СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПИЙНЫХ АЛКАЛОИДОВ Российский патент 2011 года по МПК C07D489/02 B01D11/00 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к методам определения опийных алкалоидов, которые могут найти применение при оценке соответствия мака пищевого требованиям ГОСТ Р 52533-2006 «Мак пищевой» и в судебной экспертизе для определения количественного содержания наркотических компонентов.

Известен способ определения тебаина и орипавина в семенах мака, включающий пробоподготовку и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пробоподготовка при проведении анализа заключалась в том, что экстракция алкалоидов проводилась буферным раствором с pH 4.5, содержащим 0.2 М фосфат аммония, 20%-ный этанол, после чего проводилось отделение маточного раствора от твердого остатка центрифугированием. Анализ проводился методом ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором при аналитической длине волны 254 нм. Подвижная фаза при этом включает в себя 30% метанол и буфер с pH 4.5. Данный способ не позволяет определять содержание морфина и кодеина, являющихся основными компонентами опия.

Вышеописанная методика ВЭЖХ пригодна только для определения тебаина и орипавина и не обеспечивает полноту извлечения других опийных алкалоидов. Следует также отметить, что данная методика не позволяет определять микроколичества анализируемых веществ, поскольку их наиболее интенсивные максимумы поглощения лежат в коротковолновой области спектра (патент №6723894 US, A01B 79/00. Production of thebaine and oripavine. April 20, 2004, Appl. №047206, January 15, 2002, Tasmanian Alkaloids PTY. Ltd. (Westbury, AU), Fist; Anthony John (Norwood, AU); Byrne; Christopher James (Westbury, AU); Gerlach; Wayne Lyie (Killara, AU)).

Известен способ экстракции опийных алкалоидов из опия, включающий пробоподготовку, включающую их экстракцию различными кислотами при различных температурных режимах, и анализ полученного экстракта методом ВЭЖХ. В процессе анализа образующегося экстракта возможно определение практически всех опийных алкалоидов. Данный способ при всех его достоинствах трудоемкий и материалоемкий, требует жесткого контроля условий и не является экспрессным. Кроме того, данный способ не позволяет извлекать опийные алкалоиды из семян мака (WO 2005/123743, October 16, 2006, C07D 489/02 (2006.01.01), PCT/US 2005/016512, December 29, 2005, Tomazi; Keith G. (Florissant, МО), Mallinckrodt Inc (Hazelwood, МО)).

Известен экстракционный способ определения опийных алкалоидов в наркотических средствах, получаемых из мака (Сорокин В.И., Савенко ВТ., Семкин Е.П. Определение вида наркотических средств, получаемых из конопли и мака: Методические рекомендации / Ред. д-ра мед. наук, проф. Э.А.Бабаяна. - М.: ЭКЦ МВД России, РФЦСЭ МЮ России, 1995). В качестве экстрагентов рекомендуется использовать хлороформ или смесь хлороформ-этанол-25% водный раствор аммиака в соотношении 1:2:0,1 соответственно либо слабоподкисленную воду. При этом необходимо строго соблюдать соотношение образец (г) - экстрагент (мл) - 1:10. Определение проводится методами тонкослойной и газовой хроматографии.

При анализе методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на хроматографическую пластину наносят стандартные образцы, представляющие собой растворы наркотически активных алкалоидов опия, и 3-4 мкл экстракта исследуемого объекта. Полученные хроматограммы рассматривают в ультрафиолетовом свете, отмечая при этом зоны поглощения флуоресценции. Выявленные зоны проявляют реактивом Марки. При этом зоны морфина и кодеина окрашиваются в фиолетовый цвет, а зона тебаина - желтый. Хроматограммы могут быть проявлены реактивом Драгендорфа, который окрашивает все выявленные зоны в коричневый цвет. Разделение проводят в следующих системах растворителей: толуол (бензол)-этанол-триэтиламин - 9:1:1; толуол-ацетон-этанол-25% водный раствор аммиака - 45:45:7:3; этанол-диэтиловый эфир-25% водный раствор аммиака - 3:6:1.

В данном способе для идентификации опия и водных экстрактов используется качественная цветная реакция на содержание меконовой кислоты - природного спутника опия. Готовят 3%-ный раствор хлорида железа, который вносят в экстракт исследуемого объекта. Эта реакция позволяет отличать экстракт маковой соломы от опия и его водных экстрактов. При этом навеску опия растворяют в воде в соотношении 1:100 и к 10 мл водного извлечения прибавляют одну каплю водного раствора хлорида железа (III). При наличии меконовой кислоты появляется красное окрашивание.

Для количественного определения морфина и кодеина используется метод газовой хроматографии. Исследуемый объект, высушенный при 110-115°С до постоянного веса, измельчают; затем навеску 0,5 г помещают в коническую колбу с притертой пробкой, смачивают 1,25 мл 5% водного раствора карбоната калия, тщательно перемешивают до равномерного увлажнения и оставляют на 15 мин для набухания. Затем приливают 25 мл хлороформа, колбу закрывают пробкой и перемешивают в течение 30-40 мин. Прилипшие к стенкам колбы частицы периодически погружают в раствор стеклянной палочкой. Раствор фильтруют через ватный фильтр, отбирают 20 мл фильтрата, переносят его в круглодонную колбу, добавляют 1 мл стандартного раствора метилстеарата в метаноле, этаноле или хлороформе (концентрация метилстеарата - 1 мг/мл) и отгоняют растворитель досуха. После окончания отгонки растворителя экстракт обрабатывают силилирующей смесью, для этого в колбу с экстрактом добавляют 1 мл пиридина и осторожно смывают пленку экстракта со стенок колбы. Затем к пиридиновому раствору последовательно добавляют 0,6 мл гексаметилдисилазана и 0,2 мл триметил-хлорсилана, перемешивая смесь после добавления каждого реагента. Смесь выдерживают 20 мин при температуре 40-50°С. Определение проводят на набивной колонке длиной 2-3 м с нанесенной фазой OV-101 или SE-30 (3 или 5%) или капиллярной кварцевой колонке длиной 10-25 м и диаметром 0,2 мм с нанесенной фазой OV-101. Газ-носитель - гелий или азот. Условия хроматографирования следующие: детектор - пламенно-ионизационный; температура испарителя 275°С, детектора - 290°С; режим изотермический (оптимальная температура выбирается в диапазоне 230-250°С) либо с программированием температуры колонки от 200 до 280°С со скоростью 10°С/мин; деление потока газа-носителя для капиллярной колонки - 1:55.

Для количественной оценки содержания морфина и кодеина можно использовать относительный массовый коэффициент. Относительный массовый коэффициент силилпроизводных морфина и кодеина к метилстеарату равны 0,94 и 0,96 соответственно.

Несмотря на то что в ГОСТ Р 52533-2006 «Мак пищевой» имеется ссылка на данную методику, но как способ определения наркотических алкалоидов опия в семенах мака пищевого вышеописанный способ не рассматривает семена мака пищевого как источник наркотически активных алкалоидов опия и не содержит указаний по извлечению и анализу алкалоидов опия из семян мака. Более того, в методике указано, что семена мака наркотических алкалоидов опия не содержат и к наркотическим средствам не относятся.

Наиболее близким аналогом является способ определения опийных алкалоидов на семенах мака (Колычев И.А. Криминалистическое исследование наркотических средств, получаемых из растений мака /И.А.Колычев, B.C.Федорович / Судебная экспертиза. - 2007. - №1. - С.102-109).

В процессе пробоподготовки берут среднюю навеску семян мака массой по 25,00 г и помещают в колбу, в которую добавляют 50 мл смеси толуол: ацетон: этанол: раствор аммиака в соотношении 25:25:2:1 и проводят экстракцию при встряхивании в течение одного часа. Полученные экстракты сливаются в отдельную колбу, а оставшуюся в колбе навеску вновь заливают 50 мл такой же экстракционной смесью, процедуру повторяют еще дважды. Объединенные экстракты упаривают до исчезновения запаха органического растворителя. К образовавшимся вязким маслянистым веществам темно-коричневого цвета добавляют 25 мл 0,3%-ного раствора соляной кислоты и кипятят в течение 15-20 минут, охлаждают и аккуратно отбирают водную фракцию, например, шприцем с иглой. Данную процедуру повторяют дважды. К оставшемуся после второго добавления соляной кислоты маслянистому остатку добавляют 15-20 мл ацетона, а к полученному раствору - 0,3%-ный раствор соляной кислоты объемом 20-25 мл. При этом образовывается устойчивая эмульсия, которую сначала выдерживают в течение 10-15 минут в обычных условиях, а затем кипятят до исчезновения запаха ацетона, периодически добавляя воду. Полученные экстракты отфильтровывают и упаривают при температуре 110°С до образования сухих остатков. Сухие остатки растворяют в 10 мл элюента (ацетонитрил - фосфатный буфер (3:7), фосфатный буфер: 0,04 М K₂HPO₄, pH 3,5 с добавлением ион-парного реагента (додецил-сульфат натрия)). Полученные растворы отстаивают и фильтруют, затем анализируют методом ВЭЖХ.

Экстракты наркотических средств, получаемых из мака, имеют темно-коричневую окраску, поэтому проведение известных капельных химических реакций при их исследовании нецелесообразно. Для проведения химического исследования опия с использованием качественной цветной реакции на содержание в нем меконовой кислоты необходимо навеску вещества растворить в воде в соотношении 1:100, а к 10 мл водного извлечения прибавить одну каплю 0,3%-ного водного раствора хлорида железа (III). При наличии меконовой кислоты появляется красное окрашивание. Данная реакция позволяет отличать экстракционный опий от опия, в котором содержится меконовая кислота. Стоит отметить, что меконовая кислота - природный спутник опия.

Данный способ пробоподготовки очень трудоемкий и длительный, однако он обеспечивает высокую степень экстракции алкалоидов опия. При анализе проб с внесением морфина было установлено, что его потери при экстракции составляют не более 5%. При таком способе удается проанализировать шесть образцов в течение двух рабочих дней.

Технической задачей заявленного изобретения является упрощение способа определения опийных алкалоидов из семян мака пищевого, снижение трудоемкости и уменьшение времени определения опийных алкалоидов.

Для решения технической задачи предлагается экстракционную пробоподготовку для определения опийных алкалоидов осуществлять экстрагентом, представляющим водно-ацетонитрильную смесь. При этом исходные компоненты взяты в диапазоне соотношений вода: ацетонитрил от 38:12 до 42:8 соответственно. Полученный экстракт анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией при длинах волн 210, 220 нм. При переводе алкалоидов в солевую форму повышается скорость их извлечения путем добавления минеральной кислоты. Следует также отметить, что определение опийных алкалоидов можно осуществлять и без добавки минеральной кислоты. Добавка в смесь минеральной кислоты обусловлена тем, что она не вносит мешающего влияния при их определении и легко удаляется при термической обработке.

Наиболее эффективно пробоподготовку осуществлять водно-ацетонитрильной смесью, в которой исходные компоненты взяты в соотношении 40:10.

На фиг.1 представлен график исследования зависимости степени извлечения алкалоидов от соотношения вода: ацетонитрил; на фиг.2 - график зависимости степени извлечения алкалоидов от объема добавленной минеральной кислоты; на фиг.3а - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 35:15 соответственно; на 3б - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно; на 3в - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 45:5 соответственно; на 3г - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно с добавлением ортофосфорной кислоты в объеме 0,01 мл; на 3д - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно с добавлением ортофосфорной кислоты в объеме 0,03 мл; на 3е - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно с добавлением ортофосфорной кислоты в объеме 0,05 мл; на 3ж - хроматограмма экстракта из семян мака масличного при соотношении вода: ацетонитрил 40:10 соответственно с добавлением ортофосфорной кислоты в объеме 0,07 мл.

Выбор оптимальных условий для решения технической задачи проводили, взяв навеску семян мака, помещенную в колбу, заливая водным раствором ацетонитрила в качестве экстрагента. Исследования по установлению оптимальных соотношений вода: ацетонитрил, при которых извлечение опийных алкалоидов максимально, представлено на фиг.1.

Как видно из графика на фиг.1, оптимальным является соотношение вода: ацетонитрил, равное 38:12-42:8 соответственно, наилучшим - 40:10. Эффективность экстракции алкалоидов повышается путем добавления минеральной кислоты за счет образования их солевых форм. С учетом уровня определяемых концентраций алкалоидов концентрация минеральной кислоты, например, 85% о-фосфорной кислоты минимально от 0,045 мл (фиг.2). Как видно из хроматограмм, приведенных на фиг.3а - фиг.3в извлечения алкалоидов целесообразно проводить при соотношении вода: ацетонитрил 38:12-42:8 соответственно. Из хроматограмм на фиг.3г - 3ж мы видим, что добавка минеральной кислоты повышает степень экстракции алкалоидов. Наилучшими аналитическими условиями для определения алкалоидов являются длины волн 210, 220 нм.

Степень извлечения алкалоидов в процессе экстракции повышается при встряхивании за счет интенсификации контакта семян мака с экстрагентом.

Пример: 20 мл экстрагента, состоящего из воды, ацетонитрила и о-фосфорной кислоты, взятых в соотношении 40:10:0.05 соответственно (соотношение может варьироваться в зависимости от используемых реактивов и условий экстракции). Колбы устанавливают на встряхиватель, проводят экстракцию 10-15 минут, после чего полученный экстракт из каждой колбы сливают в отдельную колбу, оставшуюся навеску повторно заливают такой же смесью и повторяют экстракцию. В третий раз навеску достаточно промыть 10 мл экстрагента. Объединенные экстракты фильтруют и доводят водой до метки в колбе на 50 мл. Полученный экстракт из семян мака анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при следующих условиях:

1. Жидкостный хроматограф с фотометрическим детектором в УФ-области спектра.

2. Колонка с обращенно-фазным сорбентом.

3. Возможно как изократическое, так и градиентное элюирование, при этом состав элюента подбирается в зависимости от используемой колонки. При градиентном элюировании достигается наибольшая эффективность разделения компонентов. При этом наиболее универсальным составом элюента при работе с обращенно-фазными хроматографическими колонками может служить следующий вариант: первая ступень: ацетонитрил - фосфатный буфер (3:7), вторая ступень - ацетонитрил - фосфатный буфер (6:4).

4. Фосфатный буфер: 0,04 М K₂HPO₄, pH 3,5 с добавлением ион-парного реагента (додецилсульфат натрия).

5. Аналитическая длина волны - 210, 220 нм.

Полученные результаты представлены на фиг.3б.

Содержание морфина в семенах, мг/г семян 4,1±0,5.

Содержание кодеина в семенах, мг/г семян 0,61±0,08.

На полученной хроматограмме (фиг.3б) имеются пики, соответствующие меконовой кислоте, морфину, кодеину, тебаину. Возможность определения меконовой кислоты позволяет исключить дополнительный этап ее анализа методом капельных реакций. Анализ алкалоидов опия на семенах мака пищевого в этом случае занимает время менее одного часа. Степень экстракции алкалоидов при этом составляет 93-95%.

В отличие от прототипа в заявленном способе используют экстрагент другого состава. Кроме того, данный метод является более дешевым и экспрессным по сравнению с прототипом.

Изобретение относится к способу определения опийных алкалоидов, который может найти применение, в частности, при оценке соответствия мака пищевого требованиям ГОСТ Р 52533-2006 «Мак пищевой» и в судебной экспертизе для определения количественного содержания наркотических компонентов. Предлагаемый способ определения опийных алкалоидов включает в себя экстракционную пробоподготовку, осуществляемую водно-ацетонитрильной смесью с соотношением компонентов вода:ацетонитрил от 38:12 до 42:8, а также анализ полученного экстракта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, осуществляемый при длинах волн 210, 220 нм. Также можно повысить скорость извлечения алкалоидов путем добавления в экстрагирующую водно-ацетонитрильную смесь минеральной кислоты, например ортофосфорной кислоты. Данный способ определения опийных алкалоидов отличается от известных аналогов уменьшенным временем анализа и сниженным числом проводимых операций при сохранении степени экстракции алкалоидов на уровне 93-95%. 2 з.п. ф-лы, 9 ил.

1. Способ определения опийных алкалоидов, включающий экстракционную пробоподготовку и анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что в качестве экстрагента используют водно-ацетонитрильную смесь, при этом исходные компоненты взяты в соотношении 38:12-42:8 соответственно, а анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют при длинах волн 210, 220 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в водно-ацетонитрильной смеси исходные компоненты взяты в соотношении 40:10 соответственно.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что определение осуществляют с добавлением минеральной кислоты, например ортофосфорной кислоты.