СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЛИСТЬЯХ МЯТЫ ПЕРЕЧНОЙ Российский патент 2025 года по МПК A61K36/534 A61K31/235 G01N30/02 G01N30/06 G01N30/74 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения розмариновой кислоты в листьях мяты перечной (Mentha piperita L.).

Род Мята (Mentha L.) имеет около 42 видов растений и их гибридов, широко культивируемых по всей территории Российской Федерации и стран ближнего зарубежья. Мята перечная (Mentha piperita L.) является единственным фармакопейным представителем рода Mentha L. (1).

Сырье мяты перечной применяется в фармацевтической, пищевой, сельскохозяйственной и парфюмерной промышленности. Она является многолетним травянистым растением, размножающимся вегетативно, отрезками корневищ и молодыми побегами от перезимовавших в почве корневищ. Также широко культивируются различные сорта мяты перечной, отличающиеся содержанием эфирного масла, ментола и устойчивостью к грибковым болезням и вредителям (2).

Вопросы стандартизации листьев мяты перечной и препаратов на основе данного сырья не теряют своей актуальности. Мята перечная и ее сортовые формы активно исследуются учеными со всего мира. При обзоре литературы нами были выявлены несоответствия в подходах к стандартизации сырья листьев мяты перечной и препаратов на его основе (3-6). Так, в фармакопеях зарубежных стран для стандартизации листьев мяты перечной определяют количественное содержание эфирного масла, тогда как сумма флавоноидов не определяется (3). Однако в случае экстракта сухого из листьев мяты перечной методом ВЭЖХ определяют содержание розмариновой кислоты (4).

Ранее нами были проведены исследования, которые способствуют совершенствованию методик качественного и количественного анализа листьев мяты перечной, в частности прямая спектрофотометрия (7, 8). В ходе исследований были выявлены диагностически значимые фенилпропаноиды листьев мяты перечной - розмариновая кислота, хлорогеновая кислота и сальвианоловая кислота, среди которых доминирующим является розмариновая кислота.

В настоящее время актуальны вопросы совершенствования методик качественного и количественного анализа с использованием высокотехнологичного оборудования - например высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Исходя из зарубежного опыта, нами была рассмотрена существующая разработанная методика количественного определения содержания розмариновой кислоты в листьях мяты перечной методом ВЭЖХ (9). В одной из методик образцы растений (1,0 г) экстрагируют два раза, каждый раз в течение 45 мин при 100°C 50%-ным этанолом, с использованием оборудования с горячим обратным холодильником, и экстракты объединяют в колбе объемом 100 мл с 50%-ным этанолом; для проведения анализа в качестве подвижной фазы применяют систему растворителей: А - 0,05% раствор метанол-вода-трифторуксусная кислота, Б - ацетонитрил-вода-трифторуксусная кислота и В - 0,05% раствор тетрагидрофуран-вода-трифторуксусная кислота. Однако данная методика анализа продолжительна по времени (около 60 минут), сопряжена с большим расходом подвижной фазы, тем более в градиентном режиме и, как следствие, повышением стоимости одного анализа. Данная методика выбрана нами в качестве прототипа.

Известна также методика количественного определения суммы флавоноидов, включенная в Государственную фармакопею XIV издания, в соответствии с которой количественное определение суммы флавоноидов производится в пересчете на лютелоин и абсолютно сухое сырье в процентах, однако они не определяют содержание диагностически значимых соединений, такие как розмариновая кислота и общее содержание суммы фенилпропаноидов.

Недостатком данной методики является то обстоятельство, что в испытуемом растворе анализируется лютеолин, который в результате проведенных нами исследований был обнаружен в данном лекарственном растительном сырье в количестве гораздо меньшем, чем розмариновая кислота. Определение в сырье содержания суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин и абсолютно сухое сырье является мало специфичным методом, вследствие чего возрастает процент аналитической ошибки метода, является актуальным исследование в плане совершенствования методики количественного определения розмариновой кислоты в сырье данного растения. Необоснованной представляется и продолжительность экстракции (1,5 часа).

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения розмариновой кислоты в листьях мяты перечной, обладающего высокой специфичностью и точностью.

Техническим результатом является создание способа количественного определения розмариновой кислоты в листьях мяты перечной методом ВЭЖХ.

Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 60% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, время экстракции - извлечение на кипящей водяной бане в течение 60 мин, степень измельчения сырья - 2 мм.

При анализе методом ВЭЖХ были использованы: ацетонитрил (ООО «Компонент-реактив», «Для высокоэффективной жидкостной хроматографии»); вода, полученная с использованием системы для получения воды очищенной с многоступенчатой системой очистки (адсорбция, обратный осмос, мембранное фильтрование) и проверенная на чистоту в условиях хроматографического анализа. Остальные реактивы имели степень чистоты х.ч.

Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 60% этанола. Колбу закрывали пробкой и взвешивали на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждали в течение 30 мин, закрывали той же пробкой, снова взвешивали и восполняли недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр («Синяя лента»). Перед хроматографическим анализом дополнительно фильтровали через мембранный фильтр Milipore (0,22 мкм).

Хроматографический анализ осуществляли методом ВЭЖХ в изократическом режиме на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») в следующих условиях: изократический режим, стальная колонка «КАХ-6-80-4» (№2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), элюентная система: ацетонитрил (ПФА) - 1% раствор уксусной кислоты (ПФБ) (2:8), скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем элюента - 2500 мкл. Детекцию веществ осуществляли при длине волны 330 нм. Объемы инжектируемых проб - 2 мкл (фиг. 1, фиг. 2).

На фиг. 1 изображена ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения из листьев мяты перечной. На фиг. 2 изображена ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения и розмариновой кислоты, где: 1 - водно-спиртовое извлечение, 2 - розмариновая кислота.

Количественное определение розмариновой кислоты в листьях мяты перечной проводят при длине волны 330 нм; содержание розмариновой кислоты X в листьях мяты перечной в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

Где H - среднее значение высоты пика розмариновой кислоты испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;

H₀ - среднее значение высоты пика раствора СО розмариновой кислоты, вычисленное из хроматограмм раствора РСО розмариновой кислоты;

V - объем извлечения, мл;

V₁ - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;

V₀ - объем раствора СО розмариновой кислоты, мл;

V₂ - объем вводимой пробы раствора РСО розмариновой кислоты, мкл;

m - масса сырья, г;

m₀ - масса СО розмариновой кислоты, г;

W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно розмариновая кислота определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев мяты перечной.

Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение розмариновой кислоты в листьях мяты перечной при аналитической длине волны 330 нм.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 минут, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («Синяя лента»). Перед хроматографическим анализом дополнительно фильтруют через мембранный фильтр Milipore (0,22 мкм).

В жидкостный хроматограф «Милихром-6» (НПАО «Научприбор») с УФ-детектором вводят 2 мкл полученного раствора. Хроматографируют в условиях прямой хроматографии в изократическом режиме на стальной колонке «КАХ-6-80-4» (№2; 2 мм х 80 мм; Сепарон-C18 7 мкм), элюентная система: ацетонитрил (ПФА) - 1% раствор уксусной кислоты (ПФБ), скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем пробы испытуемого раствора - 2 мкл. Проводят УФ-детектирование при длине волны 340 нм, диапазон чувствительности - 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений. Соотношение компонентов в элюентной системе равняется 2:8.

Параллельно 10 мкл раствора розмариновой кислоты вводят в хроматограф и хроматографируют, как описано выше. Определяют время удерживания и идентифицируют пик розмариновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора. Вычисляют высоту пика розмариновой кислоты на хроматограмме и рассчитывают среднюю высоту пика по 3 параллельным определениям.

Содержание розмариновой кислоты в листьях мяты перечной в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:

Где H - среднее значение высоты пика розмариновой кислоты испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца; H₀ - среднее значение высоты пика раствора СО розмариновой кислоты, вычисленное из хроматограмм раствора (РСО розмариновой кислоты; V - объем извлечения, мл; V₁ - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл; V₀ - объем раствора СО розмариновой кислоты, мл; V₂ - объем вводимой пробы раствора РСО розмариновой кислоты, мкл; m - масса сырья, г; m₀ - масса СО розмариновой кислоты, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

Пример 1

Аналитическую пробу сырья мяты перечной измельчают до размера частиц 2 мм (заготовленной в ботаническом саду Самарского университета (июнь 2022 г.)). 1,0009 г измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют
50 мл 60% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 минут. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса).

Для расчета содержания розмариновой кислоты готовят раствор стандартного образца розмариновой кислоты, проводят измерение при длине волны 330 нм и полученное значение используют в формуле расчета.

Приготовление раствора стандартного образца цинарозида

0,005 г розмариновой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 1 мл 96% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 96% этиловым спиртом до метки (раствор А розмариновой кислоты). После чего 1 мл
раствора А розмариновой кислоты помещают в мерную колбу на 5 мл, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96%.

Измерение извлечений проводят при длине волны 330 нм через 30 минут.

Содержание розмариновой кислоты X в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:

Где 417,92 - среднее значение высоты пика розмариновой кислоты испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;

145,04 - среднее значение высоты пика раствора СО розмариновой кислоты, вычисленное из хроматограмм раствора СО розмариновой кислоты;

50 - объем извлечения, мл;

2 - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;

5 - объем раствора СО розмариновой кислоты, мл;

2 - объем вводимой пробы раствора СО розмариновой кислоты, мкл;

1,0002 - масса сырья, г;

0,0020 - масса СО розмариновой кислоты, г;

14 - потеря в массе при высушивании сырья, %.

Содержание розмариновой кислоты в листьях мяты перечной в пересчете на сухое сырье = 6,70%.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Государственная фармакопея Российской Федерации / МЗ РФ. XIV изд. Т. I-IV. М., 2018. [Электронный ресурс] URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14 (дата обращения: 04.05.2022).

2. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для фармацевтических вузов (факультетов). - 5-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2020 - 1280 с.

3. Европейская фармакопея VIII издания Peppermint leaf 01/2011:0406.

4. Европейская фармакопея VIII издания Peppermint leaf dry extract 04/2009:2382.

5. Государственная фармакопея Республики Беларусь. В 3 т. Т. 3 Контроль качества фармацевтических субстанций / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении»; под общ. ред. А.А. Шерякова., Минск: Минск государственный ПТК полиграфии им. В. Хоружей, (2009).

6. Государственная фармакопея Республики Казахстан. Т. 1. - Алматы: Издательский дом «Жибек жолы», 2008. - 592 с.

7. Казакова, М. А. Исследование компонентного состава листьев мяты перечной методом ВЭЖХ / М. А. Казакова, В. А. Куркин, А. Р. Мубинов // Фармация. - 2023. - Т. 72, № 8. - С. 33-38. - DOI 10.29296/25419218-2023-08-05. - EDN DKKSEM.

8. Казакова М.А., Куркин В.А. Актуальные проблемы стандартизации мяты перечной, Актуальные проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики: материалы III Международной научно-практической конференции (Кемерово, 26 мая 2023 г.) // отв. ред. В. В Большаков, Е. М. Мальцева. - Кемерово: КемГМУ, 278с - (2023).

9. Gudzenko А. Development and validation of a method for the determination of rosmarinic acid in Mentha piperita L. using solid-phase extraction and RP-HPLC with photodiode array detection // Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2013. T. 5. № 9. Рр. 40-45.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу количественного определения содержания розмариновой кислоты в листьях мяты перечной. Способ осуществляют путем экстракции сырья органическими растворителями с последующей пробоподготовкой и определением оптической плотности методом ВЭЖХ, при этом экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 60% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, время экстракции – извлечение на кипящей водяной бане в течение 60 мин, степень измельчения сырья – 2 мм; количественное определение розмариновой кислоты в листьях мяты перечной проводят при длине волны 330 нм; содержание розмариновой кислоты X в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:

где H – среднее значение высоты пика розмариновой кислоты испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца; H₀ – среднее значение высоты пика раствора СО розмариновой кислоты, вычисленное из хроматограмм раствора РСО розмариновой кислоты; V – объем извлечения, мл; V₁ – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл; V₀ – объем раствора СО розмариновой кислоты, мл; V₂ – объем вводимой пробы раствора РСО розмариновой кислоты, мкл; m – масса сырья, г; m₀ – масса СО розмариновой кислоты, г; W – потеря в массе при высушивании сырья, %. Вышеописанный способ позволяет определять розмариновую кислоту в листьях мяты перечной методом ВЭЖХ. 2 ил., 1 пр.

Способ количественного определения содержания розмариновой кислоты в листьях мяты перечной путем экстракции сырья органическими растворителями с последующей пробоподготовкой и определения оптической плотности методом ВЭЖХ, отличающийся тем, что экстракцию сырья осуществляют этиловым спиртом в концентрации 60% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:50, время экстракции – извлечение на кипящей водяной бане в течение 60 мин, степень измельчения сырья – 2 мм; количественное определение розмариновой кислоты в листьях мяты перечной проводят при длине волны 330 нм; содержание розмариновой кислоты X в процентах в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:

где H – среднее значение высоты пика розмариновой кислоты испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца;

H₀ – среднее значение высоты пика раствора СО розмариновой кислоты, вычисленное из хроматограмм раствора РСО розмариновой кислоты;

V – объем извлечения, мл;

V₁ – объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл;

V₀ – объем раствора СО розмариновой кислоты, мл;

V₂ – объем вводимой пробы раствора РСО розмариновой кислоты, мкл;

m – масса сырья, г;

m₀ – масса СО розмариновой кислоты, г;

W – потеря в массе при высушивании сырья, %.