ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ТРАНСПОРТНАЯ (ЖИДКАЯ) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО МИКРОБА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к получению питательных сред, обеспечивающих оптимальные условия для жизнедеятельности, транспортировки и культивирования бруцеллезного микроба.

Известна питательная среда, основой которой является агар Мартена, следующего состава, г/л: пептон Мартена 0,5; хлористый натрий 3,0; 20% гидроокись натрия 3,0; агар микробиологический 2,0; мясная вода 0,5; pH 7,2±0,1 (Черкесе Ф.К., Богоявленская Л.Б., Бельская Н.А. Микробиология. - М.: Медицина, 1987).

Недостатком данной среды является ее недостаточная продуктивность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является транспортная жидкая питательная среда для сбора, культивирования и транспортировки крови больных, подозреваемых на заболевание бруцеллезом, содержащая, г/л: гидролизат говяжьего мяса 170,0; натрий хлористый 5,0; глицерин 20,0; глюкоза 10,0; цитрат натрия 5,0; САГ-1 0,6; 20%-ная гидроокись натрия 0,001-0,0003, дистиллированная вода до 1 л (патент РФ №2247775. Опубл. 10.03.2005 г. Бюл. №7).

Недостатком данной среды является невозможность приобретения стимулятора роста бруцелл САГ-1 ввиду закрытия института биоорганической химии АН УССР (Украина).

Целью предлагаемого изобретения является получение питательной среды транспортной (жидкой) для культивирования бруцеллезного микроба.

Поставленная цель достигается тем, что питательной основой предлагаемой питательной среды транспортной (жидкой) для культивирования бруцеллезного микроба является гидролизат говяжьего мяса, среда также включает дрожжевую воду, натрия хлорид, глюкозу, глицерин, цитрат натрия, дистиллированную воду с добавлением в среду стимулирующей добавки - метабисульфит натрия, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Дрожжевая вода 18,0-22,0 Гидролизат говяжьего мяса 70,0-110,0 Натрия хлорид 3,0-7,0 Глюкоза 8,0-12,0 Глицерин 18,0-22,0 Цитрат натрия 3,0-7,0 Метабисульфит натрия 0,1-0,5 Дистиллированная вода до 1 л

Для получения дрожжевой воды используются дрожжи хлебопекарные прессованные ГОСТ 171-81 (производитель ООО «Дрожжевик», Карачаево-Черкессия, Адыге-Хабльский р-н, Эркин-Шахарский сахарный завод). Сырьем для производства хлебных дрожжей является меласса свекловичная (рафинадная) - отход свеклосахарного производства (патока свекловичная), которая в своем составе содержит термоустойчивые биологически-активные вещества, которые переходят в дрожжи. Кроме того, содержащиеся в них витамины В₃, B₈, а также Н-биотин являются важнейшими витаминами роста. Также в дрожжах содержатся микроэлементы: бор, фтор, алюминий, фосфор, марганец, железо, медь, молибден, а также аминокислоты: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серии, аспарагиновая, глутаминовая, тирозин, пролин - остальные аминокислоты обнаружены в виде следов (Болотов Н.А., Фараджаев Е.Д. Производство хлебопекарных дрожжей. М.: Профессия, 2002. - 167 с.; Семихатова Н.М. Производство дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1967. - 154 с.).

Используемый метабисульфит натрия, по данным авторов Zo Bell С.Е. и Meyer K.F. (1932) (Lankford et al., 1952; Lankford et al.,1956; Rode et al., 1951; Гудзовский А.Г. (1982)), полностью обеспечивает потребность бруцеллезного микроба в присутствии препарата серы.

Предлагаемая среда обеспечивает оптимальные условия для роста и размножения бруцеллезного микроба. Использование дрожжевой воды, а также введение в состав среды стимулирующей добавки метабисульфита натрия вполне заменяют САГ-1, обеспечивают усиление ростовых свойств питательной основы - гидролизата говяжьего мяса - и являются отличительными признаками предлагаемой питательной среды.

Способ приготовления питательной среды транспортной для диагностики бруцеллезного микроба заключается в следующем: хлебные дрожжи в количестве 1 кг растворяют в 2 л дистиллированной воды, подогревают до полного растворения дрожжей, кипятят в течение 5 мин, затем фильтруют через полотно Бельтинга. Готовую дрожжевую воду в количестве 20,0 мл добавляют в 90,0 мл гидролизата говяжьего мяса, разбавленного дистиллированной водой до содержания аминного азота 100 мг % и прокипяченного для удаления хлороформа, затем добавляют натрия хлорид 5,0 г; цитрат натрия 5,0 г, кипятят до растворения всех составляющих, устанавливают pH 7,3±0,1 гидроокисью натрия 20%. Выпавший осадок фильтруют через тканевый фильтр с фильтровальной бумагой, добавляют глюкозу 10,0 г; глицерин 20,0 мл; натрия метабисульфит 0,3 г. Среду разливают в стерильные пенициллиновые флаконы V 15 мл по 5,0±0,1 мл, закупоривают стерильными резиновыми пробками, накрывают алюминиевыми колпачками, вальцуют, стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Эффективность заявляемой питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», МУ 3.3.2.2124-06, Москва, 2007 г., с использованием в качестве тест-культур референтных вирулентных штаммов бруцелл B. melitensis 16 М; В. abortus 544. Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара pH 7,3±0,1 при температуре 37°С 48-120 ч. Из двухсуточных культур готовили 1 млрд взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000; 500; 100 м.к. Из каждого разведения взвеси культур высевали разовыми шприцами по 0,1 мл в 3 флакона. Посевы инкубировали при температуре 37±1°С в течение 5 суток. Через 48-72-120 ч учитывали количество выросших колоний.

Пример 1. Референтные штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: дрожжевую воду 18,0; гидролизат говяжьего мяса 70,0; натрия хлорид 3,0; глюкозу 8,0; глицерин 18,0; цитрат натрия 3,0; метабисульфит натрия 0,1; дистиллированную воду до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара через 48 ч, для бруцеллезного микроба B. melitensis 16 М и В. abortus 544 при посевной дозе 50 и 10 м.к. составило 290; 248; 201 и 135; 129; 127 колоний в S форме диаметром 1,3 мм, при посевной дозе 100 м.к. на пластинках агара был получен сплошной рост бактерий.

Пример 2. Референтные штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: дрожжевую воду 20,0; гидролизат говяжьего мяса 90,0; натрия хлорид 5,0; глюкозу 10,0; глицерин 20,0; цитрат натрия 5,0; метабисульфит натрия 0,3; дистиллированную воду до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара через 48 ч, для бруцеллезного микроба B. melitensis 16 М и В. abortus 544 при посевной дозе 50 и 10 м.к. составило соответственно 378; 350; 310 и 190; 159; 130 колоний в S форме диаметром 1,5 мм, при посевной дозе 100 м.к. на пластинках агара был получен сплошной рост бактерий.

Пример 3. Референтные штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: дрожжевую воду 22,0; гидролизат говяжьего мяса 110,0; натрия хлорид 7,0; глюкозу 12,0; глицерин 22,0; цитрат натрия 7,0; метабисульфит натрия 0,5; дистиллированную воду до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара через 48 ч, для бруцеллезного микроба B. melitensis 16 М и В. abortus 544 при посевной дозе 50 и 10 м.к. составило 260; 227; 210 и 112; 100; 99 колоний в S форме диаметром 1,3 мм, при посевной дозе 100 м.к. на пластинках агара был получен сплошной рост бактерий.

Таким образом, вариант полученной питательной среды (пример 2) является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов, они в совокупности обеспечивают рост культур B. melitensis 16 М и В. abortus 544 и позволяют получить конечную концентрацию бактерий через 48 ч, значительно превышающую посевную дозу.

Питательную среду №2 в количестве 5 мл помещают в пенициллиновые флаконы V 15 мл, закупоривают резиновыми пробками, накрывают алюминиевыми колпачками, вальцуют, стерилизуют при 1 атм 15 мин и используют для введения крови у постели больных, подозреваемых на заболевание бруцеллезом, и транспортируют на любые расстояния.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования бруцеллезного микроба. Питательная среда содержит дрожжевую воду, гидролизат говяжьего мяса, натрия хлорид, глюкозу, глицерин, цитрат натрия, метабисульфит натрия и дистиллированную воду. Изобретение позволяет обеспечить оптимальные условия для роста, размножения бруцеллезного микроба при транспортировке питательной среды на любые расстояния.

Питательная среда транспортная (жидкая) для культивирования бруцеллезного микроба, состоящая, г/л:
Дрожжевая вода 18,0-22,0 Гидролизат говяжьего мяса 70,0-110,0 Натрия хлорид 3,0-7,0 Глюкоза 8,0-12,0 Глицерин 18,0-22,0 Цитрат натрия 3,0-7,0 Метабисульфит натрия 0,1-0,5 Дистиллированная вода Остальное