СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1,1'-ЭТИЛЕН-2,2'-ДИПИРИДИЛИЙДИБРОМИДА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической химии, а именно к способам определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ основного характера, к которым относится 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромид, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, неоднократно настаивают с подкисленным этанолом (каждый раз в течение суток), отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение концентрируют, осаждают в нем белки и некоторые другие эндогенные вещества биоматериала абсолютным этанолом, выпавший осадок отфильтровывают, процесс концентрирования объединенного извлечения, осаждения в нем эндогенных веществ биоматериала и отделения осадка фильтрованием неоднократно повторяют до прекращения появления осадка, фильтрат сгущают до густоты сиропа, разбавляют водой и экстрагируют анализируемые соединения вначале из кислого, а затем из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123). Способ трудоемок, длителен по выполнению, характеризуется низкой степенью извлечения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида.

Известен способ определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в биологическом материале (семенах подсолнечника), заключающийся в том, что к анализируемой пробе прибавляют порцию 1 н. раствора серной кислоты, масса которой в 5 раз превышает массу биологической пробы, кипятят образующуюся смесь с обратным холодильником в течение 3 часов, охлаждают, фильтруют через воронку Бюхнера, остаток на фильтре промывают трехкратно порциями воды, отдельные фильтраты объединяют, доводят до определенного объема водой, часть полученного раствора вначале обрабатывают 10 н. раствором гидроксида натрия, доводя pH среды до 8-9, а затем - 5% раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводя pH среды до 6-7, полученный раствор пропускают через колонку, заполненную катионитом КУ-2, находящимся в Н-форме, колонку промывают 2 н. раствором азотной кислоты, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге, элюируют анализируемое вещество 4 н. раствором хлороводородной кислоты, элюат собирают, упаривают до получения сухого остатка в условиях нагревания при 200°С в токе воздуха, остаток растворяют в 2 мл этанола, наносят на хроматографическую пластину «Силуфол» UV-254, хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы этанол, хроматограмму высушивают и хроматографируют, используя подвижную фазу муравьиная кислота - вода (10:1), пластину высушивают, обрабатывают вначале 3% раствором бромтимолового синего в 50% этаноле, фиксируют появление пятна синего цвета на хроматограмме и определяют количество анализируемого вещества по площади окрашенного пятна (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т.2 / М.А.Клисенко, А.А.Калинина, К.Ф.Новикова, Г.А.Хохолькова. - М.: Колос, 1992. - С.24-26). Способ отличается недостаточно высокой точностью, длительностью и трудоемкостью процесса определения.

Наиболее близким является способ определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в биологическом материале (молоке) путем неоднократной обработки биологической пробы изолирующим агентом кислотного характера (раствором трихлоруксусной кислоты), отделения полученных извлечений центрифугированием, фильтрования центрифугатов через бумажный фильтр, промывания фильтра раствором трихлоруксусной кислоты, объединения отдельных фильтратов и порций промывной жидкости, пропускания через колонку с катионитом КУ-2, находящимся в натриевой форме, промывания колонки 2,5%-ым водным раствором хлорида аммония, сбора части элюата, содержащей анализируемое вещество, прибавления к ней восстанавливающего реагента (раствора смеси гидросульфита и метабисульфита натрия) в разбавленном растворе гидроксида натрия с последующим измерением оптической плотности образующегося окрашенного раствора (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т.2 / М.А.Клисенко, А.А.Калинина, К.Ф.Новикова, Г.А.Хохолькова. - М.: Колос, 1992. - С.28-30). Способ отличается недостаточно высокой точностью определения.

Задачей настоящего изобретения является повышение точности определения.

Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую пробу двукратно обрабатывают изолирующим агентом кислотного характера (смесью растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) в условиях нагревания до кипения, кипячения в течение 10-15 минут и выдерживания в течение 35 минут без нагревания, полученные извлечения отделяют от твердого остатка, объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, хроматографируют в колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, используя подвижную фазу ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают при 200°С в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в воде, обрабатывают вначале смесью растворов гидрокарбоната натрия и восстанавливающего реагента (глюкозы) в условиях нагревания при 100°С в течение 10 минут, затем диметилформамидом в условиях нагревания при 100°С в течение 5 минут с последующим охлаждением образующегося окрашенного раствора и измерением его оптической плотности при 440 нм.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромид, двукратно обрабатывают изолирующим агентом кислотного характера (смесью растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) в условиях нагревания до кипения, кипячения в течение 10-15 минут и выдерживания в течение 35 минут без нагревания, полученные извлечения отделяют от твердого остатка, объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, хроматографируют в колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, используя подвижную фазу ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают при 200°С в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в воде, обрабатывают вначале смесью растворов гидрокарбоната натрия и восстанавливающего реагента (глюкозы) в условиях нагревания при 100°С в течение 10 минут, затем диметилформамидом в условиях нагревания при 100°С в течение 5 минут с последующим охлаждением образующегося окрашенного раствора и измерением его оптической плотности при 440 нм. Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в крови

К 10 г крови прибавляют 5 мг 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г изолирующего агента кислотного характера (смеси растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) и нагревают образующуюся смесь с обратным холодильником до состояния кипения, кипятят 10-15 минут, после чего прекращают нагревание и выдерживают колбу с содержимым в течение 35 минут при комнатной температуре. Жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биоматериала, а процесс изолирования повторяют по вышеописанной схеме. Полученные извлечения объединяют, объединенное извлечение фильтруют через бумажный фильтр, фильтр промывают 10 мл смеси этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты, а фильтрат и промывную жидкость объединяют. Объединенный фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка. Остаток растворяют в 2 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, предварительно промытого последовательно 20 мл ацетонитрила и 12 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. После полного вхождения раствора сухого остатка в слой сорбента осуществляют хроматографирование с использованием подвижной фазы ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. Высоту столба подвижной фазы над поверхностью сорбента поддерживают на уровне 26-28 см. Элюат собирают фракциями по 1 мл каждая. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество (с пятой по седьмую включительно), объединяют в выпарительной чашке и упаривают до сухого остатка в условиях нагревания при 200°С.

Остаток растворяют в 2 мл воды, к раствору добавляют 1,0 мл 10% раствора гидрокарбоната натрия, 2 мл восстанавливающего реагента (5% раствора глюкозы), полученную реакционную смесь переносят в пробирку, градуированную на 10 мл, и нагревают в течение 10 минут на водяной бане при 100°С. Затем к реакционному раствору прибавляют 5,0 мл диметилформамида и повторяют нагревание на водяной бане при 100°С. Образующийся окрашенный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят его объем водой до 10 мл, перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2 в кювете с толщиной рабочего слоя 20 мл при длине волны 440 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количественное содержание 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, используя предварительно рассчитанное уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический объект.

Построение градуировочного графика

В ряд пробирок, градуированных на 10 мл, вносят 0,01, 0,02, 0,04, 0,10, 0,20, 0,40, 1,00 мл 0,025% раствора 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в воде, соответственно 1,99, 1,98, 1,96, 1,90, 1,80, 1,00 мл воды, по 1 мл 10% раствора гидрокарбоната натрия, по 2 мл восстанавливающего реагента (5% раствора глюкозы) и нагревают полученные смеси при 100°С на кипящей водяной бане в течение 10 минут.

По истечении указанного времени реакционные смеси вынимают из горячей воды, к каждой из них прибавляют по 5 мл диметилформамида и нагревают полученные растворы при 100°С на кипящей водяной бане в течение 5 минут. По истечении указанного времени нагревание прекращают, пробирки с растворами охлаждают до комнатной температуры, доводят объем содержимого каждой пробирки до 10 мл водой, перемешивают и измеряют оптическую плотность образующихся окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре КФК-2 при 440 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 20 мм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте.

По результатам измерения оптической плотности серии растворов с известными концентрациями 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида строят график зависимости оптической плотности от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,5-50,0 мкг/мл. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

А=0,01647·С+0,04988,

где А - оптическая плотность; С - концентрация анализируемого вещества (мкг в 1 мл фотометрируемого раствора).

Результаты количественного определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 5 мг 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, тщательно перемешивают биологический материал с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г изолирующего агента кислотного характера (смеси растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему) и нагревают образующуюся смесь с обратным холодильником до состояния кипения, кипятят 10-15 минут, после чего прекращают нагревание и выдерживают колбу с содержимым в течение 35 минут при комнатной температуре. Жидкое извлечение отделяют от твердых частиц биоматериала, а процесс изолирования повторяют по вышеописанной схеме. Полученные извлечения объединяют, объединенное извлечение фильтруют через бумажный фильтр, фильтр промывают 10 мл смеси этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты, а фильтрат и промывную жидкость объединяют. Объединенный фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка. Остаток растворяют в 2 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 7,5 г сорбента «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм, предварительно промытого последовательно 20 мл ацетонитрила и 12 мл системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему. После полного вхождения раствора сухого остатка в слой сорбента осуществляют хроматографирование с использованием подвижной фазы ацетонитрил - 1 н. серной кислоты 2:8 по объему. Высоту столба подвижной фазы над поверхностью сорбента поддерживают на уровне 26-28 см. Элюат собирают фракциями по 1 мл каждая. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество (с пятой по седьмую включительно), объединяют в выпарительной чашке и упаривают до сухого остатка в условиях нагревания при 200°С.

Остаток растворяют в 2 мл воды, к раствору добавляют 1,0 мл 10% раствора гидрокарбоната натрия, 2 мл восстанавливающего реагента (5% раствора глюкозы), полученную реакционную смесь переносят в пробирку, градуированную на 10 мл, и нагревают в течение 10 минут на водяной бане при 100°С. Затем к реакционному раствору прибавляют 5,0 мл диметилформамида и повторяют нагревание на водяной бане при 100°С. Образующийся окрашенный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят его объем водой до 10 мл, перемешивают и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2 в кювете с толщиной рабочего слоя 20 мл при длине волны 440 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По величине оптической плотности определяют количественное содержание 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, используя предварительно рассчитанное уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический объект.

Схема построения градуировочного графика для определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида и уравнение этого графика представлены выше в примере 1.

Результаты количественного определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в ткани печени представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 2,5 раза повышает точность определения (полуширина доверительного интервала уменьшается при определении в крови с 8,72% до 3,48%, при определении в ткани печени - с 10,21% до 3,94%).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.

Таблица 1 Результаты определения 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида в крови № Внесено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, мг в 10 г крови Найдено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида Метрологические характеристики, % мг % 1. 0,00555 0,00496 89,37 х=88,01 2. 0,00605 0,00554 91,57 S=2,79 3. 0,00445 0,00385 86,52 S_x=1,25 4. 0,00525 0,00442 84,19 Δх=3,48 5. 0,00570 0,00504 88,42 ε=3,95

Таблица 2 Результаты определения 1,1'-этилен-2,2'- дипиридилийдибромида в ткани печени № Внесено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида, мг в 10 г мочи Найдено 1,1'-этилен-2,2'-дипиридилийдибромида Метрологические характеристики, % мг % 1. 0,00470 0,00405 86,17 х=86,21 2. 0,00535 0,00441 82,13 S=3,17 3. 0,00620 0,00524 84,32 S_x=1,42 4. 0,00495 0,00445 90,20 Δх=3,94 5. 0,00560 0,00493 88,24 ε=4,58

Таблица 3 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов Показатель Предлагаемый способ Известный способ 1. Полуширина доверительного интервала (характеристика точности)     а) при определении в крови 3,48% 8,72% б) при определении в ткани печени 3,94% 10,21% 2. Продолжительность хранения     восстанавливающего реагента Не менее 4 дней 1 час 3. Время, в течение которого сохраняется стабильность     оптической плотности фотометрируемых растворов Не менее 2 часов 3-5 минут

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораторий. Биологический материал двукратно обрабатывают смесью растворителей этанол - 1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2 по объему) в условиях нагревания до кипения, кипячения в течение 10-15 минут и выдерживания в течение 35 минут без нагревания, полученные извлечения отделяют от твердого остатка, объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтрат упаривают при 85-95°С до сухого остатка, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, хроматографируют в колонке, заполненной сорбентом «Силасорб С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, упаривают при 200°С в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в воде, обрабатывают вначале смесью растворов гидрокарбоната натрия и глюкозы в условиях нагревания при 100°С, затем диметилформамидом в условиях нагревания при 100°С в течение 5 минут с последующим охлаждением образующегося окрашенного раствора и измерением его оптической плотности при 440 нм. Достигается повышение точности анализа. 3 табл.

Способ определения 1,1′-этилен-2,2′-дипиридилийдибромида в биологическом материале, заключающийся в том, что биологическую пробу обрабатывают изолирующим агентом кислотного характера, полученное извлечение отделяют от частиц биоматриала, подвергают хроматографической очистке в колонке с неподвижной фазой, порции элюата, выходящие из колонки и содержащие анализируемое вещество, собирают, элюент испаряют, остаток обрабатывают восстанавливающим реагентом в щелочной среде с последующим измерением оптической плотности образующегося окрашенного раствора, отличающийся тем, что в качестве изолирующего агента кислотного характера используют смесь этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты 8:2 по объему, обработку изолирующим агентом ведут в условиях нагревания до кипения, последующего кипячения и выдерживания без нагревания, хроматографическую очистку осуществляют в колонке, заполненной неподвижной фазой «Силасорб С-18», используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты 2:8 по объему, в качестве восстанавливающего реагента применяют раствор глюкозы, щелочную реакцию создают гидрокарбонатом натрия, обработку восстанавливающим реагентом в щелочной среде ведут в условиях нагревания при 100°С, а перед измерением оптической плотности реакционный раствор обрабатывают диметилформамидом в условиях нагревания при 100°С.