СПРОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ BACILLUS ANTHRACIS В МОЛОКЕ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при лабораторном исследовании молока, контаминированного возбудителем сибирской язвы (Bacillus anthracis) или подозрительного на зараженность.

Сложность бактериологического исследования молока связана с тем, что оно само является прекрасной питательной средой для большинства микроорганизмов, в том числе и спорообразующих сапрофитов, которые попадают в молоко во время доения.

В последнее время при выявлении возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды (пробы почв, корма, шерсть и т.п.), контаминированного примесями сопутствующей микрофлоры, в том числе спорообразующими сапрофитами, успешно используется для культивирования проб дифференциально-диагностическая среда, содержащая питательный агар, ингибиторы роста посторонней микрофлоры (смесь полимиксина с триметопримом) и индикатор фенолфталеинфосфат натрия в количестве 0,01% на 1 мл среды. Эта среда (без фенолфталеинфосфата натрия) в сухом виде выпускается ФГУП "Аллерген" (Буравцева Н.П. Ярощук В.А. Ускоренный метод обнаружения возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале // Методические рекомендации. - М., 1989).

Однако использование этой среды при лабораторном исследовании молока, контаминированного малыми концентрациями микробных палочек В.anthracis (1-10 м.к./мл молока), оказалось малоэффективным.

Наиболее близким по назначению является способ обнаружения микробов в молоке с помощью высева пробы в питательные среды (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера// М. : Медицина, 1982. - С.422-428). Способ предусматривает смешивание исследуемых проб в различных разведениях с питательной средой, в качестве которой применяют питательный агар с 1% глюкозы на основе из смеси панкреотического перевара молока, мяса или казеина и дрожжевого аутолизата (в отношении 3:1), культивирование смеси при 30-32^oС в течение 3-х сут с последующим учетом образовавшихся колоний.

Способ оказался неэффективным при обнаружении возбудителя сибирской язвы, особенно, когда он находится в пробе в малых концентрациях.

Техническим результатом изобретения является повышение надежности обнаружения возбудителя сибирской язвы в молоке, подозрительного на зараженность или контаминированного возбудителем инфекции.

Указанный технический результат достигается тем, что исследуемую пробу предварительно перед посевом смешивают со смесью полимиксина М-сульфат 250 мкг и триметоприма 100-120 мкг в равных пропорциях на 1 мл молока, подращивают в течение 4-6 ч при 37^oС, затем центрифугируют при 5,0-5,5 тыс.об/мин. Культивирование верхнего слоя подращенной пробы ведут на дифференциально-диагностической среде в течение 18-20 ч при 37^oС, учет и дифференциацию выросших колоний проводят в парах аммиака.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Добавление в исследуемую пробу смеси полимиксина М-сульфата 250 мкг и триметоприма 100-120 мкг в равных пропорциях на 1 мл молока, подращивание смеси в течение 4-6 ч при 37^oС. Этот прием обеспечивает ингибирование сапрофитов.

Центрифугирование исследуемой пробы при 5 тыс. об/мин в течение 30-40 мин необходимо и достаточно для концентрирования микроорганизмов, при этом микроорганизмы переходят в верхний слой, в среднем слое микробов практически не остается.

Культивирование подращенной пробы на дифференциально-диагностической среде в течение 18-20 ч при 37^oС. Использование дифференциально-диагностической среды, содержащей питательный агар, проверенный на рост сибиреязвенного микроба, и ингибиторы роста сапрофитов обеспечивает достаточно быстрое культивирование возбудителя сибирской язвы при его содержании в исследуемой пробе менее 10 м.кл./мл молока. Учет образования колоний в парах аммиака обеспечивает четкую дифференциацию колоний сибиреязвенного микроба от близкородственных спорообразующих сапрофитов.

Возможность практического использования заявленного способа иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. В пробы молока (100 мл) вносили споры и вегетативные палочки 4-х штаммов В. anthracis (81/1, 1 СО, 71/12, 3БК₂ ) в таком количестве, чтобы конечная концентрация была 100 и 1000 м.кл на 1 мл молока. Затем часть проб оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 18 ч, другую часть проб после добавления микробов и смешивания центрифугировали при 5000 тыс. об/мин в течение 30 мин. С помощью пипетки отбирали молоко (1 мл) для лабораторного исследования из верхнего, среднего слоя и из осадка. Посев производили на дифференциально-диагностическую среду по 0,1 мл. С помощью шпателя пробу тщательно втирали в агар и культивировали посевы при 37^oС в течение 18 ч. Чашки Петри с выросшими колониями визуально просматривали и в случае наличия подозрительных на рост колоний сибиреязвенного микроба обрабатывали их парами аммиака. С этой целью в крышки от чашки Петри помещали фильтровальную бумагу, которую смачивали водным аммиаком, после этого на несколько секунд помещали на фильтровальную бумагу чашку с выросшими колониями. Под действием паров аммиака колонии сапрофитов изменяли свой цвет и становились розовыми, колонии сибиреязвенного микроба не изменяли своего цвета. Результаты приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, концентрирование микробов в молоке в верхнем слое в большей степени происходит при центрифугировании, при этом сроки исследования молока сокращались на сутки, т.к. методом отстаивания необходимо было выдерживать сроки до 18 ч.

Пример 2. Пробы молока с содержанием различных концентраций спор и вегетативных палочек B.anthracis от 1 до 1000 м.кл./мл молока исследовали в лабораторных условиях. В каждую пробу (100 мл) молока после добавления определенной концентрации возбудителя (спор или палочек) добавляли смесь полимиксина и триметоприма, 250 и 100 мкг на 1 мл молока соответственно, перемешивали и помещали в термостат при 37^oС на 5 ч. Затем пробу центрифугировали при 5,0 тыс.об/мин, после чего верхний слой молока (1 мл) высевали по 0,1 мл на чашки с дифференциально-диагностической средой. С помощью шпателя пробу тщательно втирали в агар и культивировали посевы при 37^oС в течение 18 ч. Чашки Петри с выросшими колониями визуально просматривали и в случае наличия подозрительных на рост колоний сибиреязвенного микроба обрабатывали их парами аммиака. С этой целью в крышки от чашки Петри помещали фильтровальную бумагу, которую смачивали водным аммиаком, после этого на несколько секунд помещали на фильтровальную бумагу чашку с выросшими колониями. Под действием паров аммиака колонии сапрофитов изменяли свой цвет и становились розовыми, колонии сибиреязвенного микроба не изменяли своего цвета. Параллельно высевали контрольные пробы без предварительного подращивания и концентрирования. Результаты приведены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что при предварительном подращивании микроба сибирской язвы с полимиксином и триметопримом и последующем центрифугировании удается выделить единичные особи возбудителя в то время, как при посеве только на дифференциально-диагностическую среду высевается лишь 20 часть внесенных в пробу микробов.

При исследовании молока, подозрительного на загрязненность сибиреязвенным микробом, в лабораторных условиях необходимо соблюдать все меры предосторожности, предусмотренные правилами режима работы с особо опасными инфекциями (Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности". М., 1994, - 151 с.). Центрифугирование можно проводить только в центрифужных стаканах с плотно завинчивающимися пробками, обеспечивающими надежность защиты от попадания сибиреязвенного микроба в окружающую среду.

Заявляемый способ был испытан в лабораторных исследованиях молока во время эпизоотии сибирской язвы среди коров в Красногвардейском районе Ставропольского края в 1996г.

Таким образом, заявляемый способ может найти широкое применение не только в лабораторных исследованиях молока, но и при эпизоотологическом мониторинге неблагополучных по сибирской язве регионах.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при лабораторном исследовании молока. Пробу смешивают со смесью полимиксина М-сульфата 250 мкг/мл и триметоприма 100-120 мкг/мл в равных пропорциях, подращивают в течение 4-6 ч при 37^oС, затем центрифугируют при 5-5,5 тыс. об/мин в течение 30-40 мин. Культивирование верхнего слоя подращенной пробы ведут на дифференциально-диагностической среде в течение 18-20 ч при 37^oС, а учет выросших колоний осуществляют в парах аммиака. Способ обеспечивает повышение надежности обнаружения возбудителя сибирской язвы в молоке. 2 табл.

Способ обнаружения Bacillus anthracis в молоке, включающий культивирование исследуемой пробы с последующим учетом выросших колоний, отличающийся тем, что исследуемую пробу предварительно смешивают со смесью полимиксина М-сульфата 250 мкг/мл и триметоприма 100-120 мкг/мл в равных пропорциях, подращивают в течение 4-6 ч при 37^oС, затем центрифугируют при 5-5,5 тыс. об/мин в течение 30-40 мин, культивирование верхнего слоя подращенной пробы ведут на дифференциально-диагностической среде в течение 18-20 ч при 37^oС, а учет выросших колоний осуществляют в парах аммиака.