ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ПСЕВДОМОНОЗА И ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/125 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к вакцинам, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся конструированием биологических препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Из уровня техники известна ассоциированная вакцина против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий (РФ, №2389505), содержащая суспензии клеток чистых культур возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и энтерококковой инфекции Enterococcus faecalis, полученных путем отбора пораженных органов от павших нутрий из местного эпизоотического очага, приготовления суспензии, посева на дифференциально-диагностические среды, выделения чистых культур возбудителей, их раздельного выращивания в мясопептонном бульоне с глюкозой до концентрации микробных клеток 4-5 млрд в 1 см³, формалин и гидроокись алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%: суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенной из пораженных органов павших нутрий из местного эпизоотического очага, в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ - 38,0-41,5; суспензия клеток чистой культуры возбудителя энтерококковой инфекции Enterococcus faеcalis, выделенной из пораженных органов павших нутрий из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ - 38,0-41,5; глюкоза - 2,0-1,0; формалин - 2,0-1,5; гидроокись алюминия - остальное.

Указанная вакцина безвредна, высокоиммуногенна, но она специфична для защиты от псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий.

Известна также ассоциированная вакцина против стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (РФ, №2429879), содержащая в качестве антигенов суспензию клеток чистых культур возбудителей стрептококкоза Str. pneumoniae и вируса вирусной гемморагической болезни кроликов, полученных путем oтбopa пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, приготовления суспензии, посева на дифференциально-диагностические среды, выделения чистых культур возбудителей стрептококкоза и вируса вирусной гемморагической болезни кроликов, выращивание проводят раздельно в мясопептонном бульоне Str. pneumoniae с глюкозой до концентрации микробных клеток 4-5 млрд в 1 см³ и получением 10-15%-ной суспензии печени от кроликов, после заражения вирусной геморрагической болезнью кроликов с активностью не менее 10^3,0-4,0ЛД₅₀/см³, смешивают их в равных соотношениях формалина и гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%: суспензия клеток чистой культуры возбудителя стрептококкоза Str. pneumoniae, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ - 38,0-41,5; суспензия печени кроликов с вирусом вирусной гемморагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0-4,0ЛД₅₀/см³ - 38,0-41,5; глюкоза - 2,0-1,0; формалин - 2,0-1,5; гидроокись алюминия - остальное. Указанная вакцина безвредна, высокоиммуногенна, но она специфична для защиты от стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

Техническим результатом изобретения является специфичность и эффективность вакцины против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, обеспечение профилактики за счет более раннего наступления иммунитета, исключение отрицательного и побочного влияния на организм.

Технический результат достигается тем, что в вакцине, ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, содержащей суспензию инактивированного антигена возбудителя заболевания и вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях, полученных путем отбора пораженных органов от павших кроликов и из местного эпизоотического очага, а также формалин и гидроокись алюминия, при этом приготовление суспензии антигена возбудителя заболевания проводят путем приготовления суспензии пораженных органов от павших кроликов, посева на дифференциально-диагностические среды, выращивания в мясопептонном бульоне с глюкозой до концентрации микробных клеток 4-5 млрд в 1 см³ и выделения чистых культур возбудителя заболевания, а суспензию клеток чистой культуры возбудителя вируса геморрагической болезни кроликов, выделенной из пораженного органа павшего кролика из местного эпизоотического получают после заражения указанным вирусом кроликов в виде 10-15%-ной суспензии клеток печени от зараженных кроликов с активностью не менее 10^3,0ЛД₅₀/см³, смешивают полученные суспензии клеток чистой культуры возбудителя заболевания и суспензии клеток печени кроликов с вирусом геморрагической болезни кроликов, отличающейся тем, что в качестве антигена возбудителя заболевания вакцина содержит суспензию клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ 38,0-41,5 суспензия клеток печени кроликов с вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 38,0-41,5 глюкоза 2,0-1,0 формалин 2,0-1.5 гидроокись алюминия остальное

Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что в качестве второго адьюванта вакцина содержит клетки культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, что позволяет получить вакцину, специфичную против псевдомоноза и вирусной гемморагической болезни кроликов, а также при профилактике заболеваний иммунитет формируется на 3-5 суток раньше по сравнению с прототипом.

При раздельном культивировании чистых культур возбудителей позволяем получать концентрацию Pseudomonas aeruginosa не менее 4-5 млрд в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов с активностью не менее 10^3,0ЛД₅₀/см³. Инактивирование баксырья формалином в 0,1-0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°C в течение 72-96 часов позволяет подавить патогенность возбудителей и сохранить их иммуногенные свойства в течение 12 месяцев. Смешивание инактивированных антигенов Pseudomonas aeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях, внесение гидроокиси алюминия и тщательное перемешивание не вызывает у привитых кроликов поствакцинальных осложнений, позволяет обеспечить формирование напряженного иммунитета на 3-5 суток раньше, по сравнению с прототипом, продолжительностью не менее 12 месяцев после двукратного введения кроликам вакцины против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов с интервалом 7-10 дней в дозе по 1,0 см³. Использование чистых культур возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенных из местного эпизоотического очага от больных и павших животных позволяет значительно повысить специфичность вакцины, после вакцинации обеспечивает защиту животных сразу против двух опасных инфекционных болезней псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная совокупность компонентов, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят (ТУ 10.09-62-90 утверждены 01.0.90 г., инструкция по изготовлению и контролю дайной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.). Выпускаемая в стране в ООО «Родники» Московской области вакцина против вирусного энтерита, ботулизма, псевдомоноза норок (патент РФ №2032423 от 10.04.1995 г.) вакцина против вирусного энтерита, ботулизма, псевдомоноза и чумы плотоядных (патент РФ №2086260 от 10.08.1997 г.). Однако для кроликов эти вакцины не применяются.

Методы выделения и характеристика микроорганизмов рода Pseudomonas aeruginosa описаны в «Практикуме но ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр.259-261, в справочнике «Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных» автор: Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С., М.: «ИзограФъ», 2005, стр.522-525-169.

Meтоды выделения и характеристика вирусной геморрагической болезни кроликов описаны в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов», утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 28.12.88.г.; в книге «Вирусная геморрагическая болезнь кроликов» авторы: Шевченко А.А., Вишняков И.Ф., Бакулов И.Л., Власова Т.А. М.: «Две Короны», 1995, 48 с.; в книге «Болезни кроликов», авторы: Шевченко А.А., Шевченко Л.B., М.: «Аквариум», 2010, стр.42-57.

Вакцину готовят следующим образом: проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют клетки чистых культур возбудителей инфекционных болезней псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, выращивают клетки чистой культуры возбудителя Pseudomonasaeruginosa в мясопептонном бульоне с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³, а вирусом геморрагической болезни кроликов заражают кроликов, которые погибают через 48-72 ч. Затем приготавливают 10-15%-ную суспензию из печени павших кроликов от зараженных вирусом геморрагической болезни кроликов с активностью не менее 10^3,0ЛД₅₀/см3, инактивируют раздельно путем внесения формалина до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°C в течение 48-96 часов, смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, содержит суспензии клеток инактивированных формалином возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, адсорбированные на гидрате окиси алюминия. Но внешнему виду вакцина представляем собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь. Срок хранения в сухом, темном месте при температуре от 2 до 10°C 1 год. Вакцина предназначена для профилактики опасных инфекционных заболеваний против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Она вызывает образование специфического иммунитета против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Вакцина безвредна и ареактогенна. Иммунитет у кроликов, привитых вакциной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, формируется на 3-5 суток раньше, чем у прототипа (12-15 суток) после двукратного введения с интервалом 7-10 дней в дозе по 1.0 см³ против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, продолжительностью не менее 12 месяцев. Вакцину применяют в неблагополучных и угрожаемых по псевдомонозу и вирусной геморрагической болезни кроликов хозяйствах в дозах, указанных выше.

Продукты убоя вакцинированных животных используют без ограничений независимо от сроков вакцинации.

К факторам, обуславливающим получение вакцины заданною свойства, относятся последовательность изготовления и процентное соотношение между компонентами, входящими в препарат.

Приведено пять примеров, содержащих компоненты в различных соотношениях на 100 мл вакцины.

Пример 1.

Берут пораженные органы от павших кроликов в эпизоотическом очаге, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют клетки чистой культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonasaeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно культивируют, получают, инактивируют и смешивают (мас.%) суспензию микробных клеток 75,0 с титром 4-5 млрд и содержанием глюкозы 0,5, инактивируют внесением формалина 1,0, затем добавляют гидроокись алюминия - остальное, тщательно смешивают и получают вакцину следующего состава при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ 37,5 суспензия печени кроликов с вирусом вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом рас пюре с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 37,5 глюкоза 0,5 формалин 1,0 гидроокись алюминия остальное

При данном соотношении компонентов вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, обладает слабой иммуногенной активностью.

Пример 2.

Берут пораженные органы от павших кроликов в эпизоотическом очаге, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют клетки чистой культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно культивируют, получают, инактивируют и смешивают (мас.%) суспензию микробных клеток 78,0 с титром 4-5 млрд и содержанием глюкозы 1,0, инактивируют внесением формалина 1.5, затем добавляют гидроокись алюминия - остальное, тщательно смешивают и получают вакцину следующего состава при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ 39,0 суспензия печени кроликов с вирусом вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 39,0 глюкоза 1,0 формалин 1,5 гидроокись алюминия остальное

При данном соотношении компонентов вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, обладает умеренной иммуногенной активностью.

Пример 3.

Берут пораженные органы от павших кроликов в эпизоотическом очаге, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют клетки чистой культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно культивируют, получают, инактивируют и смешивают (мас.%) суспензию микробных клеток 80,0, с титром 4-5 млрд и содержанием глюкозы 1,7, инактивируют внесением формалина 1,3, затем добавляют гидроокись алюминия - остальное, тщательно смешивают и получают вакцину следующего состава при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с пиром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ 40,0 суспензия печени кроликов с вирусом вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 40,0 глюкоза 1,7 формалин 1,3 гидроокись алюминия остальное

При данном соотношении компонентов вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, обладает иммуногенной активностью.

Пример 4.

Берут пораженные органы от павших кроликов в эпизоотическом очаге, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют клетки чистой культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonasaeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно культивируют, получают, инактивируют и смешивают (мас.%) суспензию микробных клеток 83,0 с титром 4-5 млрд и содержанием глюкозы 1,0, инактивируют внесением формалина 1,5, затем добавляют гидроокись алюминия - остальное, тщательно смешивают и получают вакцину следующего состава при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonasaeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ 41,5 суспензия печени кроликов с вирусом вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 41,5 глюкоза 1,0 формалин 1,5 гидроокись алюминия остальное

При данном соотношении компонентов вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, обладает иммуногенной активностью, формирует после вакцинации выраженный напряженный иммунитет, не вызывает поствакцинальных осложнений, стабильна при хранении в течение 12 месяцев (таблица 1).

Пример 5.

Берут пораженные органы от павших кроликов в эпизоотическом очаге, из которых приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют клетки чистой культуры возбудителей псевдомоноза Pseudomonasaeruginosa и вируса вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно культивируют, получают, инактивируют и смешивают (мас.%) суспензию микробных клеток 85,0 с титром 4-5 млрд и содержанием глюкозы 2,0, инактивируют внесением формалина 1,5, затем добавляют гидроокись алюминия - остальное, тщательно смешивают и получают вакцину следующего состава при следующем соотношении компонентов, мас.%:

суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonasaeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 7-8 млрд микробных клеток в 1 см³ 42,5 суспензия печени кроликов с вирусом вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 42,5 глюкоза 2,0 формалин 1,5 гидроокись алюминия остальное

При данном соотношении компонентов вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, обладает слабой иммуногенной активностью, формирует напряженный иммунитет, у отдельных животных на месте введение препарата вызывает слабое раздражение.

Таблица Сравнительная оценка эффективности вакцины Вакцина Доза вакцины в см³ Метод введения Иммунобиологические свойства Кол-во кроликов в опыте (гол) Наличие поствакцинальных осложнений Длительность иммунитета (мес.) Защита в (%) По прототипу (вакцина против стрептококкоза и пастереллеза) 1,0 Внутримышечно 1000   9 80-90 По предлагаемому способу 1,0 Внутримышечно 1000 нет 12 90-100

Из данных таблицы видно, что предлагаемая вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, имеет значительные преимущества в сравнении с вакциной по прототипу.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для профилактики псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Вакцина в качестве антигенов содержит суспензию клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa и вируса геморрагической болезни кроликов, полученных путем отбора пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага. Затем готовят суспензию, проводят посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей. Выращивание проводят раздельно в мясопептонном бульоне Pseudomonas aeruginosa с глюкозой с концентрацией микробных клеток 4-5 млрд в 1 см³. Получают 10-15%-ной суспензии печени от кроликов, после заражения вирусом геморрагической болезни кроликов, с активностью не менее 10^3,0 ЛД₅₀/см³. Смешивают их в равных соотношениях формалина и гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов, мас.%: суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд микробных клеток в 1 см³ 38,0-41,5, суспензия печени кроликов с вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из местного эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0-4,0 ЛД ₅₀/см³ - 38,0-41,5, глюкоза - 2,0-1,0, формалин - 2,0-1,5, гидроокись алюминия - остальное. Использование заявленного изобретения позволяет повысить специфичности и эффективности вакцины ассоциированной против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов при отсутствии отрицательного побочного влияния на животных. 1 табл., 5 пр.

Вакцина, ассоциированная против псевдомоноза и вирусной геморрагической болезни кроликов, содержащая суспензию инактивированного антигена возбудителя заболевания и вирусной геморрагической болезни кроликов в равных соотношениях, полученных путем отбора пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, а также формалин и гидроокись алюминия, при этом приготовление суспензии антигена возбудителя заболевания проводят путем приготовления суспензии пораженных органов от павших кроликов, посева на дифференциально-диагностические среды, выращивания в мясо-пептонном бульоне с глюкозой до концентрации микробных клеток 4-5 млрд. в 1 см³ и выделения чистых культур возбудителя заболевания, а суспензию клеток чистой культуры возбудителя вируса геморрагической болезни кроликов, выделенной из пораженного органа павшего кролика из местного эпизоотического очага, получают после заражения указанным вирусом кроликов в виде 10-15%-ной суспензии клеток печени от зараженных кроликов с активностью не менее 10^3,0 ЛД₅₀/см³, смешивают полученные суспензии клеток чистой культуры возбудителя заболевания и суспензии клеток печени кроликов с вирусом геморрагической болезни кроликов, отличающаяся тем, что в качестве антигена возбудителя заболевания вакцина содержит суспензию клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa при следующем соотношении компонентов, масс.%:
суспензия клеток чистой культуры возбудителя псевдомоноза Pseudomonas aeruginosa, выделенного из местного эпизоотического очага в питательной среде с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³ 38,0-41,5 суспензия клеток печени кроликов с вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенного из местной эпизоотического очага в физиологическом растворе с активностью 10^3,0ЛД₅₀/см³ 38,0-41,5 глюкоза 2,0-1,0 формалин 2,0-1,5 гидроокись алюминия остальное.