СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИТИНАЗО-ПОДОБНОГО БЕЛКА YKL-40 В БИОПТАТАХ И ЭКСКРЕТАХ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской биохимии, а именно к способам количественного определения хитиназо-подобного белка человека YKL-40 (другое название - человеческий хрящевой гликопротеин-39 или HcGP-39), и может быть использовано в энзимологии, микробиологии, фармакологии, клинической биохимии для количественной оценки этого белка в различных биоптатах и экскретах человека.

Хитиназо-подобные белки представляют собой протеины, сходные по своей первичной структуре с хитиназами-ферментами, способными расщеплять полиаминосахарид хитин. Как и хитиназы, хитиназо-подобные белки имеют хитин-связывающий домен, но не обладают ферментативной активностью, то есть не расщепляют хитин, из-за аминокислотной замены в каталитическом центре. YKL-40 имеет домены, связывающие хитин и гепарин. Аналог хитиназо-подобного белка человека YKL-40 впервые был обнаружен в сыворотке нелактирующих коров [1]. Впоследствии была описана способность продуцировать YKL-40 хондроцитами, синовиальными клетками, активированными макрофагами, нейтрофилами, клетками остеосаркомы (MG-63) [2-5]. Несмотря на то, что значение YKL-40 для организма человека до настоящего времени остается неизвестной, изменение экспрессии гена этого протеина при различных патологических процессах позволяет предположить, что хитиназо-подобный белок играет определенную роль в перестройке тканей. В клинических исследованиях было показано, что YKL-40 может являться одним из маркеров деструктивной активности при ревматоидном артрите и остеоартрите, фиброзе печени, аденокарциноме легких и толстого кишечника, при Th2 опосредованном иммунном ответе [6-9].

Наиболее перспективным из современных способов определения YKL-40 является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Для определения концентрации YKL-40 разработан способ на основе иммуноферментного метода, который является наиболее близким прототипом к нашему изобретению [10]. Однако использование Fab-фрагментов моноклональных антител к YKL-40, требующих к тому же дополнительной трудоемкой технологии сорбции их в лунках стрипов, придает таким коммерческим тест-системам высокую стоимость.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего количественно определять хитиназо-подобный белок YKL-40 в различных биоптатах и экскретах человека на основе иммуноферментного метода, используя свойство хитиназо-подобных белков специфически связываться с хитином и гепарином.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета коллоидного хитина или гепарина, затем внесение в лунки микропланшета растворов, содержащих известное количество хитиназо-подобного белка, и анализируемой пробы, проведение инкубации (в ходе которой хитиназо-подобные белки посредством специфического домена связываются с коллоидным хитином или гепарином), выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против YKL-40 и субстрата этого фермента и проведение расчета количества протеина по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа количественного определения YKL-40 в различных биоптатах и экскретах человека, методом иммуноферментного анализа, отличающийся от прототипа отсутствием необходимости использования моноклональных Fab фрагментов антител к хитиназо-подобному белку.

Пример 1. Определение концентрации YKL-40. Готовят планшет для сорбции коллоидного хитина, подвергая его внутреннюю поверхность УФ-облучению в течение 2 минут (лампой мощностью от 20 до 100 Вт). Сразу после УФ-облучения вносят в лунки по 100 мкл раствора коллоидного хитина в концентрациях 10-100 мкг/мл. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при +4°C. Три раза отмывают планшет 0,15 M натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащих известное количество YKL-40, и анализируемую пробу (сыворотка, смыв со слизистых носовой полости, бронхоальвеолярная лаважная жидкость, слезная жидкость), содержащую неизвестное количество хитиназо-подобного белка. После инкубации в термостате в течение 1 ч при +37°C, двукратной отмывки 0,15 M натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против YKL-40 в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при +37°C, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл нитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Концентрацию YKL-40 рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение концентрации YKL-40 в образцах с известным содержанием хитиназо-подобного белка. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 2. Определение концентрации YKL-40 проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического агента, связывающего хитиназо-подобный белок, на планшет сорбируют гепарин в концентрациях 10-100 мкг/мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rejman J.J., Hurley W.L. Isolation and characterization of a novel 39 kilodalton whey protein from bovine mammary secretions collected during the non-lacting period. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1988. V.150. P.329-334.

2. Hakala B.E., White C., Recklies A.D. Human cartilage gp-39, a magor secretory product of articular chondrocytes and synovial cells, is a mammalian member of a chitinase protein family. J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.25803-25810.

3. Nyirkos P., Golds E.E. Human synovial cells secrete a 39 kDa protein similar to a bovine mammary protein expressed during the non-lactating period. Biochem. J. 1990. V.268. P.265-268.

4. Renkema G.H., Boot R.G., Au F.L. Chitotriosidase, a chitinase, and the 39-kDa human cartilage glycoprotein, a chitin-binding lectin, are homologues of family 18 glycosy hydrolases secreted by human macrophages. Eur. J. Biochem. 1998. V.251. P.504-509.

5. Volck В., Price P.A., Johansen J.S. YKL-40, a mammalian member of the chitinase family, is a matrix protein of specific granules in human neutrophils. Proc. Assoc. Am. Physicians. 1998. V.110. P.351-360.

6. Johansen J.S., Jensen H.S., Price P.A. A new biochemical marker for joint injury. Analysis of YKL-40 in serum and synovial fluid. Br. J. Rheumatol. 1993. V.32. P.949-955.

7. Johansen J.S., Moller S., Price P.A. Plasma YKL-40: a new potential marker of fibrosis in patients with alcoholic cirrosis? Scand. J. Gastroenterol. 1997. V.32. P.582-590.

8. Cintin C, Johansen J.S., Christensen I.J. Serum YKL-40 and colorectal cancer. Br. J. Cancer. 1999. V.79. P.1494-1499.

9. Chupp G.L., Lee C.G., Jarjour N. Chitinase-like protein in the lung and circulation of patients with severe asthma. 2007. V.357. P.2016-2027.

10. U.S. Patent №7230086

Таблица 1 Зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации YKL-40. Проба ОП_{492 нм} YKL-40, нг/мл Контроль, YKL-40, 0 нг/мл 0,060 0 Контроль, YKL-40,20 нг/мл 0,098 20 Контроль, YKL-40, 50 нг/мл 0,149 50 Контроль, YKL-40,100 нг/мл 0,243 100 Контроль, YKL-40,200 нг/мл 0,380 200 Контроль, YKL-40, 300 нг/мл 0,596 300 Сыворотка 1 0,500 258 Сыворотка 2 0,308 145 Сыворотка 3 0,131 41 Смыв из носа 1 0,116 32 Смыв из носа 2 0,186 73 Смыв из носа 3 0,297 139

Изобретение относится к области биохимии, а именно к иммунологической диагностике. Предложен способ количественного определения хитиназо-подобного белка человека YKL-40 (другое название - человеческий хрящевой гликопротеин-39 или HcGP-39). При осуществлении способа сорбируют в лунках микропланшета коллоидный хитин или гепарин, затем вносят в лунки микропланшета растворы, содержащие известное количество хитиназо-подобного белка, и анализируемые пробы. Расчет количества YKL-40 проводят по количеству продукта ферментативной реакции, образовавшегося при взаимодействии конъюгата фермента с антителами против YKL-40 с субстратом этого фермента. Способ позволяет определять YKL-40 в различных биоптатах и экскретах человека с хорошей воспроизводимостью результатов и высокой чувствительностью. 2 н.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ иммуноферментного определения концентрации YKL-40, характеризующийся тем, что в лунках планшета сорбируют коллоидный хитин или гепарин, затем в лунки вносят раствор анализируемой пробы (сыворотка, смыв со слизистых носовой полости, бронхо-альвеолярная лаважная жидкость, слезная жидкость), проводят инкубацию для осуществления специфического связывания хитиназо-подобного белка и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против YKL-40 и после инкубации и отмывки субстратный буфер, после чего проводят расчет концентрации YKL-40.

2. Набор для иммуноферментного определения концентрации YKL-40, характеризующийся тем, что он содержит планшет, растворы коллоидного хитина или гепарина, конъюгат фермента с антителами против YKL-40 и субстратный буфер.