ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИН-ПРОТЕИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИЦ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/573 G01N33/543 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам определения иммуноглобулин-протеиназной активности, и может быть использовано в энзимологии, микробиологии, фармакологии, клинической биохимии для скрининга и количественной оценки активности протеолитических ферментов.

Протеиназы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов играют существенную роль в патогенезе поражений. Большое внимание уделяется микробным протеолитическим ферментам, которые расщепляют молекулы иммуноглобулинов (IgG). Для выявления активности этих энзимов были разработаны различные методы: спектрофотометрические, нефелометрические, иммунопреципитирующие, иммунохимические в сочетании с гельфильтрацией в полиакриламидном геле [1-4]. Однако полуколичественная оценка протеолитической активности данными методами обладает невысокой чувствительностью, иногда не поддается стандартизации и поэтому трудно применима в практике. Наиболее перспективным из современных способов определения IgG-протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей высокой чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Наиболее близким к нашему изобретению является способ определения иммуноглобулин-протеиназной (IgG-протеиназной) активности с помощью иммуноферментного метода [5, 6]. В вышеприведенном подходе используется предварительная сорбция бактериальных антигенов (например, полученных из клебсиеллы) в лунках полистиролового планшета, с которыми впоследствии специфически взаимодействует добавляемый к ним IgG. Добавление к такой системе раствора, содержащего протеолитические ферменты, приводит к расщеплению IgG (отщеплению Fc-фрагмента), что легко фиксируется последующим добавлением в лунки конъюгата белка А стафилококка с пероксидазой. Преимуществом этого способа является его достаточно высокая чувствительность, однако использование в качестве сорбируемого на полистироловую поверхность планшета антигена, представляющего собой по сути комплекс бактериальных белков и гликопротеинов, обладает недостатком, а именно подверженностью самого антигена к ферментативному расщеплению протеолитическими энзимами, что может исказить реальную величину активности исследуемого фермента. Для устранения этого нежелательного эффекта была применена схема раздельного осуществления ферментативной реакции - в одной емкости (планшете) с последующим определением концентрации нерасщепленных антител в другой емкости (планшете), содержащей сорбированные антигены [5, 6]. Однако недостатками такого порядка оценки протеолитической активности являются: 1) использование двух планшетов - для проведения гидролиза, а затем переноса реакционной смеси во второй планшет тест-системы для определения IgG, 2) необходимость предварительного подбора разведения тестируемого фермента, чтобы попасть в диапазон концентраций, благоприятных для определения активности.

Вышеупомянутая проблема была устранена в изобретениях [7, 8], где в качестве субстрата использовался IgG, сорбированный непосредственно на полистироловую поверхность планшета без использования бактериального (белкового) антигена. Однако такой подход, несмотря на всю его простоту, обладает существенным недостатком - пониженной доступностью молекул IgG для ферментативного расщепления в силу того, что молекулы иммуноглобулинов благодаря гидрофобному взаимодействию сравнительно жестко зафиксированы на поверхности полистирола. Более того, благодаря большому размеру молекулы IgG сорбированный на полистироле иммуноглобулин может подвергаться многократному протеолитическому расщеплению без потери способности связывать впоследствии специфический конъюгат (белок A стафилококка с пероксидазой или специфический к Fc-фрагменту IgG с пероксидазой), что может привести к заниженной оценки протеолитической активности исследуемого фермента.

В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющего с высокой точностью и высокой чувствительностью определять протеолитическую активность с использованием иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения иммуноглобулин-протеиназной активности, который предусматривает предварительное сорбирование в лунках полистиролового планшета полимерных матриц небелковой природы (нуклеиновая кислота, хитин), добавление в лунки с полимерной матрицей специфических к этой матрице IgG, последующим добавлением в лунки раствора, содержащего протеолитические ферменты, последующей инкубацией, в течение которой происходит протеолитическое расщепление иммуноглобулиновых молекул (отщепление от них Fc-фрагментов), последующим внесением в лунки конъюгата фермента (пероксидазы) с белком A стафилококка, субстрата этого фермента, с последующим учетом результатов реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм и проведением расчета IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции. Использование в качестве сорбированного антигена полимерных матриц - полинуклеиновой кислоты, хитина - позволяет избежать каталитически эффективного взаимодействия с ними исследуемого протеолитического фермента, что не приводит к возможному искажению истинной величины активности изучаемого фермента. Кроме того, высокая степень полимеризации матриц, с которыми связываются молекулы IgG, позволяет эффективно нивелировать негативный эффект от наличии в среде с протеиназами также ферментов, способных расщеплять эти полимерные матрицы - нуклеаз (для нуклеиновых кислот), хитиназ (для хитина), поскольку эффективное расщепление высокополимерных соединений, сопровождающихся их полной десорбцией с поверхности полистирола, требует наличия очень высоких концентраций специфических энзимов (нуклеаз, хитиназ). Сравнительная схема способов определения IgG представлена на рисунке 1.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого способа определения IgG-протеиназной активности методом иммуноферментного анализа, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать белковые антигены, малым расходом субстрата, удобством за счет проведения реакции непосредственно в лунках микропланшета, осуществление реакции и детекции результатов реакции в одной и той же лунке.

Пример 1. Определение IgG-протеиназной активности трипсина. В лунки планшета предварительно сорбируют полимерную матрицу - двунитевую полидезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Для этого ДНК растворяют в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 из расчета 20 мкг/мл. Приготовленный раствор в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета, инкубируют в течение 24 ч при 4°C. После этого лунки планшета трижды промывают 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. Подготовленные таким образом планшеты можно хранить в течение года при 4°C в сухих условиях. Затем растворяем иммуноглобулин G, специфический к двунитевой ДНК, в 0,2 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, в концентрациях 0,1-1 мкг/мл и вносим по 50 мкл раствора в лунки планшета. Закрываем крышкой и оставляем на 1 ч при комнатной температуре. Три раза отмываем планшет 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносим по 100 мкл 0,02 М натрий-фосфатного буферного раствора с рН 7,4. В одну из лунок планшета вносим 100 мкл раствора трипсина в том же буфере в концентрации 1 мкг/мл. Далее производим двукратные разведения трипсина, используя несколько следующих лунок. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трех отмывок 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносим по 100 мкл конъюгата пероксидазы с белком A золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносим по 100 мкл субстратного раствора (0,038%-ный раствор о-фенилендиамина в 0,1 М натрий-цитратном буфере, рН 6,0, содержащий 0,06% перекиси водорода). После 30 минутной инкубации в темноте при комнатной температуре реакцию останавливаем внесением в каждую лунку 50 мкл 25% серной кислоты. Результаты реакции учитываем с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Полученные результаты приведены в таблице 1. Количество расщепленного IgG определяем по разнице между количеством иммуноглобулина в контроле и опыте, используя стандартную калибровочную кривую. IgG-протеиназную активность рассчитываем по формуле:

A=(C_k-C₀)/tC_f;

где:

А - активность фермента (в усл. единицах) активности,

С_k - концентрация иммуноглобулина в контроле,

С₀ - концентрация иммуноглобулина в лунках, куда вносили раствор фермента,

Т - время протеолиза,

C_f - концентрация фермента в анализируемом растворе.

Пример 2. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем культуральную жидкость культуры бактерий. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество белка в культуральной жидкости.

Пример 3. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем дезинтеграт бактериальных клеток. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество белка в дезинтеграте.

Пример 4. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем суспензию бактериальных клеток. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество клеток в объеме жидкости.

Пример 5. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо конъюгата фермента с белком A золотистого стафилококка используем конъюгат фермента с белком G стрептококка (Streptococcus).

Пример 6. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо конъюгата фермента с белком A золотистого стафилококка используем конъюгат фермента с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина G.

Пример 7. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем однонитевую ДНК и иммуноглобулины, специфические к однонитевой ДНК.

Пример 8. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем полирибонуклеиновую кислоту (РНК) и иммуноглобулины, специфические к РНК.

Пример 9. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем хитин (поли-N-ацетилглюкозамин) и иммуноглобулины, специфические к хитину.

Пример 10. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем хитозан (полиглюкозамин) и иммуноглобулины, специфические к хитозану.

Пример 11. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем ламинарии (поли-β-1-3-глюкан) и иммуноглобулины, специфические к ламинарину.

Пример 12. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо двунитевой ДНК в качестве полимерной матрицы используем глюкан (поли-β-1-4-глюкан) и иммуноглобулины, специфические к глюкану.

ЛИТЕРАТУРА

1. Aubaid А.Н., Muhsin Т.М. Partial purification and kinetic studies of exocellular proteinase from Trichophyton mentagrophytes var. erinacei. Mycoses. 1998. V.41.№3-4. P.163-168.

2. Brinkworth R.I., Brindley P.J., Harrop S.A. Structural analysis of the catalytic site of AcCP-1, a cysteine proteinase secreted by the hookworm Ancylostoma caninum. Biochim Biophys Acta. 1996. V.1298. №1. P.4-8.

3. Reinholdt J., Kilian M. A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for IgA protease activity. J. Immunol. Methods. 1983.V.63. №3. P.367-376.

4. Molla A., Yamamoto Т., Maeda H. Characterization of 73 kDa thiol protease from Serratia marcescens and its effect on plasma proteins. J. Biochem. 1988. V.104. №4. P.616-621.

5. Зинкевич О.Д., Бондаренко B.M., Тюрин Ю.А., Сафина Н.А., Анохин В.А. Клинико-диагностическое значение оценки активности IgG-протеаз у детей с дисбактериозом кишечника. // Журн. микробиол. 2004. №3. С. 73-77.

6. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей. // Автореф. дисс.канд. мед. наук -Казань, 2003. - 21 с.

7. Козлов Л.В., Мишин А.А., Шемаев В.Б., Дьяков В.Л. / Способ и набор для иммуноферментного определения активности протеиназ. // Патент RU №2312352.

8. Тюрин Ю.А., Куликов С.Н., Фассахов Р.С., Долбин Д.А., Баязитова Л.Т. / Способ определения IgG-протеиназной активности. // Патент RU №2373538.

Таблица 1 Зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации трипсина Трипсин, нг/мл ОП, 492 нм 976 0,082 488 0,199 244 0,319 122 0,425 61 0,555 30 0,783 15 0,900 7 1,050 0 1,515

Рисунок 1. Сравнительная схема способов определения IgG-протеиназной активности.

А - по способу, описанному в работе [5, 6],

Б - по способу, описанному в работах [7, 8],

В - по заявляемому способу.

Изобретение относится к области биохимии и предназначено для определения IgG-протеиназной активности. В лунках полистиролового планшета сорбируют полимерные матрицы небелковой природы - ДНК, хитин, затем в лунки добавляют специфические к этой матрице IgG и раствор, содержащий протеолитические ферменты. После инкубации, в ходе которой происходит протеолитическое расщепление иммуноглобулиновых молекул, в лунки вносят конъюгат фермента пероксидазы с белком A стафилококка и субстрат этого фермента. Далее производят учет результатов реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм и проведение расчета IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции. Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать белковые антигены, малым расходом субстрата, при котором саму реакцию и ее детекцию осуществляют в одной и той же лунке микропланшета. 1 ил., 1 табл., 12 пр.

Способ определения иммуноглобулин-протеиназной (IgG-протеиназной) активности, отличающийся тем, что при его проведении предварительно сорбируют в лунках полистиролового планшета полимерные матрицы небелковой природы (ДНК, хитин), добавляют в лунки с полимерной матрицей специфические к этой матрице IgG, затем добавляют в лунки раствор, содержащий протеолитические ферменты, после инкубации, в ходе которой происходит протеолитическое расщепление иммуноглобулиновых молекул (отщепление от них Fc-фрагментов), вносят в лунки конъюгат фермента (пероксидазы) с белком A стафилококка, субстрат этого фермента с последующим учетом результатов реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм и проведением расчета IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции.