ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПЕПТИДЫ Российский патент 2011 года по МПК C07K14/435 C07K7/08 A61K38/17 A61K38/10 A61P35/00 A61P35/04 A61P37/04 

Область техники

Изобретение относится к области раковой иммунотерапии. Более конкретно, к пептидам, происходящим из последовательности белка 32-51 анти-LPS фактора Limulus или их комбинациям, не способным связывать липополисахарид и пригодным для лечения опухолей и метастаз.

Уровень техники

Недавно было опубликовано применение модуляторов биологического ответа для лечения рака, главным образом в комбинации с текущим лечением с целью усилить эффект лечения (US 2004/0101511). С другой стороны, использование последовательности CpG, агониста Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), было разработано в качестве применения нового препарата для лечения, профилактики и контролирования опухоли, в рамках множества показаний для лечения, то есть немелкоклеточного рака легкого, меланомы и гипернефроидной опухоли почки (Klinman D. M., et al., (2004) Immunotherapeutic uses of CpG oligodeoxynucleotides. Nat. Rev. Immunol. 4:249-258). Агонист Toll-подобного рецептора 7 (TLR7) в настоящее время проходит фазу I клинических испытаний на способность активировать иммунную систему, с многообещающими результатами в качестве нового препарата для лечения меланомы и других опухолей (Dudek A. Z., et al. (2005) ASCO Annual Meeting). Также производится оценка вышеуказанных агонистов TLR7 и 9 в протекании вирусных инфекций на основе их способности индуцировать эффективный иммунный ответ хозяина. Кроме того, так называемые белки теплового шока (Hsp), которые связываются с TLR4, были разработаны и изготовлены в качестве белка, слитого с онкопротеином Е7 вируса папилломы человека (HPV). Этот новый иммунотерапевтический подход также известен как терапевтические вакцины, с широкими перспективами лечения болезней человека, связанных с вирусом папилломы (Chu N. R. et al., (2000) Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV16 E7. Clin. Exp. Immunol. 121:216-225). Toll-подобные рецепторы - это рецепторные молекулы клеток иммунной системы, распознающие патоген-ассоциированные молекулярные структуры, такие как LPS, липотейхоевая кислота, неметилированные последовательности CpG и вирусные двух- и одноцепочечные РНК. Распознавание инвазирующего патогена рецепторами TLR помогает иммунной системе направить сбалансированный Th1/Th2 иммунный ответ на эффективное устранение инфекции из организма. Применение агонистов TLR в качестве лекарственных препаратов для лечения опухоли основано на активации врожденной и приобретенной иммунных систем путем активирования Th1 иммунного ответа, опосредованного интерферонами I типа (например, интерфероны α и β) и интерлейкином 12 (IL-12), в качестве основного механизма. Таким образом достигается высокоспецифичный и длительный иммунный ответ (Switaj T., Jalili A., et al., (2004) CpG Immunostimulatory oligodeoxynucleotide 1826 enhances antitumor effect of interleukin 12 gene-modified tumor vaccine in a melanoma model in mice. Clinical Cancer Research, Vol. 10:4165-4175). Эта двойная активация иммунной системы отличается от некоторых других иммунотерапевтических подходов, не способных вызывать длительный эффект адаптивного иммунного ответа и также неспецифически активирующих систему врожденного иммунитета с последующими побочными эффектами (Speiser D. E, et al. (2005) Rapad and strong human CD8+T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. The Journal of Clinical Inv. Vol. 115 (3)).

Дендритные клетки (DC) - это профессиональные антиген-презентирующие клетки, связывающие врожденный и адаптивный иммунный ответы путем клеточных взаимодействий и продукции цитокинов. DC классифицируются как миелоидные и лимфоидные, согласно их происхождению, на основе отличающейся экспрессии наборов поверхностных маркеров и также TLR. Лимфоидные DC, также известные как плазмацитоидные DC, являются основным источником интерферонов I типа. С учетом этих свойств, DC разрабатывались как многообещающие клеточные адъюванты для создания терапевтических вакцин против опухолей и хронических вирусных инфекций (Santini S.M., et al. (2003) A new type I IFN-mediated pathway for rapid differentiation of monocytes into highly active dendritic cells. Stem Cells, 21:357-362). Однако эта методика очень дорогая и сложная, при том, что разрабатываются более практичные и менее дорогие терапевтические стратегии (Van Epps H. L. (2005) New hope for tumor vaccines. The Journal of Experimental Medicine, Vol.202:1615).

Изначально открытые, благодаря своей противовирусной активности интерфероны I типа (интерфероны α, β) в последнее время стали известны как оказывающие важное воздействие на всю иммунную систему, инициирующие клеточный и гуморальный иммунные ответы через их действие как адъюванта на DC (Bogdan, C. (2000) The function of type I interferons in antimicrobial immunity. Curr. Opin Immunol. 12:419-424). Недавние работы осветили критическую роль эндогенных интерферонов I типа в процессах, опосредующих регрессию высокоиммуногенной сингенной саркомы мышей и защите хозяина от распространения первичной канцерогенной опухоли (Gavin P. Dunn, et al. (2005) A critical function for type I interferons in cancer immunoediting. Nature Immunology, June 12). Кроме того, IFN-α играет важную роль в инициации антивирусного ответа, опосредованного Т-лимфоцитами, путем прямой активации CD4+ или CD8+ Т-лимфоцитов при вирусной инфекции, наподобие гриппа (Fonteneau J. F, et al. (2003) Activation of influenza virus-specific CD⁺4 and CD⁺8 T cells: a new role for plasmacytoid dendritic cells in adaptive immunity. Immunobiology, 101: 3520-3526).

Hoess (WO 95/05393) раскрывает в своем изобретении вещества, связывающие LPS с высокой афинностью, полезные для предотвращения или лечения инфекций наподобие сепсиса, опосредованного грамм-негативными или грамм-позитивными бактериями, бактериальных инфекций в целом и грибковых инфекций. Такие вещества являются LPS-связывающими пептидами, содержащими эндотоксинсвязывающий домен (Hoess A., et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Кристаллическая структура исходного белка, Limulus анти-LPS фактора (LALF), обнаруживает петлю, похожую на полимиксин В, положительно заряженную, амфипатическую и содержащую экспонированные гидрофобные и ароматические остатки. Основываясь на этом принципе, он задокументировал потенциальное свойство последовательностей, соответствующих аминокислотам с 31 по 52 белка LALF, связывать и нейтрализовать эффекты гепарина, такие как анти-коагуляция, ангиогенез и ингибирование пролиферации эндотелиальных и опухолевых клеток. Однако в вышеуказанном патенте не приведено никаких экспериментальных данных, поддерживающих это утверждение. Фактически, официально принятая формула изобретения относится к приспособлению для удаления LPS из раствора, где указанное приспособление заключается в иммобилизованном на твердой подложке пептиде (US 6384188).

С другой стороны, Vallespi (US 6191114) раскрывает в своем изобретении противовирусный эффект пептида LALF_31-52 на клетках Hep-2 и MDBK, опосредованный продукцией интерферонов α и γ, также связывая свое изобретение с применением данного пептида для лечения от вирусных инфекций и болезней, связанных с подавлением иммунного ответа. Более того, тот же автор продемонстрировал противоинфекционный эффект этого пептида на животных моделях сепсиса (Vallespi M. G., et al. (2003) A Limulus anti-LPS factor-derived peptide modulates cytokine gene expression and promotes resolution of bacterial acute infection in mice. International Immunopharmacology, 3:247-256).

Существует целый ряд терапий, направленных против рака, включая химиотерапию, радио- и генную терапии. Токсичность является главнейшим недостатком всех этих способов лечения, когда высокие дозы назначаются на длительный период времени, чтобы, наконец, достичь некоего полезного эффекта лечения. Следовательно, все еще необходимо разрабатывать новые лекарственные препараты для достижения более эффективного лечения.

Исходя из незаменимой роли иммунной системы в детекции и направлении эффективного ответа против опухолей лекарственные препараты, спроектированные с целью активировать врожденные и адаптивные механизмы защиты хозяина, могут стать мощным инструментом для раковой терапии.

Ранее не было описано никаких аминокислотных замен в последовательности HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW белка LALF, элиминирующих его способность к связыванию LPS и повышающих иммуномодулирующий эффект; также предоставлены данные in vivo по противоопухолевому эффекту на нескольких опухолях.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение разрешает ранее обозначенные проблемы, предоставляя пептиды, происходящие из области 32-51 белка LALF с последовательностью HYRIKPTFRRLKWKKYKGKFW (SEQ ID NO: 13), где аминокислоты были заменены с целью удаления LPS-связывающей способности и повышения противоопухолевого и иммуномодулирующего эффекта.

Аналогичные пептиды, произведенные из указанной последовательности путем замен, препятствующих связыванию LPS или гепарина и также демонстрирующие повышенные по сравнению с исходным пептидом противоопухолевый и иммуномодулирующий эффекты, включают следующие пептиды:

HARIKPTFRRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 1);

HYRIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 2);

HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 3);

HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 4).

LPS-связывающие пептиды, описанные Hoess и Vallespi, имеют тот недостаток, что они отклоняют смешанный Th1/Th2 профиль в сторону преобладания Th2 профиля, вредного для пациентов с раковыми заболеваниями. Эти пациенты обычно демонстрируют сопутствующие инфекции вследствие иммунодепрессии, не исключая наличия частиц LPS в крови. Назначение пептида, индуцирующего преобладающий профиль Th2, в присутствии LPS, могло бы дать нежелательные эффекты, в дальнейшем ухудшая иммунологический статус пациента и ухудшая ответ хозяина на опухоль. Более того, связывание LPS пептидом, описанное Vallespi, снизило бы иммуномодулирующий эффект этого пептида.

С другой стороны, утрата пептидами способности связывать гепарин, описанная в данном изобретении, улучшает их по сравнению с ранее описанными Hoess и Vallespi. Критическим пациентам как те, что страдают от ишемической кардиопатии, цереброваскулярной болезни, венозных тромбоэмболических заболеваний (тромбозов глубоких вен и легочной эмболии) и ишемии ног, гепарин назначается в качестве лечения (D. Cabestrero Alonso, et al. (2001) Heparinas de bajo peso molecular en pacientes críticos: usos, indicaciones y tipos. Medicina Intensiva, Vol.95:18-26). Следовательно, назначение гепаринсвязывающего пептида в этих условиях будет противопоказанием вследствие противодействия с эффектом этого лекарственного препарата. Ассоциации опухолей и тромбоэмболических болезней (как тромбозов глубоких вен и легочной эмболии) являются хорошо известным феноменом, который вносит значительный вклад в осложнения и летальность у раковых пациентов. По вышеуказанным причинам доступность пептида, не способного связывать гепарин и демонстрирующего противоопухолевый и иммуномодулирующий эффекты, является преимуществом в лечении раковых больных, значительный процент этих больных обычно подвергается операциям и имеет другие заболевания, такие как гиперкоагуляция (Castelli R., et al. (2004) The heparins and cancer: Review of clinical trials and biological properties. Vascular Medicine, Vol.9:1-9).

Изобретение также охватывает пептиды с двумя и более аминокислотными заменами на аланин, включая следующие последовательности аминокислот:

HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8);

HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9);

HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10);

HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11);

HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12).

И некоторые другие гомологичные или подобные (миметические) варианты этих пептидов, полученные синтетически или с помощью процедуры рекомбинации, и как часть какого-либо слитого пептида. Гомологичные варианты относятся к какому-либо пептиду, не обладающему LPS- или гепаринсвязывающей активностью, и имеющему противоопухолевый и иммуномодулирующий эффекты. Подобным образом, указанные миметические варианты относятся к какой-либо молекуле химического происхождения (небелковой), чья структура лишена LPS- или гепаринсвязывающей способности, и сохраняет противоопухолевый и иммуномодулирующий эффекты.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, фармацевтическая композиция содержит один или более пептидов и химических соединений или их соответствующих фармацевтически пригодных солей, так же как фармацевтически пригодных носителей и вспомогательных веществ.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения фармацевтическая композиция дополнительно содержит антиген, выбранный из группы, состоящей из бактериальных, вирусных или раковых антигенов.

Схожим образом пептиды данного изобретения могут применяться в комбинации с общепринятыми методами лечения рака, такими как химиотерапия, хирургическое вмешательство, радиотерапия, и так далее.

Данное изобретение также охватывает применение этих пептидов и химических веществ для приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики иммунологических заболеваний, требующих эффективного иммунного ответа по типу Th1; лечения или предотвращения рака и развития эффективного иммунного ответа против инфекций бактериального или вирусного происхождения.

Описанные пептиды были охарактеризованы как лишенные LPS-связывающей активности, вместо оригинальной последовательности HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW, ранее описанной как оптимальный консенсусный домен для связывания LPS (Hoess et al., (1993) Crystal structure of an endotoxin-neutralizing protein from the horseshoe crab, Limulus anti-LPS factor, at 1.5A° resolution. The EMBO J. 12:3351-3356). Точно так же, пептиды, описанные в данном изобретении, повышают иммуномодулирующий эффект, опосредованный секрецией IFN-α, по сравнению с пептидом, происходящим из белка LALF, содержащим аминокислоты с 31 по 51, который Vallespi указала в своем патенте (US 6191114) как противоопухолевый и иммуномодулирующий пептид.

Подобным образом пептиды, описанные в изобретении, могут быть назначены пациентам с иммуносуппрессией и тем, кому требуется активация иммунного статуса, как пациентам, страдающим от синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и пациентам, подверженным комплексу хирургических операций.

Экспериментальные данные in vivo демонстрируют эффективность аналогичных пептидов в модели имплантации опухоли в мышь, где опухоль происходит из клеток мышиной меланомы В16; злокачественных эпителиальных клеток легкого мышей С57Bl/6 и клеток 3LL-D122, полученных из рака легкого мышей.

В другом варианте исполнения пептиды могут быть назначены с целью снижения частоты метастаз.

Другие результаты данного изобретения выявляют, что описанные пептиды показывают антипролиферативный эффект на опухолевые клеточные линии различного гистологического происхождения, демонстрируя прямой цитотоксический эффект на раковые клетки.

В принципе, описанные пептиды могут применяться как независимо, так и в комбинации с текущими терапиями рака, как хирургическое вмешательство, радио- или химиотерапия.

Схожим образом пептиды, описанные в данном изобретении, в случае профилактического назначения инициируют ответ врожденного иммунитета против опухоли, в дальнейшем развитие адаптивного антиген-специфического ответа, что подчеркивает их полезность в качестве профилактической или терапевтической вакцины против рака.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Эффект способности пептидов к связыванию бактериального липополисахарида (LPS). Фигура 1А. Эти эксперименты проведены в трех повторностях; показаны кривые ингибирования из одного эксперимента. Процентное отношение ингибирования, показанное на Фигуре 1В, представлено по значениям трех независимых экспериментов.

Фигура 2. Эффект способности пептидов к связыванию анионной составляющей гепарина. Показано значение трех независимых экспериментов.

Фигура 3. Эффект пептидов на продукцию интерферонов α и γ и IL-12 в моноядерных клетках человека. Три эксперимента были проведены с материалом разных доноров, показаны результаты одного из них.

Фигура 4. Противоопухолевый эффект пептидов в раковой модели ТС-1.

Фигура 5. Противоопухолевый эффект пептида L-2 в модели меланомы.

Фигура 6. Противоопухолевый эффект аналогичного пептида L-2 в профилактической схеме приема в раковой модели ТС-1.

Фигура 7. Противоопухолевый эффект аналогичного пептида L-2 в схеме приема с двойной стимуляцией в раковой модели ТС-1.

Фигура 8. Противометастатические свойства аналогичного пептида L-2.

Фигура 9. Эффект аналогичного пептида L-2 на пролиферацию ТС-1, Н125 и L929 клеток.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез пептидов

Пептиды изобретения получены твердофазным синтезом. Неочищенный пептид экстрагируется 30% раствором уксусной кислоты, лиофилизуется и далее очищается с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC). Молекулярный вес пептидов проверен с применением масс-спектрометра EOL JMS-HX110HF с бомбардировкой ускоренными атомами. Полученный препарат не антигенный, не пирогенный и фармацевтически пригоден для назначения животным и людям. Замены были получены введением аминокислоты аланина в каждую позицию исходной последовательности пептида HYRIKPTFRRLKWKYKGKFW.

Пример 2. Отбор аналогов пептида, не обладающих липополисахарид (LPS)-связывающей активностью.

Этот опыт основан на системе конкурентного ИФА (Hardy E., et al. (1994) Enhanced ELISA sensitivity using TCA for efficient coating of biologically active LPS or Lipid A to the solid phase. J. Immunol. Meth. Vol.176:111-116). Полистироловые планшеты (Costar, USA) были покрыты LPS из E.coli 0111:B4 (1 мкг/мл) с 0,2% трихлоруксусной кислотой (ТСА). Планшеты инкубировались при 37°С в течение ночи и далее промывались десять раз 1Х фосфатно-солевым буфером (1XPBS) с 0,1% tween-20 (отмывочный раствор). Связывание аналогичных пептидов с LPS, фиксированным на твердой поверхности, оценивалось конкурентным ИФА с биотинилированным пептидом LALF_32-51 в концентрации 0,2 мкM, с получением 90% максимального связывания LPS. Для построения кривых ингибирования использовались различные концентрации аналогичных пептидов, от 10 мкM до 0,01 мкM, и кривой пептида LALF_32-51 как опытного контроля. Биотинилированный пептид LALF_32-51 инкубировался в присутствии аналогичных пептидов в течение 2 часов при 37°С, затем планшеты были промыты 5 раз отмывочным раствором. Связанный с LPS биотинилированный пептид LALF_32-51 детектировался инкубацией в течение 45 мин при 37°С с стрептавидин-пероксидазным конъюгатом в разведении 1:2000. Планшеты были промыты 5 раз отмывочным раствором, и добавлялся раствор субстрата (0,05 М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,5, 1 таблетка 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и 0,025% перекись водорода). Через 15 мин инкубации, реакция была остановлена добавлением 2 М серной кислоты. Поглощение измерялось на 450 нм на спектрофотометре для прочтения планшетов (Sensident Sсan). Наблюдается корреляция между значением оптической плотности и LPS-связывающей активностью аналогичных пептидов. Аналогичные пептиды с более высокой LPS-связывающей активностью демонстрируют кривые ингибирования более низкого OD, по сравнению с кривой ингибирования пептида LALF_32-51.

Аналогичные пептиды с более низкой LPS-связывающей активностью имеют кривые ингибирования со значениями OD, сравнимыми с кривой ингибирования пептида LALF_32-51. Результаты, показанные на фигуре 1А, демонстрируют, что пептиды, названные L-2, L-8, L-12 и L-20, теряют способность к связыванию LPS, тогда как пептиды L-9 и L-19 сохраняют эту способность, схожую с пептидом LALF_32-51. С другой стороны, пептид L-3 демонстрирует более высокую способность к связыванию LPS.

На фигуре 1В представлены процентные отношения ингибирования аналогичных пептидов, при концентрации 0,5 М, согласно их способности замещать биотинилированный LALF_32-51 (0,2 мкM), связанный с LPS, фиксированным на твердой поверхности.

% ингибирования = {1- (([O.D.]_{образец} - [O.D.]_min) / ([O.D.]_max- [O.D.]_min))} ×100

[O.D.]_{образец}: значение оптической плотности в присутствии фиксированной концентрации аналогичного пептида;

[O.D.]_min: фон ИФА;

[O.D.]_maх: значение оптической плотности в отсутствие аналогичного пептида.

Последовательности пептидов приведены в таблице.

Последовательности пептидов, использованных в примерах Пептид Аминокислотная последовательность L-2 ₃₂HARIKPTFRRLKWKYKGKFW₅₁ (SEQ. ID. NO: 1) L-3 ₃₂HYAIKPTFRRLKWKYKGKFW₅₁ (SEQ. ID. NO: 5) L-8 ₃₂HYRIKPTARRLKWKYKGKFW₅₁ (SEQ. ID. NO: 2) L-9 ₃₂HYRIKPTFARLKWKYKGKFW₅₁ (SEQ. ID. NO: 6) L-12 ₃₂HYRIKPTFRRLAWKYKGKFW₅₁ (SEQ. ID. NO: 3) L-19 ₃₂HYRIKPTFRRLKWKYKGKAW₅₁ (SEQ. ID. NO: 7) L-20 ₃₂HYRIKPTFRRLKWKYKGKFA ₅₁ (SEQ. ID. NO: 4)

В результате этих анализов были произведены двойные, тройные и четверные мутации, начиная с пептидов, не обладающих LPS-связывающей активностью:

HYRIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 8);

HARIKPTARRLKWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 9);

HARIKPTFRRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 10);

HARIKPTARRLAWKYKGKFW (SEQ. ID. NO: 11);

HARIKPTARRLAWKYKGKFA (SEQ. ID. NO: 12).

Пример 3. Оценка способности аналогичных пептидов L-2, L-8, L-12 и L-20 к связыванию гепарина.

Этот эксперимент основан на системе конкурентного ИФА, подобно описанному предыдущему. Биотинилированный LALF_32-51 был адсорбирован на полистироловые планшеты (Costar, USA) в 1ХPBS и инкубировался в течение ночи при 37°С. Аналогичные пептиды L-2, L-8, L-12 и L-20 были смешаны в концентрации 2 мкM с 250 единицами гепарина (Sodic Heparin, 5000 U/mL, Liorad) в 1ХPBS плюс 0,1% бычий сывороточный альбумин (BSA). После этого смеси были добавлены в ИФА планшеты, содержащие 0,02 мкM биотинилированного пептида LALF_32-51, фиксированного на твердой поверхности. Через 1 час инкубации при комнатной температуре, планшеты были промыты 5 раз отмывочным раствором и биотинилированный пептид LALF_32-51, фиксированный на твердой поверхности, детектировался инкубацией в течение 45 мин при 37°С с стрептавидин-пероксидазным конъюгатом в разведении 1:2000. После этого, планшеты были промыты 5 раз отмывочным раствором, и добавлен раствор субстрата. После дополнительной инкубации в течение 15 мин реакция была остановлена добавлением раствора 2 М серной кислоты. Утрата связывания гепарина аналогичными пептидами коррелирует со сниженной оптической плотностью, так как они не способны вытеснять гепарин, связанный с биотинилированным пептидом LALF_32-51, фиксированным на твердой поверхности. Немеченый пептид LALF_32-51 в 100-кратном молярном избытке использовался в эксперименте в качестве контроля. Связывание гепарина с немеченым пептидом LALF_32-51 проявляется в повышенных значениях оптической плотности, так как избыток немеченого пептида конкурирует за связывание с гепарином. Как показано на фигуре 2, результаты выявляют, что пептиды L-2, L-8, L-12 и L-20, описанные в данном изобретении, не способны связывать гепарин.

Пример 4. Эффект аналогичных пептидов L-2, L-8, L-12 и L-20 на экспрессию IFN-α, IFN-γ и IL-12 в человеческих мононуклеарных клетках.

Для этого эксперимента мононуклеарные клетки человека были выделены градиентом фиколл-пака из концентрата лейкоцитов или лейкоцитной пленки донора. До 5×10⁶ клеток были высеяны в 24-луночные планшеты в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой. Каждый пептид затем добавлялся в концентрации 40 мкг/мл в объеме 0,1 мл среды RPMI, и клетки инкубировались в течение 18 часов при 37°С и 5% СО₂. Суммарная РНК была выделена с применением TriReagent. После этого экспрессия генов IFN-α, IFN-γ и IL-12 определялась методом обратной транскрипции и ПЦР-амплификации (RT-PCR Kit, Perkin Elmer). Результаты представлены как относительное количество информационной РНК, нормализованное по уровню экспрессии конститутивного гена β-актина. Результаты, полученные в этом эксперименте, продемонстрировали, что пептиды L-2, L-8, L-12 и L-20, описанные в данном изобретении, способны индуцировать экспрессию генов IFN-α, IFN-γ и IL-12, как показано на фигуре 3А. Аналогичные пептиды L-2, L-8 и L-12, в частности, более эффективны как индукторы экспрессии гена IFN-γ, чем пептид LALF_32-51, как показано на фигуре 3В. Этот пример демонстрирует, что аминокислотные замены в оригинальной LALF_32-51 последовательности элиминируют способность связывать LPS, впоследствии повышая иммуномодулирующий эффект полученного пептида.

Пример 5. Противоопухолевый эффект аналогичных пептидов L-2, L-8, L-12 и L-20 в раковой модели ТС-1.

Для этого эксперимента использовались самки C57Bl/6 мышей восьми- десятинедельного возраста (n=10 животных на экспериментальную группу). В качестве опухолевого трансплантанта использовались ТС-1 раковые клетки, происходящие из C57Bl/6 злокачественных эпителиальных клеток легкого, ресуспендированные в фосфатно-солевом буфере (PBS). Клетки в количестве 50000 в объеме 200 мкл были введены в мышь подкожно в правую заднюю конечность. Первое введение пептида было осуществлено подкожно в правый бок, когда опухоль достигла объема 100 мм², и второе проведено через 10 дней. В этом опыте оценивалась весовая доза в 4 мг на кг (80 мкг/мышь). Для измерения противоопухолевого эффекта интересующего пептида оценивались выживаемость животных и масса опухоли, как показано на фигурах 4А и 4В. Аналогичные пептиды L-2, L-8, L-12 и L-20 оказались эффективными для ингибирования прогрессии опухоли и продления жизни мыши, соответственно. Эти результаты свидетельствуют о противоопухолевой эффективности аналогичных пептидов в модели твердой опухоли мышей. Метод логарифмического рангового критерия был использован как статистический анализ для выявления значимой разницы между группами. Результаты доказывают, что аналогичные пептиды L-2, L-8, L-12 и L-20 значительно повышают выживаемость животных по сравнению с пептидом LALF_32-51 (р<0,05). Эти результаты демонстрируют, что замены аминокислот в оригинальной последовательности 32-51 белка LALF могут значительно повысить противоопухолевые свойства пептида.

Пример 6. Противоопухолевый эффект аналогичного пептида L-2 в модели меланомы.

Для этого эксперимента использовались самки C57Bl/6 мышей восьми- десятинедельного возраста (n=10 животных на экспериментальную группу). В качестве опухолевого трансплантанта использовались раковые клетки MB16-F10, ресуспендированные в фосфатно-солевом буфере (PBS). Клетки в количестве 15000 в объеме 200 мкл были введены в мышь подкожно в правую заднюю конечность. Через 4 дня был введен пептид L-2, вторая инъекция проведена через 7 дней после первой, и третья - через 14 дней. В этом опыте оценивалась доза в 4 мг пептида на кг веса животного. Для измерения противоопухолевого эффекта данного пептида в течение эксперимента оценивались параметры опухолевой трансплантации и выживаемости животных. Как показано на фигуре 5А, аналогичный пептид L-2 значительно задерживает трансплантацию опухоли (р<0,05, метод логарифмического рангового критерия). Анализ выживаемости по методу логарифмического рангового критерия продемонстрировал, что пептид L-2 значительно повышает выживаемость животных (р<0,05), будучи более эффективным, чем пептид LALF_32-51, как показано на фигуре 5В. Эти результаты свидетельствуют о противоопухолевой эффективности пептида L-2 не только против эпителиальных опухолевых клеток легкого, но также против опухолевых клеток из других гистологических и анатомических частей тела, как меланома.

Пример 7. Противоопухолевый эффект аналогичного пептида L-2 по профилактической схеме приема в раковой модели ТС-1.

Для этого эксперимента использовались самки C57Bl/6 мышей восьми- десятинедельного возраста (n=10 животных на экспериментальную группу). В качестве опухолевого трансплантанта использовались ТС-1 раковые клетки, ресуспендированные в фосфатно-солевом буфере (PBS). Сначала мыши были инъецированы пептидом L-2 (4 мг пептида/кг веса тела). Через 7 дней они получили вторую инъекцию той же дозы; через 14 дней после первой инъекции пептида в животных были введены клетки в количестве 50000 в объеме 200 мкл, подкожно в правую заднюю конечность. Параметры, определяемые для измерения противоопухолевого эффекта пептида, включали время трансплантации опухоли (фигура 6А) и выживаемость животных (фигура 6В). Результаты, полученные в этом эксперименте, продемонстрировали, что пептид L-2 данного изобретения оказался эффективен для предотвращения развития опухоли, и также повысил выживаемость животных. Эти результаты свидетельствуют о том, что пептид данного изобретения проявляет профилактический эффект, предотвращающий образование опухоли.

Пример 8. Противоопухолевый эффект аналогичного пептида L-2 в схеме приема с двойной стимуляцией.

Животные без образовавшихся опухолей по схеме приема предыдущего примера (n=6) были затем стимулированы во второй раз клетками ТС-1 (50000 в объеме 200 мкл в PBS) подкожно в левую заднюю конечность (49 день после первой стимуляции). То же количество раковых клеток было введено в «нативных» мышей того же помета, в качестве контрольной группы эксперимента, чтобы гарантировать гомогенность по возрасту, и содержались в тех же условиях без получения пептида (n=10). Параметры, определяемые для измерения противоопухолевого эффекта пептида L-2, включали время трансплантации опухоли и выживаемость животных. Результаты, полученные в этом эксперименте, продемонстрировали, что пептид L-2 способен защитить мышей от повторной стимуляции раковыми клетками, замедляя возникновение опухоли (фигура 7А) и повышая выживаемость животных (фигура 7В). Эти результаты свидетельствуют, что пептид изобретения способен индуцировать поддерживающийся противоопухолевый ответ будучи функциональным против повторного введения раковых клеток, подтверждая развитие антиген - специфичного адаптивного иммунного ответа.

Пример 9. Противоопухолевый эффект аналогичного пептида L-2 в модели метастаз карциномы Льюиса.

Для этого эксперимента использовались самки C57Bl/6 мышей восьми-десяти недельного возраста (n=8 животных на экспериментальную группу). Эти животные были привиты в подушечки задней правой лапы 250000 мышиными клетками легочного рака 3LLD122. Через 7 дней была подкожно инъецирована доза 4 мг/кг веса тела аналогичного пептида L-2. Когда опухоли достигли 8 мм в диаметре, первичная опухоль была хирургически изъята из больной лапы. Мыши были умерщвлены через 21 день после этой операции. Легкие были взвешены для определения в них количества метастаз. Результаты, показанные на фигуре 8, демонстрируют, что аналогичный пептид L-2 данного изобретения способен снизить частоту метастаз.

Пример 10. Влияние аналогичного пептида L-2 на рост опухолевых клеток.

Для этого эксперимента ТС-1, Н-125 (клетки немелкоклеточного рака легкого человека) и L929 (мышиные фибробласты) были высеяны в 96-луночные культуральные планшеты (Costar) в концентрации 2×10⁴ клеток/мл в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) (Gibco), дополненной плодной телячьей сывороткой (Gibco). Через 24 часа пептиды были добавлены в культуру в концентрации в промежутке от 9 мкM до 300 мкM. Планшеты инкубировались 72 часа при 5% СО₂, и после этого образцы были проявлены красителем кристаллическим фиолетовым. Планшеты были интенсивно промыты водопроводной водой и прочитаны при 562 нм. Результаты показаны на фигуре 9. Проапоптотический пептид с известным антипролиферативным эффектом in vitro применялся в качестве положительного контроля (Perea, S., et al. (2004) Antitumor Effect of a Novel Proapoptotic Peptide that Impairs the Phosphorylation by the Protein Kinase 2 Cancer Research 64: 7127-7129). Полученные результаты показали, что пептид L-2 оказывает дозозависимый антипролиферативный эффект на клетки ТС-1 и Н-125. Однако, никакого эффекта пептида данного изобретения в мышиной линии фибробластов L929 не наблюдалось. Этот результат демонстрирует, что пептид данного изобретения проявляет селективный цитотоксический эффект in vitro на опухолевые клетки.

Изобретение относится к созданию пептидов, происходящих из области 32-51 белка LALF, лишенных способности к связыванию LPS и гепарина, и усиливающих противоопухолевый и иммуномодулирующий эффект. Указанные пептиды и их комбинации могут применяться в лечении рака, так же как и в сочетании с другими стандартными терапиями. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 1 табл.

1. Пептид с противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами, происходящий из области 32-51 белка LALF, лишенный способности к связыванию LPS и гепарина, и состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ. ID. NO: 1-4 и 8-12.

2. Фармацевтическая композиция с противоопухолевой действием и стимулирующая иммунный ответ, включающая один или более пептидов по п.1, и также содержащая вспомогательные средства или фармацевтически приемлемые носители.

3. Фармацевтическая композиция по п.2, где указанная композиция дополнительно содержит антиген.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где указанный антиген представляет собой противораковый антиген.

5. Применение пептида по п.1 для производства фармацевтической композиции для лечения и предотвращения иммунологических заболеваний и рака.

6. Применение пептида по п.1 для производства фармацевтической композиции для ингибирования метастаз.