СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭПИДЗНАЧИМОСТИ ЧУМНОГО МИКРОБА В БЛОХАХ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/04 G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и эпидемиологии инфекционных болезней и может быть использовано при бактериологическом исследовании блох (в населенных пунктах при интенсивной эпизоотии, при реальной возможности контакта людей с зараженными блохами) на чуму для проведения противочумных мероприятий.

Известен бактериологический метод выделения чумного микроба от блох путем посева их суспензии на питательные среды для выращивания культуры возбудителя с последующей его идентификацией [Основы лабораторной техники при работе с возбудителями особо опасных инфекций. - Алма-Ата, 1982, с. 43 - 44] .

Известен способ подготовки эктопаразитов, по которому блох без промывания лишают подвижности в парах эфира и растирают в ступке с физиологическим раствором NaCl [Н.И. Николаев. "Чума (клиника, диагностика, лечение и профилактика)". - М.: "Медицина", 1968, с. 118].

Недостатком этих методов является невозможность их применения при исследовании блох, содержащих единичные клетки чумного микроба, а также при исследовании насекомых, погибших, загнивших или мацерированных от длительного нахождения в воде или в физиологическом растворе, поскольку в них развивается посторонняя микрофлора, затрудняющая выделение чистой культуры возбудителя чумы, а также отсутствие информации о наличии (отсутствии) детерминант вирулентности возбудителя чумы.

Наиболее близкой к заявленному способу является схема лабораторного исследования материала на возбудителя чумы, в том числе и эктопаразитов ["Руководство по профилактике чумы". Под ред. проф. Наумова А.В., проф. Самойловой Л.В. - Саратов, 1992, с. 200 - 266].

Схема предусматривает бактериоскопию, посев на питательные среды с использованием генцианвиолета для подавления роста посторонней микрофлоры, пересев на агар с целью выделения чистой культуры, биологические пробы, определение чувствительности чистой культуры к бактериофагу и антибиотикам. При этом окончательные результаты по идентификации чумного микроба, по чувствительности к бактериофагу, результаты иммунологических исследований получают через 48 - 72 ч, по чувствительности к антибиотику - через 72 ч, биопробы - через 96 ч с начала исследований.

Длительность исследований затрудняет оперативное осуществление противоэпидемических (в том числе лечебных) и профилактических мероприятий в опасных эпизоотологических ситуациях.

Схема предусматривает ускоренную идентификацию возбудителя методом ПЦР путем многократного клонирования специфичных для чумного микроба последовательностей фрагментов в ДНК с помощью видоспецифичных праймеров на основе последовательностей ДНК плазмид pFra, pCad, pPst.

Для определения вирулентности по наличию колоний Pgm⁺ рекомендуется анализ способности исследуемой культуры сорбировать пигмент из плотной среды Джексона-Берроуза. При этом используется чистая культура возбудителя, на ее получение требуется длительное время. Целью изобретения является ускоренное обнаружение возбудителя чумы в блохах, контаминированных посторонней микрофлорой, с одновременным получением информации о степени эпидемической опасности культуры в посевах нативного материала (блох) по наличию (отсутствию) детерминант вирулентности, обусловленных плазмидной и хромосомной последовательностями генов и ее чувствительности к антибиотикам.

Поставленная цель достигается тем, что суспензию блох готовят на 0,9% растворе хлорида натрия, делят ее на 3 части и параллельно проводят идентификацию возбудителей методом ПЦР, определение способности сорбировать пигмент из плотной питательной среды Джексона-Берроуза и чувствительности к антибиотикам с помощью дисков на плотной среде агара Хоттингера, при этом в плотные среды добавляют генцианвиолет в количестве 0,02 - 0,03 мкг/мл.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Использование физиологического раствора поваренной соли в качестве основы для приготовления суспензии из блох создает условия для сохранения целостности клеточной стенки чумного микроба (в отличие от традиционно применяемой дистиллированной воды). Это необходимо для одновременного исследования части суспензии с целью определения чувствительности к антибиотикам и наличии Pgm⁺ у чумных бактерий, содержащихся в природном материале (блохах). Добавление в твердые среды (Джексона-Берроуза и агара Хоттингера) генцианвиолета при бактериологическом исследовании блох обеспечивает рост чистой культуры чумного микроба, подавляя рост других микроорганизмов, что позволяет получить достоверные результаты о наличии (отсутствии) признака Pgm⁺ и чувствительности (устойчивости) к антибиотикам чумных бактерий, содержащихся в блохах.

По сравнению с классическими методами бактериологического исследования блох на чуму заявляемый способ позволяет избежать несколько трудоемких этапов:
1) выделение чистой культуры чумного микроба;
2) определение ее чувствительности к бактериофагам;
3) определение типичных культурально-морфологических и биохимических признаков, что на 60 часов раньше позволяет обнаружить возбудителя чумы в блохах и на 48 часов раньше определить его антибиотиокочувствительность.

Способ осуществляется следующим образом. Приготовленных для исследования эктопаразитов (от 5 до 15 блох) тщательно промывают 70^o спиртом, затем двукратно отмывают в стерильном растворе 0,9% хлорида натрия в лунках полистироловых планшет (предварительно обожженных пламенем спиртового факела), растирают стерильной стеклянной палочкой с оплавленным концом. Затем к лунку полистироловой пластины вносят стерильный 0,9% раствор хлорида натрия до 0,8 - 1,2 мл.

Выделяют плазмидную ДНК методом щелочного лизиса взвеси с очисткой ДНК фенол-хлороформом и переосаждением в этаноле. ПЦР проводят в соответствии с инструкцией изготовителя, используя набор НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (Москва), содержащий три пары праймеров для амплификации фрагментов ДНК плазмиды кальцийзависимости (665 н. п. ), плазмиды фракции I (501 н.п.) и плазмиды пестициногенности (443 н.п.). Визуализацию фрагментов амплификации осуществляют после электрофореза продуктов ПЦР в 1 - 2% агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Вирулентные культуры чумного микроба обладают последовательностями генов pFra, pCad, pPst. Признак пигментсорбции выявляют посевом 0,1 - 0,15 мл суспензии блох на каждую из трех чашек с синтетической средой Джексона-Берроуза (с добавлением 0,02 - 0,03 мкг/мл генцианвиолета) с последующей инкубацией при 28^oC. Вирулентные колонии бактерий чумы окрашены в темно-бурый цвет и составляют не менее 70% всех выросших.

Чувствительность чумных микробов в инфицированных блохах к антибиотикам определяют методом дисков фабричного производства с добавлением в питательную среду (агар Хоттингера) генцианвиолета (0,02 - 0,03 мкг/мл) для ингибирования роста посторонней микрофлоры. Суспензию блох по 0,1 - 0,15 мл высевают газоном на каждую из трех чашек агара, затем на середину каждого из 4-х сегментов чашек Петри (разделенной метками, нанесенными маркерами на дне чашки) накладывают по одному бумажному диску, пропитанному определенным антибиотиком (тетрациклином, стрептомицином, доксициклином, рифампицином, левомицитином, гентамицином, канамицином, цефалексином). Оценку определения антибиотикочувствительности штамма диско-диффузионным методом проводят по величине диаметра зоны задержки роста, включая и диаметр самого диска (отсутствие зоны задержки роста вокруг диска свидетельствует о нечувствительности к антибиотику, наличие задержки роста до 15 мм указывает на слабую чувствительность, от 15 до 25 мм - на то, что штамм является чувствительным к исследуемому антибиотику, свыше 25 мм - высокочувствительным). Предпочтительным является выбор антибиотиков, к которым обнаружена высокая чувствительность штамма, с учетом сведений о взаимной фармакологической совместимости антибактериальных препаратов.

Пример 1.

Берут 0,8 мл исследуемого материала, содержащего суспензию 5 блох, из которых 0,2 мл исследуют в ПЦР на наличие последовательностей генов плазмид pFra, pCad, pPst; по 0,1 мл высевают на три пластины со средой Джексона-Берроуза, содержащей генцианвиолет (0,02 мкг/мл); по 0,1 мл высевают на три пластины с агаром Хоттингера, содержащего 0,02 мкг/мл генцианвиолета, для определения чувствительности к антибиотикам (тетрациклину, стрептомицину, доксициклину, рифампицину, левомицитину, гентамицину, канамицину, цефалексину) диско-диффузионным методом. Через 12 часов с начала исследования обнаруживают искомые последовательности генов по результатам ПЦР, а через 24 - 36 часов - признак Pgm⁺ (детерминанту вирулентности, определяемую хромосомными последовательностями генов) и антибиотикочувствительность.

Пример 2.

Берут 0,9 мл исследуемого материала, содержащего суспензию 10 блох, из которых 0,4 мл исследуют в ПЦР на наличие последовательностей генов плазмид pFra, pCad, pPst; по 0,1 мл высевают на три пластины со средой Джексона-Берроуза, содержащей генцианвиолет (0,025 мкг/мл); по 0,1 мл - на 3 пластины с агаром Хоттингера, содержащего 0,025 мкг/мл генцианвиолета, для определения чувствительности к антибиотикам (тетрациклину, стрептомицину, доксициклину, рифампицину, левомицетину, гентамицину, канамицину, цефалексину) дискодиффузионным методом. Через 12 часов после начала исследования обнаруживают искомые последовательности генов плазмид pFra, PCad, pPsr по результатам ПЦР, а через 24 - 36 часов - признак Pgm⁺ (детерминанту вирулентности, определяемую хромосомными последовательностями генов) и антибиотикочувствительность.

Пример 3.

Берут 1,2 мл исследуемого материала, содержащего суспензию 15 блох, из которых 0,3 мл исследуют в ПЦР на наличие последовательностей генов плазмид pFra, pCad, pPst; по 0,15 мл высевают на три пластины со средой Джексона-Берроуза, содержащей генцианвиолет (0,03 мкг/мл); по 0,15 мл - на 3 пластины с агаром Хоттингера, содержащего 0,03 мкг/мл генцианвиолета, для определения чувствительности к антибиотикам (тетрациклину, стрептомицину, доксициклину, рифампицину, левомицетину, гентамицину, канамицину, цефалексину) диско-диффузионным методом. Через 12 часов после начала исследования обнаруживают искомые последовательности генов плазмид pFra, pCad, pPst по результатам ПЦР, а через 24 - 36 часов - признак Pgm⁺ (детерминанту вирулентности, определяемую хромосомными последовательностями генов) и антибиотикочувствительность.

Как показали экспериментальные исследования, заявляемые пределы содержания ингредиентов, входящих в состав суспензии и питательных сред, являются оптимальными для достижения поставленной цели, т.к. при уменьшении их содержания менее заявляемых пределов не происходит ингибиции роста посторонней микрофлоры, а при их увеличении подавляется рост чумного микроба.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в бактериологических исследованиях позволяет в кратчайшие сроки обнаружить возбудителя чумы в блоках с одновременным определением детерминант вирулентности, степени фенотипической экспрессии Pgm⁺ и его чувствительности к антибиотикам.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Может быть использовано при бактериологической диагностике объектов, подозрительных в качестве факторов передачи чумной инфекции. Готовят суспензию блох на 0,9% растворе хлорида натрия. Делят ее на 3 части. Одну часть суспензии блох 0,8 - 1,2 мл исследуют в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (0,3 - 0,4 мл) для обнаружения последовательности генов pFra, pCad, pPst. Вторую часть по 0,1 - 0,15 мл суспензии высевают на плотную питательную среду Джексона-Берроуза с генцианвиолетом (0,02 - 0,03 мкг/мл) для обнаружения признака Pgm⁺ (детерминированного хромосомной последовательностью генов). Третью часть по 0,1 - 0,15 мл суспензии высевают на агар Хоттингера с генцианвиолетом (0,02 - 0,03 мкг/мл) для определения чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков. Способ обеспечивает сокращение сроков обнаружения чумного микроба в блохах, позволяет одновременно определить его вирулентность и чувствительность к антибиотикам.

Способ обнаружения эпидзначимости чумного микроба в блохах, включающий подготовку суспензии исследуемого материала, идентификацию возбудителя методом ПЦР, определение способности сорбировать пигмент из плотной среды Дексона-Берроуза и чувствительности к антибиотикам с помощью бумажных дисков на плотной среде агара Хоттингера, отличающийся тем, что суспензию блох готовят на 0,9% растворе хлорида натрия, делят ее на три части и параллельно проводят ПЦР, определение пигментсорбции и антибиотикочувствительности, при этом в плотные питательные среды добавляют генцианвиолет в количестве 0,02 - 0,03 мг/мл.