в чистом виде и провести точный количественный учет выросших микроорганизмов, что особенно важно при проведении клинических и санитарных исследований.

Литература

1. Диагностические препараты. Каталог продукции ФБУН ГНЦ ПМБ. - Оболенск. - 2012 г. - С. 14.

2. Загайнова А.В. Способ определения степени эпидемической опасности патогенных и потенциально-патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования. / Рахманин Ю.А. // Патент на изобретение №2446214 от 27.03.2012 г.

3. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. - М.: Медицина, 2003. - С. 33-34.

4. Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях. Под ред. Г.Я. Синая и О.Г. Биргера. - М. 1949. - С. 64.

5. Приказ МЗ СССР №535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». - М.: Медицина, 1985.

6. СанПиН 2.3.2.1280-02. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Дополнения и изменения N 2 к СанПиН 2.3.2.1078-01 - М.: Минздрав России, 2003. - 32 с.

7. Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований. - С-Пб.: СпецЛит, 2007. - С. 359-362.

8. Снежков Н.И. Способ выявления возбудителей пищевых токсикоинфекций из продуктов животноводства. / Смирнова В.Н. // Патент на изобретение №2175443 от 27.10.2001 г.

9. Справочник по микробиологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. - М.: Медицина, 1982. - С. 462.

10. Энтеробактерии: Руководство для врачей. Под ред. В.И. Покровского. - М.: Медицина, 1985. - 318 с.

Изобретение относится к клинической и санитарной микробиологии и может быть использовано при исследовании различного биологического материала, а также объектов окружающей среды на наличие как патогенных, так и условно-патогенных энтеробактерий. Модифицированная питательная среда Эндо содержит гидролизат кильки панкреатический, экстракт дрожжей кормовых, лактозу, фуксин основной, натрия сульфит, натрия хлорид, натрия карбонат, натриевые соли желчных кислот, L-триптофан, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет выделить культуру в чистом виде и провести точный количественный учет выросших микроорганизмов. 1 табл., 3 пр.

Модифицированная питательная среда Эндо для выявления и идентификации энтеробактерий, содержащая в качестве источника азота гидрализат кильки панкреатический, индикатор фуксин основной, лактозу, натрия сульфит, натрия хлорид, натрия карбонат и агар микробиологический, отличающаяся тем, что она дополнительно включает натриевые соли желчных кислот и L-триптофан при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:
гидролизат кильки панкреатический 15,0-16,0 экстракт дрожжей кормовых 0,65-0,7 лактоза 10,5-11,0 фуксин основной 0,2-0,25 натрия сульфит 0,8-0,85 натрия хлорид 4,0-5,0 натрия карбонат 0,025-0,035 натриевые соли желчных кислот 1,4-1,6 L-триптофан 4,0-5,0 агар микробиологический 7,0-7,8