ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК A61K38/21 A61P37/04 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым лекарственным формам цитокинов и способам их получения. В качестве цитокинов в предлагаемом изобретении используют интерфероны. Новые лекарственные формы обладают длительным сроком хранения без потери своей биологической активности, пригодны в качестве готового лекарственного средства (ГЛС) для использования в медицине, ветеринарии и смежных областях.

Преимуществом заявляемой формы ГЛС является то, что таблетки могут содержать в десятки раз меньше действующего цитокина, чем в известных лекформах, но за счет своей композиции и плотности таблеток, а также способа их получения вызывают при лечении эффект, соизмеримый с большими дозами действующего начала.

Этот эффект объясняется тем, что цитокины равномерно распределены внутри структуры таблетки и выделяются во времени в процессе употребления, оказывая пролонгированное активирующее воздействие на иммунокомпетентные клетки.

Способ получения лекарственного средства заключается в смешивании используемого цитокина со смесью лактозы, свекловичного сахара, водорастворимого поливинилпирролидона (коллидона 90 F) и натрия бензоата в строго подобранных соотношениях. При помещении полученной смеси в матрицу и таблетировании путем влажного гранулирования с последующим прессованием в таблеточной машине при температуре не выше 25°С и давлении 120-160 мн/м² получают таблетки для мукозального использования.

В настоящее время большинство цитокинов, таких как интерфероны, интерлейкины, выпускают в ампулах, содержащих раствор или сухой препарат, предназначенный для внутривенного или внутримышечного введения. Однако данная форма введения достаточно неудобна в повседневной практике при назначении длительных курсов лечения, что ставит вопрос о необходимости разработки других форм применения препаратов, в частности использования аэрозолей, свечей или таблеток, содержащих цитокины.

Так, известен препарат интерферона в мазевой лекарственной форме [пат. РФ №2147440, 2000]. Однако он не является достаточно эффективным для стимуляции иммунитета, т.к. предназначен для аппликаций на кожу или на слизистую оболочку носовой полости, но для аппликаций на слизистую оболочку ротовой полости и глотки с расположенными непосредственно под ней иммунными органами (подъязычные небные и глоточные миндалины, представляющие собой большие скопления лимфатических узлов) он мало пригоден. Препарат требует хранения при минусовой температуре ((-10) - (-5)°С), но с течением времени из-за мазевого состава идет инактивация лекформы.

Известны также препараты для ректального введения, содержащие смесь интерферона и антиоксиданта - альфа-токоферола ацетата [пат. РФ 2057544, 1996]. Недостатком является не всегда удобная форма использования лекарственного средства. Известны аэрозоли, содержащие смесь биологически активных пептидов, декстранов и буферных растворов [пат. РФ 2095081, 1997]. Недостатком аэрозольного введения является то, что на лечение идет большая доза препарата.

Наиболее удобной формой применения являются таблетки для перорального применения, однако в процессе использования в качестве активного начала цитокинов идут большие дозы препарата, а в процессе получения ГЛС последние, как правило, теряют значительную часть активности в ходе таблетирования и хранения, что ограничивает спектр применения цитокинов.

Известно, что в настоящее время для получения сухих биопрепаратов в виде таблеток используют, в основном, методы прессования, что связано с большой производительностью и относительно низкой себестоимостью [Технология лекарственных форм. / Под ред. Л.А.Ивановой, М.: Медицина, т.2, с.134]. Процесс включает в себя получение действующего биоагента, его сублимационное обезвоживание и измельчение, смешивание активного начала со вспомогательными веществами (наполнителями, разрыхлителями, связующими веществами и т.д.), увлажнение и гранулирование полученной смеси, и прессование таблеток под давлением 25-250 мПа.

К недостаткам данного способа следует отнести его многостадийность, а также значительную инактивацию активного начала.

Прототипом заявляемого лекарственного средства и способа его получения является пептидсодержащий таблетированный препарат для сублингвального введения, в котором в качестве пептида может быть использован интерферон, инсулин, интерлейкин, и технология его получения [патент РФ 2210381, 2003].

В основе указанного патента лежит получение таблеток с помощью модифицированного тритурационного способа, используемого для получения таблеток нитроглицерина и т.п. особо опасных химических препаратов. Указанный метод позволяет проводить процесс приготовления готовой лекарственной формы в наиболее щадящем режиме, сохраняя биологическую активность входящих в нее ингредиентов.

Особенностью применяемой технологии получения таблетки является введение в смесь биологически активных пептидов с сахарозой смеси полиглюкина, желатина и порошка какао с аскорбиновой кислотой и проведения сушки помещенного в матрицы биоматериала методом сублимационного высушивания при температуре от -25 до -35°С и давлении 8-15 Па в течение, по крайней мере, 48 часов. Полученный в результате сублимационного обезвоживания сухой биопрепарат (таблетки) извлекают из матриц и подвергают биологическому тестированию. Получена рыхлая сухая таблетка, обладающая повышенной пористостью, обеспечивающей ее растворение в ротовой полости человека в течение не более 30 сек с последующим всасыванием действующего начала через слизистую рта, что позволяет использовать ее в качестве сублингвального лекарственного препарата.

Недостатками препарата являются 1) быстрое растворение таблетки в ротовой полости человека (в течение не более 30 сек), в ходе которого она не успевает оказать иммуностимулирующее действие на иммунокомпетентные клетки слизистой оболочки и миндалины; 2) отсутствие способности индуцировать состояние неспецифической резистентности в клетках слизистой оболочки; 3) высокая концентрация интерферона (3 млн ME на таблетку).

Недостатком способа получения препарата является дорогостоящий способ его производства.

Одной из наиболее перспективных форм введения цитокинсодержащих препаратов представляется мукозальное введение (через слизистую ротовой полости при рассасывании) препаратов в виде твердых, плотных лекарственных форм пролонгированного действия, в ходе которого они могут оказывать иммуностимулирующее действие на иммунокомпетентные клетки слизистой оболочки ротовой полости и на лимфоциты, находящиеся в иммунных органах - миндалинах, а также способны индуцировать состояние неспецифической резистентности в клетках слизистой оболочки.

Задачей данного изобретения являлось создание именно такой лекарственной формы. Были созданы таблетки, которые при рассасывании высвобождали действующее биологически активное вещество, обладали стабильностью формы и длительным сроком хранения.

Сущностью данного изобретения является строго подобранная композиция составляющих для таблеток мукозального введения, ранее не применявшаяся в сочетании с интерферонами. Именно такая композиция способна сформоваться в структуру, внутри которой равномерно распределено действующее начало - интерферон.

Способ формования подобранной смеси в ГЛС (т.е. таблетки, соответствующие требованиям к таблеткам, стабильные по форме и содержанию) был разработан исходя из свойств как наполнителей (носителей), так и интерферонов. По предлагаемому способу исключены лиофильная сушка, многоступенчатость обработки смеси для таблетирования, которые имеются в прототипе.

Известна работа [Цитокины в терапии рака. // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т.1, №3. - С.27-30], свидетельствующая о том, что цитокинсодержащие препараты оказывают иммуностимулирующее действие во много раз сильнее при их локальном применении в виде аппликаций, чем при инъекционном пути введения. Причем при таком пути введения цитокинсодержащие препараты могут оказывать иммуностимулирующее действие на животных, чего не наблюдается при инъекционном введении цитокинов человека.

Препараты цитокинов пролонгированного действия отличаются от других препаратов на основе цитокинов тем, что они позволяют интерферонам (ИФН) и другим цитокинам максимально проявить свое иммуностимулирующее действие. Это происходит благодаря особенностям состава этих препаратов, обеспечивающего пролонгированное высвобождение и действие цитокинов, а также способу их использования - в области поверхности слизистых оболочек, в которых содержится большое количество иммунокомпетентных клеток и лимфоцитов. При нанесении на слизистые оболочки легко достигается контакт цитокинов с отростками дендритных клеток и с эпителиальными клетками. Именно контакт с этими клетками и обеспечивает высокий иммуностимулирующий эффект препаратов местно-резорбтивного действия для мукозального применения. Кроме этого, препараты цитокинов пролонгированного действия отличаются от других цитокинсодержащих препаратов тем, что они содержат цитокины в небольших дозах, что является достаточным для стимуляции иммунитета при использовании такого типа препаратов, при этом они практически лишены побочных эффектов.

В области ротовой полости и лимфоидного глоточного кольца находятся также большие скопления лимфатических узлов, сосредоточенных в миндалинах, являющихся одними из самых важных иммунных органов человека и связанных со всей иммунной системой.

В связи с этим препараты пролонгированного местно-резорбтивного действия на основе ИФН и других цитокинов, обладающих иммуностимулирующим действием, предназначаются для использования в области ротовой полости и лимфоидного глоточного кольца, где находится большое количество как иммунокомпетентных клеток (слизистые оболочки), так и лимфоцитов (миндалины). ИФН способны активировать их, благодаря чему происходит стимуляция иммунитета и осуществляется удаление инфицированного материала, при этом болезнь может вообще не развиться [Новые препараты на основе интерферонов против вирусов гриппа, включая A (H5N1). // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т.6, №3. - С.20-26].

При включении в состав таблетки цитокинов приходится одновременно решать несколько задач:

- сохранить возможность мукозального применения таблетки;

- обеспечить равномерное высвобождение цитокинов из таблетки в течение не менее 20-25 минут;

- сохранить активность цитокинов как в процессе производства, так и при хранении таблеток в условиях их активного контакта с кислородом или влагой внешней среды;

- придать приятные органолептические свойства.

В изобретении разработана рецептура биопрепарата на основе цитокинов, обеспечивающая стабильность пространственной конфигурации цитокинов и тем самым предупреждающая их инактивацию, а также обеспечивающая их медленное и равномерное высвобождение.

В отличие от прототипа - пептидсодержащего таблетированного препарата для сублингвального введения, обладающего рыхлой структурой и благодаря этому высокой скоростью растворения, заявляемое готовое лекарственное средство обладает твердой консистенцией, медленно растворяется, постепенно высвобождая из своих слоев интерфероны и тем самым обеспечивая их пролонгированное иммуностимулирующее действие.

При создании заявляемого иммуностимулирующего лекарственного средства проверено много разных вариантов его состава с разным временем высвобождения цитокинов. Однако только предлагаемый состав обладает равномерным высвобождением ИФН из своих слоев в течение не менее 20-25 минут, что является достаточным для проявления выраженного иммуностимулирующего действия. ИФН в готовом лекарственном средстве сохранялся не менее 8 месяцев при температуре от 4 до 10°С.

Созданный в результате изобретения состав представляет собой смесь углеводов (молочный сахар - лактоза и свекловичный сахар - сахароза), синтетический полимер -водорастворимый поливинилпирролидон (1000000-1500000), имеющий название коллидон 90 F, антифрикционное вещество - натрия бензоат и цитокин - один из интерферонов (ИФН) в количестве 1,0·10³-1,0·10⁶ ME на таблетку. Соотношение ингредиентов следующее (мас.%):

Лактоза - 14-94

Свекловичный сахар - 2-82

Коллидон 90 F - 1-10

Натрия бензоат - 0,1-3

Интерферон - остальное

Свекловичный сахар выбран в связи с тем, что содержит в составе сахарозу и дополнительно другие сахара и красители, позволяющие сохранять структуру и биологическую активность интерферона.

Создавая мукозальные таблетки, подбирали углеводы, которые давали твердые плотные, медленно растворяющиеся таблетки, в которых в структуре носителей (наполнителей) равномерно распределено действующее биологически активное вещество - цитокин. В качестве наполнителей для таблеток с интерфероном (ИФН) были выбраны сахар свекловичный и лактоза, обладающие хорошими технологическими характеристиками. Подобранная композиция этих углеводов за счет строения молекул компонентов является стабилизатором цитокинов, кроме своей функции наполнителя. В качестве антифрикционного вещества в состав таблеток с ИФН был включен натрия бензоат.

С целью получения таблеток с равномерным распределением цитокинов был использован метод влажного гранулирования, где в качестве связующего компонента использовался водорастворимый синтетический полимер - поливинилпирролидон (ПВП). Анализ активности цитокинов в полученных таблетках на примере ИФН показал, что ИФН распределен равномерно.

Таблетки, полученные методом влажного гранулирования с ПВП, распадались в течение 12-14 мин, что являлось недостаточным для проявления необходимого фармакологического эффекта мукозальных таблеток.

Для достижения нужного времени растворения в состав гранулята вводили более высокомолекулярные полимеры - растворимые производные ПВП:

- Коллидон 12 PF (2000-3000);

- Коллидон 17 PF (7000-11000);

- Коллидон 25 (28000-34000);

- Коллидон 30 (44000-54000);

- Коллидон 90 F (1000000-1500000);

- Коллидон VA 64 (45000-70000).

Увеличение времени растворения таблеток удалось обеспечить введением в состав современного высокоэффективного вспомогательного вещества, выпускаемого фирмой BASF под торговым названием коллидон 90 F. Порошок коллидона 90 F вводили в состав смеси в качестве связующего вещества, а увлажнителем был водный раствор цитокина, в частности ИФН, в концентрации от 2,5·10⁵ до 2,5·10⁷ ME.

Техническое решение данной задачи было найдено на основе получения таблеток с помощью модифицированного способа влажного гранулирования и прессования полученного гранулята.

Указанный способ позволяет проводить процесс приготовления готовой лекарственной формы в наиболее щадящем режиме, сохраняя биологическую активность входящих в нее ингредиентов.

Причем было показано, что только гранулят, содержащий композицию заявленного готового лекарственного средства имеет высокое значение прессуемости, удовлетворяющее технологическим требованиям, что способствовало получению таблеток, обладающих высокими фармацевтическими качествами.

Таким способом удалось сформировать под прессом таблетки, которые удовлетворяли требованиям к мукозальным таблеткам.

При производстве готового лекарственного средства температура окружающей среды и оборудования не должна превышать 25°С, а затрачиваемое время не должно превышать 4 часов.

Исследование физико-химических и технологических свойств гранулята с ИФН.

При получении таблетной смеси с ИФН методом влажного гранулирования сахара измельчали, смешивали, тщательно перемешивали с коллидоном 90 F. Полученную смесь в два приема увлажняли водным раствором ИФН при интенсивном перемешивании для более равномерного распределения ИФН в смеси порошков.

Влажную массу протирали через сито-гранулятор с диаметром отверстий 3-4 мм.

Сушку влажных гранул проводили в полочной сушилке при температуре 37-40°С. Полученные сухие гранулы протирали вручную через сито-гранулятор с диаметром отверстий 1-2 мм для получения однородных по размеру гранул, к которым затем добавляли натрия бензоат.

Полученную таблетную смесь исследовали на фракционный состав, насыпную массу, плотность, пористость, прессуемость.

1. Средние результаты определения фракционного состава гранулята представлены в таблице 1 и на фиг.1.

Таблица 1 Фракционный состав гранулята с интерфероном. № п/п Фракция, мм Содержание частиц, % Средний геометрический диаметр частиц узкой фракции, мм 1 0,10-0,25 5,8 0,158 2 0,25-0,50 12,3 0,354 3 0,50-1,00 23,4 0,707 4 1,00-2,00 54,1 1,410 5 2,00-3,00 4,4 2,450

Средний размер гранул фракции определяли по формуле:

, мм.

Тогда средний геометрический диаметр узкой фракции составил:

,

,

,

,

Средний размер гранул определяли по формуле:

где x_i - весовая доля узкой фракции.

d_cp=0,680 мм=680 мкм.

На фиг.1 представлена гистограмма и дифференциальная кривая распределения гранулята с интерфероном по размерам. Из рисунка видно, что распределение частиц по размерам является ассиметричным со смещением в область более крупных частиц (1,0-2,5 мм), что соответствует оптимальному распределению.

2. Среднее значение насыпной массы гранулята составило 610 кг/м³.

3. Истинную плотность гранулята рассчитывали по формуле:

где G - вес порошкообразного материала (таблетки), кг;

G=7×10^-4 кг - навеска порошка;

V - объем порошкообразного материала (таблетки), м³

где π=3,14;

D=12×10^-3 м - диаметр таблетки;

Н - высота таблетки, м.

Среднее значение высоты таблетки 4,1 мм. Тогда истинная плотность составила:

4. Относительную плотность рассчитывали по формуле:

где τ - относительная плотность, %;

Кн - насыпная масса, кг/м³.

Получили:

5. Пористость рассчитывали по формуле:

6. Сыпучесть гранулята определяли с использованием вибрационного устройства ВП-12А. Сыпучесть рассчитывали по формуле:

где V_c - сыпучесть, кг/с;

m - масса навески, кг;

t - полное время опыта, с;

20 - время утряски, с.

Среднее время полного опыта истечения навески гранулята массой в 50 г, полученное из 3-х определений, составило 25 сек. Тогда:

Т.о., в ходе экспериментов было установлено, что полученный гранулят обладает хорошей сыпучестью, что характерно для гранулированных крупнодисперсных систем.

7. Прессуемость гранулята. Полученные модельные таблетки массой 0,3 г и диаметром 9 мм при давлении прессования 120 мн/м² проверяли на прочность на приборе «Erweka». Среднее значение прессуемости составило 12 кг. Это свидетельствует о том, что гранулят имеет высокое значение прессуемости, удовлетворяющее технологическим требованиям.

Результаты исследований физико-химических и технологических свойств гранулята представлены в таблице 2.

Таблица 2 Физико-химические и технологические свойства гранулята с интерфероном № п/п Показатель Единицы измерения Значение 1 Насыпная масса кг/м³ 610 2 Истинная плотность кг/м³ 1488 3 Относительная плотность % 41 4 Сыпучесть кг/с 2×10^-3 5 Пористость % 59 6 Прессуемость кг 12

Т.о., полученные результаты исследований показали, что гранулят имеет достаточную для обеспечения технологического процесса прессуемость и сыпучесть. Средний размер гранул составил 680 мкм, что соответствует оптимальному размеру гранул таблетной смеси - от 600 до 650 мкм. Полученный гранулят обладает оптимальными характеристиками, которые позволяют обеспечивать равномерную скорость поступления таблетной смеси в матрицу таблеточной машины, высокую точность дозирования и получить качественные таблетки с ИФН с заданными свойствами.

Гранулят выбранного состава прессовали на гидравлическом прессе с помощью специального приспособления при давлениях 60, 80, 100, 120, 140 мн/м². Все таблетки имели массу 0,7 г и диаметр 12 мм.

Полученные при разном давлении таблетки исследовали на распадаемость, прочность на истирание, прочность на сжатие. Также были проведены исследования для установления влияния давления прессования на активность ИФН.

Средние результаты по этим показателям представлены в таблице 3.

Таблица 3 Выбор давления прессования таблеток с ИФН № п/п Показатель Давление, мн/м² 60 80 100 120 140 160 1 Распадаемость, с 1030 1264 1417 1522 1569 1595 2 Прочность на истирание, % 97,9 98,7 99,1 99,3 99,4 99,5 3 Прочность на сжатие, кг 10,5 13,1 14,6 15,0 >15 >15 4 Активность ИФН, ME 3970 3970 3970 3970 3970 3900

Испытание прочности на сжатие таблеток с ИФН, полученных при разных давлениях прессования, проводили на приборе фирмы «Erweka».

При исследовании влияния усилия прессования на активность ИФН было установлено, что усилие прессования в области 60-140 мн/м² не влияет на активность ИФН. При увеличении давления до 160 мн/м² происходит небольшое падение активности ИФН. В связи с этим давление прессования 120-140 мн/м² было использовано для дальнейших исследований.

На фиг.2 представлена зависимость распадаемости таблеток с ИФН от давления прессования.

Было выявлено, что при давлении от 0 до 120 мн/м² происходит значительное увеличение времени распадаемости, а после 120 мн/м² - значительное замедление. На основании приведенных данных было выбрано давление прессования в области 120-140 мн/м², при котором время распадаемости составляло 1522-1569 с.

На фиг.3 представлена зависимость прочности таблеток с ИФН на истирание от давления прессования.

Было показано, что при увеличении усилия прессования с 60 до 80 нм/м² происходит резкое увеличение прочности таблеток на сжатие, дальше увеличение идет постепенное. Однако для дальнейших исследований было выбрано давление прессования 120-140 мн/м², при котором прочность на сжатие составила ≥15 кг, что вполне удовлетворяет поставленным задачам.

Т.о., на основании результатов проведенных исследований для наработки опытных партий таблеток с ИФН средней массой 0,7 г и диаметром 12 мм было выбрано давление прессования, которое составило 120-140 мн/м². При данном давлении сохраняется высокая активность ИФН и таблетки с ИФН имеют хорошую прочность на сжатие (≥15 кг), высокую прочность на истирание (99,3-99,4%) и будут распадаться в ротовой полости в течение не менее 20-25 мин, что соответствует поставленным задачам.

Органолептически таблетки имели сладковатый вкус. Полное растворение таблеток в воде происходило в течение 30 мин.

При решении данной задачи удалось получить таблетки, обладающие определенной структурой, обеспечивающей ее растворение в ротовой полости человека в течение не менее 20-25 мин. В течение этого промежутка времени ИФН, высвобождающийся из таблеток, оказывает стимулирующее воздействие на иммунные органы (миндалины), иммунокомпетентные клетки слизистой оболочки, а также индуцирует развитие состояния неспецифической резистентности в клетках слизистой оболочки ротовой полости.

Мукозальный путь введения лекарственного средства исключает возможность его разрушения пищеварительными ферментами, так как полное растворение и всасывание компонентов таблетки происходит через слизистую ротовой полости. При этом проведенные прямые эксперименты по изучению возможного инактивирующего влияния слюнной жидкости на биологическую активность заявленного готового лекарственного средства показали, что оно не инактивируется на протяжении часового контакта со слюнной жидкостью.

Состав и технология получения таблетки позволяет в результате радиальной усадки препарата извлекать таблетки, сформированные в процессе прессования составляющих компонентов, простым вытряхиванием. Возможность такого извлечения возникает в результате того, что при радиальной усадке таблетки между ее наружными боковыми поверхностями и внутренней поверхностью формы возникает просвет, обеспечивающий беспрепятственный выход таблетки из формы. В качестве оборудования для производства иммуностимулирующего средства могут использоваться гидравлические прессы, таблеточные машины и подобное им оборудование.

Заявляемое иммуностимулирующее лекарственное средство может храниться 8 месяцев при температуре 4-10°С без потери активности.

Наряду с достигаемым при использовании заявляемого лекарственного средства увеличением иммунологической реактивности организма отмечается выраженное профилактическое и лечебное действие при инфекционных заболеваниях, в частности при гриппе и других ОРЗ, превосходящее по степени выраженности эффект от применения интерферонсодержащих препаратов, вводимых в организм иными путями (в виде мази и капель)

Эффективность заявляемого средства оценивали при использовании его для профилактики и лечения гриппа и ОРЗ по уровню заболеваемости, по показателям иммунного статуса, по выраженности клинической симптоматики.

Было показано, что из 10 испытуемых, принимавших иммуностимулирующее лекарственное средство с целью профилактики гриппа и ОРЗ, заболевших гриппом или ОРЗ не было, в то время как в группе испытуемых, принимавших мазевую форму ИФН (15 человек), и в контрольной группе (14 человек) заболеваемость составила от 10 до 37%.

Проводили также изучение влияния иммуностимулирующего лекарственного средства на показатели клеточного иммунитета при гриппозной инфекции у 15 больных. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Таблица 4 Влияние иммуностимулирующего лекарственного средства на средние показатели клеточного иммунитета при гриппозной инфекции Показатель Ед. измерения До лечения После лечения Норма 1 2 3 4 5 CD3+ % 43 53 55-80 ×10⁹/л 0,63 0,99 0,70-1,68 CD4+ % 37 33 31-46 ×10⁹/л 0,54 0,61 0,44-1,10 CD8+ % 10 26* 21-35 ×10⁹/л 0,15 0,48* 0,21-1,09 Иммунорегуляторный индекс ед. 3,7 1,27* 1,5-1,9 CD16+ % 7 21* 9-17 ×10⁹/л 0,1 0,39 0,11-0,45 CD25+ % 8 14* 13-24 ×10⁹/л 0,13 0,15* 0,14-0,74 РТМ спонтанная миграция Ед. 1,2 4,0* 1,8-4,0 РТМЛ с ФГА % 142 56* 20-60 * - Различия показателей достоверны по отношению к показателям до лечения

Было показано, что под влиянием заявляемого лекарственного средства у больных происходила нормализация сниженных показателей иммунного статуса, что свидетельствует о выраженном иммуностимулирующем действии лекарственного средства по отношении к системе клеточного иммунитета. Статистически достоверно увеличивались: количество иммунных Т-киллеров - CD8+; происходила нормализация иммунорегуляторного индекса; нормализовалось количество ЕК - CD16+; а также интерлейкин-2-зависимых лимфоцитов - CD25+4; происходила нормализация реакции торможения миграции (РТМ спонтанная миграция) и реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) с фитогемагглютинином (ФГА). Нормализация показателей иммунного статуса сопровождалась исчезновением клинической симптоматики и выздоровлением.

Результаты проведенного исследования показали хорошую переносимость заявляемого иммуностимулирующего средства, отсутствие побочных реакций, которые могут возникать при парентеральном или подкожном введении цитокинов. Основным недостатком инъекционной формы цитокинов является необходимость использования высоких доз препарата (более 10³ ME/кг массы тела), при которых у больных проявляется комплекс достаточно тяжелых токсических эффектов - повышение температуры тела, гриппоподобный синдром, возможно развитие комы [пат. СССР №1836103, 1993]. При инъекционном пути введения высоких доз ИФН могут образовываться антитела к ИФН, которые снижают эффективность лечения цитокином. Еще одним недостатком инъекционных форм цитокинов является их нестабильность при введении в кровяное русло, где период его инактивации измеряется минутами [Эндогенные иммуномодуляторы. - СПб: Гиппократ, 1992].

Заявляемое готовое лекарственное средство может быть использовано для профилактики и лечения «птичьего гриппа», обусловленного вирусами A (H5N1), вызывающего высокую смертность среди людей. Так, показано, что это заболевание развивается у людей с дефектной или супрессированной системой ИФН. Кроме этого, вирусы гриппа, особенно птичьего гриппа, способны вызывать резкое угнетение системы ИФН. При этом не могут развиться ранние цитокиновые реакции с прерыванием инфекционного процесса и сформироваться полноценный клеточный иммунный ответ, что в большинстве случаев сопровождается летальным исходом. Заявляемое готовое лекарственное средство, способствующее равномерному введению в организм ИФН, активирующего естественный клеточный иммунитет в течение продолжительного времени, может быть эффективным средством для профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусами птичьего гриппа A(H5N1) [Новые препараты на основе интерферонов против вирусов гриппа, включая A (H5N1) // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т.6, №3. - С.20-26].

Сущность заявляемой технологии иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения иммуностимулирующего средства использовали ингредиенты следующего состава (мас.% в расчете на сухое вещество): лактоза - 14, свекловичный сахар - 82, коллидон 90 F - 2, натрия бензоат - 0,2. После тщательного перемешивания добавляли раствор ИФН человека с активностью 2,5·10⁵ МЕ/мг белка. Соотношение объемов раствора ИФН к смеси других ингредиентов составляло 1:53,5. Предварительно раствор ИФН проверяли на исходную активность ИФН методом стандартного биологического тестирования на клетках L-41, зараженных вирусом везикулярного стоматита. Изготавливали таблетки с помощью модифицированного способа влажного гранулирования и прессования.

В полученных таблетках проверяли активность ИФН (результат - 4,0·10³ МЕ/мг белка) и помещали их на хранение. При хранении на протяжении 8 месяцев при температуре от 4 до 10°С активность ИФН в таблетках составила 4,1·10³ ME на 1 таблетку. Результаты испытаний приведены в таблице 5.

Таблица 5 Активность интерферона в одной таблетке для мукозального применения при разных сроках хранения при использовании для ее изготовления раствора интерферона с активностью 2,5·10⁵ МЕ/мг Срок хранения (месяцы) Активность интерферона (МЕ/таблетка) 2 3904 4 3986 5 4089 8 4158

Пример 2. В условиях примера 1 таблетирование иммуностимулирующего средства проводилось при использовании следующих концентраций ингредиентов (мас.% в расчете на сухое вещество): лактоза - 50, свекловичный сахар - 42, коллидон 90 F - 6, натрия бензоат - 0,1. Был использован раствор ИФН с активностью 2,5·10⁶ МЕ/мг белка. В полученных таблетках проверяли активность ИФН (результат - 4,0·10⁴ МЕ/мг белка) и помещали их на хранение. При хранении таблеток на протяжении 8 месяцев при температуре от 4 до 10°С активность ИФН составила 3,8·10⁴ ME на 1 таблетку (табл.6).

Таблица 6 Активность интерферона в одной таблетке для мукозального применения при разных сроках хранения при использовании для ее изготовления раствора интерферона с активностью 2,5·10⁶ МЕ/мг Срок хранения (месяцы) Активность интерферона (МЕ/таблетка) 2 39800 4 39700 5 40090 8 38000

Пример 3. В условиях примера 1 таблетирование иммуностимулирующего средства проводилось при использовании следующих концентраций ингредиентов (мас.% в расчете на сухое вещество): лактоза - 94, свекловичный сахар - 2, коллидон 90 F - 1, натрия бензоат - 3. Был использован раствор ИФН с активностью 2,5·10⁷ МЕ/мг белка. Исходная активность ИФН в таблетке составила 4,1·10⁵ ME, при хранении на протяжении 8 месяцев при температуре от 4 до 10°С активность ИФН составила 4,1·10⁵ ME на 1 таблетку, т.е. сохранность белка - 100% (табл.7).

Таблица 7 Активность интерферона в одной таблетке для мукозального применения при разных сроках хранения при использовании для ее изготовления раствора интерферона с активностью 2,5·10⁷ МЕ/мг Срок хранения (месяцы) Активность интерферона (МЕ/таблетка) 2 390980 4 397000 5 408000 8 410000

Из вышеприведенных примеров следует, что заявляемый способ получения иммуностимулирующего средства позволяет получать таблетки мукозального применения, в которых биологическая активность цитокинов сохраняется на протяжении 8 месяцев при температуре от 4 до 10°С.

Изобретение относится к медицине и фармакологии и представляет собой иммуностимулирующее лекарственное средство мукозального применения в виде таблеток для рассасывания, состоящее из интерферона и наполнителей, включающих углеводы, отличающееся тем, что в качестве наполнителей использован водорастворимый синтетический полимер поливинилпирролидон (1000000-1500000) с торговым названием коллидон 90 F, натрия бензоат, композиция углеводов лактозы и свекловичного сахара, причем ингредиенты в средстве находятся в определенном соотношении в мас.% на сухое вещество таблетки. Изобретение обеспечивает пролонгированное воздействие на иммунокомпетентные клетки слизистой оболочки ротовой полости и миндалин за счет медленного растворения в ротовой полости. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 7 табл., 3 ил.

1. Иммуностимулирующее лекарственное средство мукозального применения в виде таблеток для рассасывания, состоящее из интерферона и наполнителей, включающих углеводы, отличающееся тем, что в качестве наполнителей использован водорастворимый синтетический полимер поливинилпирролидон (1000000-1500000) с торговым названием коллидон 90 F, натрия бензоат, композиция углеводов лактозы и свекловичного сахара при следующем соотношении ингредиентов, мас.% на сухое вещество таблетки:
Интерферон 4·10³-4·10⁵ ME Свекловичный сахар 2-82 Лактоза 14-94 Коллидон 90 F 1-10 Натрия бензоат 0,1-3

2. Иммуностимулирующее лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что оно содержит интерферон с активностью 4·10³-4·10⁵ ME.

3. Способ получения иммуностимулирующего лекарственного средства по п.1, включающий приготовление однородной смеси углеводов, представляющих собой свекловичный сахар и лактозу, и коллидона 90 F, увлажнение ее с последующим перемешиванием водным раствором интерферона с активностью 4·10⁵-4·10⁷ ME, приготовление сито-гранулятором с диаметром отверстий 3-4 мм влажного гранулята, сушку, повторное гранулирование сухого материала до размера гранул 600-680 мкм, смешивание с натрием бензоатом, прессование в таблетки при давлении 120-160 мн/м² при температуре не выше +25°С.