СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ IgA-ПРОТЕИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 G01N33/573 G01N33/543 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам определения IgA-протеиназной активности, и может быть использовано в энзимологии, микробиологии, фармакологии, клинической биохимии для скрининга и количественной оценки активности протеолитических ферментов.

Протеиназы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов играют существенную роль в патогенезе поражений. Большое внимание уделяется микробным протеолитическим ферментам, которые расщепляют молекулы иммуноглобулинов. Для выявления активности этих энзимов были разработаны соответствующие методы [1, 2, 3]. Однако полуколичественная оценка протеолитической активности данными методами не поддается стандартизации и поэтому трудно применима в практике. Наиболее перспективным из современных способов определения IgA-протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако метод иммуноферментного анализа IgA-протеазной активности, наиболее близкий к нашему изобретению [4], требует изготовления и сорбции на микропланшете бактериальных антигенов, применения специфических к используемому бактериальному антигену иммуноглобулинов или, в противном случае, высокого расхода пула неспецифических иммуноглобулинов, проведения ферментативной реакции в отдельной емкости.

Целью заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего количественно определять уровень IgA-протеазной активности методом иммуноферментного анализа без использования бактериальных антигенов с проведением ферментативной реакции непосредственно в лунках микропланшета.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина-А, затем внесение в лунки микропланшета раствора, содержащего протеолитические ферменты, проведение инкубации, в результате чего происходит расщепление иммуноглобулиновых молекул и их десорбция, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина-А, субстрата этого фермента и проведение расчета IgA-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения уровня IgA-протеиназной активности, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, малым расходом субстрата и возможностью использования иммуноглобулинов вне зависимости от их специфичности.

Пример 1. Определение IgA-протеиназной активности трипсина. Растворяют IgA человеческий в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, в концентрациях 0,1-1 мкг/мл и вносят по 50 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают планшет 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл 0,05 М трис-НСl буферного раствора с рН 8,0. В одну из лунок планшета вносят 100 мкл раствора трипсина в том же буфере в концентрации 1 мкг/мл. Далее производят двукратные разведения трипсина, используя несколько следующих лунок. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трех отмывок 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина-А в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора (5 мг ОФД в 0,1 М натрий-цитратном буфере, рН 9,0, и 8 мкл перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 25% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Полученные результаты приведены в таблице 1. IgA-протеиназную активность рассчитывают по стандартной кривой (см. чертеж), используя формулу

A=(C_k-C_o)/tC_f,

где А - активность фермента (в усл. единицах) активности,

C_k - концентрация иммуноглобулина в контроле,

С_о - концентрация иммуноглобулина в лунках, куда вносили раствор фермента,

Т - время протеолиза,

C_f - концентрация фермента в анализируемом растворе.

Пример 2. Определение IgA-протеиназной активности проводят аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используют культуральную жидкость культуры бактерий. IgA-протеиназную активность рассчитывают на количество белка в культуральной жидкости.

Пример 3. Определение IgA-протеиназной активности проводят аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используют дезинтеграт бактериальных клеток. IgA-протеиназную активность рассчитывают на количество белка в дезинтеграте.

Пример 4. Определение IgA-протеиназной активности проводят аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используют суспензию клеток бактерий. IgA-протеиназную активность рассчитывают на количество клеток в жидкости.

Таблица 1 Зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации трипсина. Трипсин, нг/мл ОП, 492 нм 976 0,075 488 0,240 244 0,318 122 0,423 61 0,512 30 0,713 15 0,815 7 0,900 0 1,100

ЛИТЕРАТУРА

1. Bleeg H.S., Reinholdt J., Kilian M. Bacterial immunoglobulin A proteases monitored by continuous spectrophotometry //FEBS Lett. - 1985. - Vol.188. - No 2. - P.357-362.

2. Qiu J., Brackee G.P., Plaut A.G. Analysis of the specificity of bacterial immunoglobulin A (IgA) proteases by a comparative study of ape serum IgAs as substrates //Infect Immun. - 1996. - Vol.64. - No 3. - P.933-937.

3. Wiesner R., Troll W. A new assay for proteases using fluorescent labeling of proteins //Ibid. - 1982. - Vol.121. - No 2. - P. 290-294.

4. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей. //Автореф. дис. канд. мед. наук. - Казань, 2003, с.21.

Сущность изобретения состоит в том, что иммуноглобулин-А сорбируют в лунках микропланшета, затем после инкубирования и обработки в лунки микропланшета вносят раствор, содержащий протеолитический фермент. Далее проводят инкубацию, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента, например пероксидазы, с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина-А и субстрат этого фермента. После инкубации реакционной смеси учитывают результаты реакции с помощью спектрофотометра. IgA-протеазную активность рассчитывают по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции. Использование изобретения позволяет упростить определение уровня IgA-протеазной активности, способ обладает хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, малым расходом субстрата и отсутствием необходимости использования иммуноглобулинов с определенной специфичностью. 1 ил., 1 табл.

Способ определения IgA-протеиназной активности, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропланшета иммуноглобулин-А, затем в лунки микропланшета вносят раствор, содержащий протеолитический фермент, проводят инкубацию, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина-А и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет IgA-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции.