СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ IgG-ПРОТЕИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/53 G01N33/573 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам определения IgG-протеиназной активности, и может быть использовано в энзимологии, микробиологии, фармакологии, клинической биохимии для скрининга и количественной оценки активности протеолитических ферментов.

Протеиназы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов играют существенную роль в патогенезе поражений. Большое внимание уделяется микробным протеолитическим ферментам, которые расщепляют молекулы иммуноглобулинов. Для выявления активности этих энзимов были разработаны различные методы: спектрофотометрические, нефелометрические, иммунопреципитирующие, иммунохимические в сочетании с гельфильтрацией в полиакриламидном геле (Reinholdt J., et al 1983, Molla A., et al 1988, Brinkworth R.I., et al 1996, Aubaid A.H., et al 1998). Однако, полуколичественная оценка протеолитической активности данными методами не поддается стандартизации и поэтому трудно применима в практике. Наиболее перспективным из современных способов определения IgG-протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Наиболее близким к нашему изобретению является способ определения IgG-протеиназной активности с помощью иммуноферментного метода (Тюрин Ю.А., 2003). Существенными недостатками этого метода являются: необходимость изготовления и сорбции на микропланшете бактериальных антигенов, применения специфических к используемому бактериальному антигену иммуноглобулинов, проведения ферментативной реакции в отдельной емкости.

Целью нашего изобретения является разработка способа определения IgG-протеазной активности методом иммуноферментного анализа.

Способ осуществляется следующим образом: сорбируем в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем вносим в лунки микропланшета раствор, содержащий протеолитические ферменты, проводим инкубацию, в результате чего происходит расщепление иммуноглобулиновых молекул и их десорбция, затем удаляем содержимое лунок, после чего вносим конъюгат фермента с белком А стафилококка, субстрат этого фермента с последующим учетом результатов реакции с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм и проведением расчета IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа определения IgG-протеиназной активности методом иммуноферментного анализа, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать антигены бактерий, малым расходом субстрата, возможностью использования иммуноглобулинов вне зависимости от их специфичности, удобством за счет проведения реакции непосредственно в лунках микропланшета.

Пример 1. Определение IgG-протеиназной активности трипсина. Растворяем иммуноглобулин G в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, в концентрациях 0,1-1 мкг/мл и вносим по 50 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрываем крышкой и оставляем на ночь при 4°С. Три раза отмываем планшет 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносим по 100 мкл 0,05 М трис-HCl буферного раствора с рН 8,0. В одну из лунок планшета вносим 100 мкл раствора трипсина в том же буфере в концентрации 1 мкг/мл. Далее производим двукратные разведения трипсина, используя несколько следующих лунок. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трех отмывок 0,15 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносим по 100 мкл конъюгата пероксидазы с белком А золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносим по 100 мкл субстратного раствора (0,038%-ный раствор о-фенилендиамина в 0,1 М натрий-цитратном буфере рН 6,0, содержащий 0,06% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте при комнатной температуре реакцию останавливаем внесением в каждую лунку 50 мкл 25% серной кислоты. Результаты реакции учитываем с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Полученные результаты приведены в таблице 1. Количество расщепленного IgG определяем по разнице между количеством иммуноглобулина в контроле и опыте, используя стандартную калибровочную кривую. IgG-протеиназную активность рассчитываем по формуле:

A=(C_k-C_o)/tC_f;

где:

А - активность фермента (в усл. единицах) активности,

C_k - концентрация иммуноглобулина в контроле,

С_о - концентрация иммуноглобулина в лунках, куда вносили раствор фермента,

t - время протеолиза,

C_f - концентрация фермента в анализируемом растворе.

Пример 2. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем культуральную жидкость культуры бактерий. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество белка в культуральной жидкости.

Пример 3. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем дезинтеграт бактериальных клеток. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество белка в дезинтеграте.

Пример 4. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо раствора фермента используем суспензию бактериальных клеток. IgG-протеиназную активность рассчитываем на количество клеток в объеме жидкости.

Пример 5. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо конъюгата фермента с белком А золотистого стафилококка используем конъюгат фермента с белком G стрептококка (Streptococcus).

Пример 6. Определение IgG-протеиназной активности проводим аналогично примеру 1, но вместо конъюгата фермента с белком А золотистого стафилококка используем конъюгат фермента с антителами против Fc-фрагмента иммуноглобулина G.

Таблица 1 Зависимости оптической плотности (ОП) от концентрации трипсина. Трипсин, нг/мл ОП, 492 нм 976 0,075 488 0,190 244 0,300 122 0,395 61 0,512 30 0,713 15 0,815 7 0,913 0 1,400

ЛИТЕРАТУРА

1. Aubaid A.H., Muhsin T.M. Partial purification and kinetic studies of exocellular proteinase from Trichophyton mentagrophytes var. erinacei. Mycoses. 1998. V.41. №3-4. P.163-168.

2. Brinkworth R.I., Brindley P.J., Harrop S.A. Structural analysis of the catalytic site of AcCP-1, a cysteine proteinase secreted by the hookworm Ancylostoma caninum. Biochim Biophys Acta. 1996. V.1298. №1. P.4-8.

3. Reinholdt J., Kilian M.A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for IgA protease activity. J. Immunol. Methods. 1983. V.63. №3. P.367-376.

4. Molla A., Yamamoto Т., Maeda H. Characterization of 73 kDa thiol protease from Serratia marcescens and its effect on plasma proteins. J. Biochem. 1988. V.104. №4. P.616-621.

5. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей. // Автореф. дисс. канд. мед. наук - Казань, 2003. - 21 с.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в энзимологии, микробиологии, фармакологии, клинической биохимии для скрининга и количественной оценки активности протеолитических ферментов. Способ осуществляют следующим образом: сорбируют в лунках микропланшета иммуноглобулин G (IgG), затем вносят в лунки микропланшета раствор, содержащий протеолитические ферменты, проводят инкубацию, в результате чего происходит расщепление иммуноглобулиновых молекул и их десорбция, затем удаляют содержимое лунок, вносят конъюгат фермента с белком А стафилококка, субстрат этого фермента, повторно инкубируют. Результат реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерения светопоглощения при 492 нм и проводят расчет IgG-протеиназной активности по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции. Способ прост в исполнении, обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов, обладает высокой чувствительностью, отсутствием необходимости использовать антигены бактерий, малым расходом субстрата, возможностью использования иммуноглобулинов вне зависимости от их специфичности. 1 табл.

Способ определения IgG-протеиназной активности, предусматривающий сорбцию IgG в лунках микропланшета, внесение раствора, содержащего протеолитический фермент, инкубацию, удаление содержимого лунок, внесение конъюгата фермента с белком с последующим повторным инкубированием, отмывкой и учетом результатов реакции, отличающийся тем, что вносят конъюгат фермента с белком А стафилококка и субстрат этого фермента, а учет результатов реакции осуществляют путем измерения светопоглощения при 492 нм с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом и рассчитывают протеиназную активность по количеству гидролизованного субстрата ферментативной реакции.