Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты Советский патент 1984 года по МПК C07H21/04 C12P19/34 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и предназначено для выделения ДНК из тканей животных. Известен способ выделения ДНК из тканей, заключающийся в том, что после разрушения клеток путем инкубации 18 ч в среде, содержащей 0,14 М NaCl 0,01 М цитрата Na, 0,1 М ЭДТА, 0,5% дезоксихолата Na и проназу, препарат трижды обрабатывают хлороформом,осаждают этанолом, инкубируют с РНК-азой вновь трижды обрабатывают хлороформом осаждают этанолом и переосаждают- изопропанолом lj . Недостатками такого способа являются шестикратная обработка хлороформом для удаления белка, что делает способ весьма трудоемким, продолжительность процедуры вьщеления (48- 72 ч), применение ферментов - проназы с целью разрушения дезоксирибонуклеопротеидного комплекса (ДНП) и РНК-азы для удаления РНК из целевого продукта, Наиболее близким к изобретению является способ выделения ДНК из тканей животных, включающий замораживание и измельчение тканей с последующим разрушением клеток в, раство ре, содержащем катионный детергент цетавлон (ЦТА-Вг), 5М мочевины, 0,Ш ЭДТА, 2М КаС1.Лизат трижды обрабатывают смесью хлороформа и из.оакилового спирта. Из водной фазы с помощью ЦТА-Вг осаждают ЦТА-соль ДНК промывают раствором, содержащим 0,1% ЦТА, 5М мочевину и 0,5М NaCl, затем раствором 1М ацетата йатрия в 70%-но спирте, 70%-ным спиртом и получают Na-соль ДНК, содержащую 10% примеси РНК ИИзвестньй способ имеет ряд недостатков, а именно: использование в ка честве катионного детергента цетавло на, импортируемого из ФРГ и потому труднодоступного для лабораторий, не обходимость проводить манипуляцию вы деления ДНК при температуре свьше 20 С из-за плохой растворимости цетавлона при более низких температурах, что влечет за собой потери ДНК в процессе вьщеления, связанные с де натурацией ее молекулы, высокая раст воримость катионного детергента цетавлона (ЦТА-Вг) в органическихраствор телях, вследствие чего его концентрация понижается и для ее поддержа12ния детергент приходится добавлять к исследуемому раствору. Целью изобретения является -noBbmieние выхода целевого продукта и снижение примеси рибонуклеиновой кислоты. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты,включающему лизис клеток в присутствии катионного детергента, мочевины,этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, в качестве катионного детергента используют этоний дихлорид,этилен-1,2-бис-(диметилкарбодецоксиметил)аммония, а процесс вьщеления о ДНК осуществляют при 3-8 . Способ осуществляют следующим образом. Извлеченную из организма ткань замораживают в жидком азоте и растирают до порошкообразной консистенции, отмывают при 0,01М фосфатным буфером, содержащим 0,14М NaCl, лизируют 20 мин при 37°С подогретым до 50°С раствором, содержащим 1% этония, 0,1М Эдта, 5М мочевины и 2М NaCl. К лизату добавляют равный объем хлороформа, интенсивно встряхивают 10 мин и центрифугируют 15 мин при 4000 g при 4-8 С, отсасывают водно-солевую фазу. Осаждают ДНК из водно-солевого раствора, понижая концентрацию NaCl до 0,5 М путем прибавления 5М раствора мочевины. Осадок отмывают и растворяют в соответствующем буферном растворе, а затем очищают от примесей РНК. Пример 1. Навеску ткани сердца от 5-5 крыс (около 4 г) измельчают, замораживают в жидком азоте, растирают в фарфоровой ступке и отмывают в 40 мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,14М NaCl. Полученную суспензию центрифугируют 10 мин при 4000g, осадок ресуспендируют в 7 мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,0 и добавляют к 38,5 мл подогретого до 50с раствора, содержащего 1% этония, 0,1М ЭДТА, 5М мочевину и 2М NaCl. Смесь энергично встряхивают и оставляют на 20 мин в термостате при 37 С. Затем к смеси добавляют равный объем хлороформа, энергично встряхивают 10 мин и центрифугируют 15 мин при 4 OOOg и температуре . Водную фазу отсасывают и вновь обрабатывают хлороформом до полного исчезновения слоя на. 31 -границе раздела органической и водной фаз. К водно-солевому раствору нуклеиновых: кислот добавляют 2,33 объема 5 М раствора мочевины. Полученный осадок отделяют, отмывают в растворе, содержащем 0,5 М NaCl, 5М мочевину и 0,1% этония, а затем трижды в О,1 М ацетате Na в 70 этаноле и наконец в 70 и 96 этаноле. Полученную этониевую соль ДНК растворяют в 18 мл 0,14м NaCl. Йосле полного растворения осадка добавляют 2 мл раствора, содержащего 2,5 М ацетата Na и 0,001 М ЭДТА,тщательно перемешивают. ДНК в виде Na-соли осаждают, добавляя к раствору 0,54 объема изопропанола. Образовавшийся осадок Na-соли ДНК извлекают стеклянной палочкой и вновь растворяют в 0,14м NaCl. К полученному однородному вязкому раствору добавля ют смоченный водой активированный уголь в количестве 15-20% от объема раствора и выдерживают в течение 1 ч при , постоянно помешивая. Уголь отделяют центрифугированием, а ДНК в виде Na-соли вновь осаждают изопро панолом.Полученную таким образом ДН промывают в 96° этаноле, в смеси эта нол - этиловый эфир 1:1, в эфире и высушивают сначала на воздухе, а затем при . Из 4 г ткани сердца крыс получают 4-6 мг очищенного препарата ДНК. Пример 2. В качестве исходного материала используют селезенки крыс. Способ выполняют аналогично приме ру 1, но ткани для исследования беру в количестве 2 г, а фосфатного буфеpa и лизирующего раствора 10 и 55 мл соответственно. В результате из 2 г ткани селе, зенки крыс получают 15-17 мл очищенного препарата ДНК. Опытным путем установлено, что при вьщелении ДНК по известному способу выход ДНК составляет 70-75% (20 исследований), по предлагаемому - до 85% (20 исследований). Таким образом, выделение ДНК по предлагаемому способу дозволяет получить положительный результат путем применения детергента этония, выпус каемого отечественной промьшленнос714тью, позволяющего проводить вьщелениё ДНК в оптимальном температурном режиме . Существенное преимущество предложенного способа заключается в применении в качестве детергента этония дихлоридэтилен 1,2-бис-(диметилкарбодецоксиметила) аммония химической формулы CH2N(CH)2COOC(,H,1.2C1 плохо растворимого в органических растворителях и хорошо растворимого в воде при низких температурах, ранее использовавшегося как антисептическое вещество. Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что процесс выделения выполняется при температуре , что препятствует денатурации молекулы ДНК и снижает потери ее в процессе выделения. Кроме того, в отличие от известных с особов, предлагаемый позволяет вьщелить ДНК из тканей с низким ее содержанием, что необходимо для изучения механизмов регуляции биологических процессов на уровне матрицы ДНК не только в активно пролиферирующих тканях (лимфоидные органы, печень), но и в тканях с относительно малым содержанием ДНК (сердце, эндотелий сосудов) . Сравнительная оценка результатов вьщеления ДНК различными способами представлена в таблице. Ниже приведены данные о свойствах и характеристиках препаратов ДНК, полученных предлагаемым методом из селезенки и сердца крыс. 17,77v10 Молекулярный вес млн. Дальтонов Гиперхромньш эффект, %30,,0 Содержание фосфора, %9,90t1,1 Щ-.-шесь РНК, % 0,,20 Примесь полисахаридов Нет Примесь деградированных продуктов ДНК,РНК Нет 2,4 Температура плав72,,1 ления, С

Известный способ

Выделить не удалось

3-9 4

70 Предлагаемый способ 1,5 2,3

85

1,5 2,3

85

1,95

1,93 1,93

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, включающий лизис клеток в присутствии катионно,го детергента, мочевины, этилендиаминтетраацетата натрия, хлористого натрия, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и снижения примеси рибонуклеиновой кислоты, в качестве катионного детергента используют этоний Гдихлоридэтилен- 1,2-биc-(димeтилiKapбoдeцoкcимeтил)aммoнияJ, а процесс выделения ДНК осуществляют при С.