СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Российский патент 1995 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к молекулярной биологии, конкретно к способу выделения высокополимерной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из крови человека. Выделенная данным способом ДНК может быть использована в гидридизационном анализе (ДНК-РНК зонды) и других областях молекулярно-биологических исследований, а также в практической медицине (диагностика наследственных заболеваний человека, судебная медицина, генная дактилоскопия).

Известен способ [1] выделения ДНК, заключающийся в том, что к 10 мл крови человека добавляют 90 мл холодного трис-НСl буфера, рН 7,6 содержащего сахарозу, хлористый магний, Тритон Х-100, и перемешивают в течение 30 мин при 4^оС. После лизиса клеток ядра центрифугируют, осаждают при 4000 об/мин 30 мин и суспендируют в 5 мл 0,075 М раствора хлористого натрия, содержащего ЭДТА, SDS и проназу Е. Данную смесь выдерживают 16 ч при 36^оС. Затем к лизату добавляют 2,5 мл 5 М ацетата калия, рН 4,8, выдерживают 30 мин при 4^оС, центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, осадок отбрасывают, ДНК из супернатанта осаждают добавлением двухкратного объема этанола. Выход ДНК не приведен.

Недостатками этого способа являются его длительность и многостадийность.

Известен способ [2], заключающийся в том, что к 10 мл замороженной крови добавляют раствор, содержащий хлористый натрий и ЭДТА, выдерживают при 37^оС и центрифугируют ядерный осадок. К осадку добавляют гуанидингидрохлорид, ацетат аммония и гомогенизируют. К гомогенату прибавляют раствор саркозила натрия и протеиназу К и выдерживают 1 ч при 60^оС. Затем смесь охлаждают и добавляют 35 мл этанола. Выпавшую ДНК промывают 70%-ным этанолом и растворяют в трис-HCl буфере рН 7,6, содержащем ЭДТА. Выход: из 1 мл крови - 20 мкг ДНК.

Недостатком такого способа является низкий выход целевого продукта.

Известен метод [3] выделения ДНК, состоящий из следующих стадий.

1. 10 мл крови, содержащей ЭДТА или цитрат натрия в качестве антикоагулянта, прибавляют к 60 мл буферного раствора при 4^оС и гомогенизируют, ядерную фракцию осаждают при 2500 g в течение 20 мин. Буферный раствор, содержащий 320 мМ сахарозу, 1% (V/V) Тритон Х-100, 5 мМ хлористый магний, 10 мМ трис-НСl, рН 7,6.

2. Осадок суспендируют в 8 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ хлористого натрия и прибавляют 0,8 мл 10% (W/V) детергента.

3. К лизату прибавляют 50 мкл протеиназы К и инкубируют 2-4 ч при 37^оС.

4. К смеси прибавляют 0,5 мл 5 М перхлората натрия и 8 мл смеси фенол-хлороформ, тщательно перемешивают и центрифугируют (2000 g, 10 мин, 10^оС).

5. Водную фазу экстрагируют смесью хлороформ - изоамиловый спирт и центрифугируют.

6. ДНК осаждают прибавлением двухкратного объема этанола, образовавшуюся "медузу" ДНК растворяют в течение ночи (4^оС) в 1 мл 10 мМ трис-HCl буфера рН 7,5 с 1 мМ ЭДТА.

7. К раствору ДНК прибавляют 100 мкл 20 SSC-стандартный солевой раствор (ISSC= 0,15 М NaCl+0,015 М цитрат Na+10^-3М ЭДТА) и 10 мкл рибонуклеазы, инкубируют 1 ч при 37^оС.

8. Раствор прибавляют 2 мл дистиллированной воды и экстрагируют равным объемом смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1).

9. ДНК из водной фазы осаждают двумя объемами этанола и центрифугируют при 5000 g, 5 мин, 5^оС. Осадок дважды промывают холодным 10%-ным этанолом и растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Выход: из 10 мл крови - 200-400 мкг ДНК. Данный способ получения ДНК в настоящее время является наиболее цитируемым в научной литературе, хотя он и является многостадийным.

К недостаткам данного способа следует отнести необходимость использования высокоочищенных ферментов - рибонуклеазы для удаления РНК и протеиназы К для удаления белка, а также необходимость использования большого набора реагентов и длительность процесса.

Целью изобретения является упрощение способа выделения ДНК из крови человека, что весьма актуально при проведении массовых анализов различных образцов крови.

Для достижения поставленной цели разработан способ выделения высокополимерной ДНК из крови человека, заключающийся в обработке образца крови 0,5-1% -ным раствором детергента - триметилоктадециламмоний хлорида в трис-НСl буфере, отделении осадка, солюбилизации его 1-1,5 М раствором хлористого натрия, осаждении ДНК этанолом. Выход 200-350 мкг ДНК в зависимости от содержания его в крови.

Существенным отличием заявляемого способа является использование хлорида триметилоктадециламмония в качестве детергента и 1-1,5 М раствора хлористого натрия для переведения ДНК в растворимое состояние. Обнаружено, что данный детергент в 0,5-1%-ной концентрации наряду с лизисом как клеточной, так и ядерной мембран способен связываться преимущественно с ДНК, переводя ее в нерастворимое состояние и, таким образом, предохраняя от действия нуклеаз. Использование данного детергента, который сочетает в себе свойства как лизирующего клеточные и ядерные мембраны агента, так и осадителя ДНК, позволило разработать практически одностадийный метод получения ДНК при минимальном количестве реактивов.

На фиг.1 приведен профиль хроматографии данного препарата на кальций-тартратном геле; на фиг.2 приведены данные, подтверждающие чистоту и нативность данного препарата, на фиг.3 - данные гибридизационного анализа.

На фиг. 1 даны А - хроматография на кальций-тартратном геле препарата ДНК, выделенного по заявляемому способу, Б - хроматография смеси РНК (1), денатурированной (2) и нативной (3) ДНК. Нанесение материала в 1М NaCl, приготовленном на трис-НСl буфере рН 8,5. Элюция линейным градиентом натрий-фосфатного буфера рН 6,8 2 х 25 мл (0-0,35 М), скорость хроматографии 40 мл/ч, колонка 0,5 х 1,0 см.

На фиг. 2 - электрофорез препаратов ДНК, выделенных из крови человека в 0,7%-ном агарозном геле, 1-3 препараты выделены фенольным методом (прототип), 4-6 - предлагаемым способом.

На фиг. 3 - радиоавтограмма гибридизационного анализа ДНК человека, ("Геномная дактилоскопия"). ДНК двух индивидумов (А, В) выделена по способу-прототипу (1,3) и по заявляемому (2,4), обработана рестриктазой Mval и подвергнута электрофорезу в 0,8% агарозном геле. Фрагментированную ДНК переносили на нитроцеллюлозные фильтры по Саузерну и гибридизовали с [³²P] - меченной ДНК фага М13. (Джинчарадзе А.Г., Иванов П.Л., Рысков А.П. //Докл. АН СССР. - 1987. - Т.295, N 1.-С.230-233).

Сравнительные характеристики известных и предлагаемого способа выделения ДНК даны в таблице.

П р и м е р 1. К 10 мл свежей крови или крови с консервантом приливают 10 мл 0,05 М трис-НСl буфера рН 7,4, содержащего 0,8 М NaCl и 1% (W/V) детергента, и выдерживают 15-20 мин при комнатной температуре, центрифугируют 10 мл при 5000 об/мин. Осадок промывают 0,025 М трис-HСl буфером рН 8,5, содержащим 0,4 М NaCl, и растворяют в 5 мл 1,5 М NaCl в течение 30 мин. Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин) и к супернатанту прибавляют равный объем холодного этанола. После образования "медузы" ДНК ее повторно растворяют в 0,025 М трис-НСl буфере рН 8,5, осадок удаляют центрифугированием, а в супернатант прибавляют равный объем холодного этанола. Полученную ДНК хранят в 70%-ном этаноле. Выход 350 мкг ДНК.

П р и м е р 2. К 10 мл крови прибавляют равный объем трис-НСl буфера рН 7,4, содержащего 0,5% детергента, 0,8 М NaCl. После инкубации в течение 20-30 мин осадок отделяют центрифугированием и обрабатывают, как в примере 1, используя для растворения 1 М NaCl. Выход 300 мкг ДНК. Вариации в количестве полученной ДНК обусловлены разными количествами лейкоцитов в исследуемых образцах крови. Характеристики полученной ДНК приведены на фиг.1-3.

Таким образом, метод позволяет в короткий срок получать препараты высокополимерной ДНК и может быть использован в серийных исследованиях ДНК из различных образцов крови. Получены положительные результаты по использованию данного препарата ДНК в гибридизационном анализе.

Использование: молекулярная биология. Сущность изобретения: способ выделения ДНК из крови человека заключается в обработке крови раствором хлорида триметилоктадециламмония, отделении и салюбилизации осадка при высокой ионной силе и дальнейшем осаждении ДНК из раствора этанолом. Полученный препарат характеризуется отсутствием примесей РНК и денатурированной ДНК.Спектральные характеристики подтверждают отсутствие белковых примесей. 3 ил.,1 табл.

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК из крови человека путем обработки крови раствором детергента в трис-HCl-буфере, отделения осадка с последующей его солюбилизацией и осаждением ДНК этанолом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве детергента используют триметилоктадециламмония хлорид в концентрации 0,5 - 1%, а солюбилизацию проводят в 1 - 1,5 М растворе хлористого натрия.