ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Бруцеллез относится к зоонозным болезням, при которых основным источником заболевания у людей являются больные сельскохозяйственные животные.

В Российской Федерации ежегодно регистрируется до 500 случаев впервые выявленного бруцеллеза.

Разнообразие клинических проявлений бруцеллеза нередко затрудняет правильную постановку диагноза и требует применения лабораторных методов исследования.

Особые затруднения в диагностике бруцеллеза представляют случаи с неясным анамнезом, с нехарактерной клиникой ранних и особенно поздних проявлений инфекции, рецидивах, заболевания у заразившихся вакцинированных и при нередко встречающихся латентных формах инфекции. Во всех этих случаях лабораторные методы исследования часто приобретают решающее значение (1).

Известны питательные среды для выделения бруцелл агар Мартена, агар Альбими, сывороточно-декстрозный агар, глюкозоглицериновый агар, Эритрит-агар (2, 3, 4).

Указанные среды (сывороточно-декстрозный агар, глюкозоглицериновый агар) не стандартны, трудоемки в применении, кроме того все эти вышеперечисленные среды неселективные и не позволяют выделить культуру бруцелл из инфицированного материала.

Наиболее близким решением задачи того же назначения по совокупности признаков и достигаемому эффекту является питательная среда для выделения бруцелл фирмы Merck (4), содержащая источник азотистого питания - пептон мясной и пептон казеиновый, стимулятор роста - дрожжевой экстракт, а так же Д (+) глюкозу, натрия хлорид, агар, в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры - бацитрацин, полимиксин, циклогексамид, этиловый фиолетовый.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является то, что среда обладает недостаточными ростовыми свойствами, кроме того, данная питательная среда импортного производства дорогостоящая.

Задача предлагаемого изобретения - повышение ростовых свойств среды и удешевление стоимости среды.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая среда дополнительно содержит в качестве источника азотистого питания питательный бульон для культивирования микроорганизмов, в качестве стимуляторов роста - витаминный препарат "ЭКД" и метабисульфит натрия, в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры - кристаллический фиолетовый и налидаксовую кислоту при следующем соотношении компонентов (5, 6, 7) в г/л дистилированной воды:

питательный бульон для культивирования микроорганизмов- 14,0-16,0пептон ферментативный- 9,0-11,0витаминный препарат "ЭКД"- 4,0-6,0Д(+) глюкоза- 0,5-1,5натрия хлорид- 4,0-6,0метабисульфит натрия- 0,05-0,15кристаллический фиолетовый- 0,0005-0,0015налидиксовая кислота- 0,015-0,025агар микробиологический- 10,0-12,0

Введение в состав предлагаемой среды кристаллического фиолетового и налидиксовой кислоты ингибирует полностью рост сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры и не оказывает влияние на рост бруцелл. Кроме того питательная среда обладает хорошими ростовыми свойствами, отмечается рост колоний бруцелл на 3 сутки, и то время как на среде-прототипе - на 4-5 сутки. Среда сконструирована из отечественных, гостированных компонентов и не требует внесения ex temporae антибиотиков после стерилизации среды.

Среду получают следующим образом:

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 14,0 г питательного бульона для культивирования микроорганизмов, 9,0 г пептона ферментативного, 4,0 г витаминного препарата "ЭКД", 0,5 г Д(+) - глюкозы, 4,0 г натрия хлорида, 0,05 г метабисульфита натрия, 0,005 г кристаллического фиолетового, 10,0 г агара микробиологического.

Среду доводят до кипения и кипятят 2 минуты. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,015 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% раствора NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды) и вносят в питательную среду. Среду стерилизуют автоклавированием при температуре 112°С в течение 20 минут. Разливают в стерильные чашки Петри, предварительно остудив среду до 45°С. Чашки подсушивают в термостате при 37°С в течение (35±5) минут.

Пример 2. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 15,0 г питательного бульона для культивирования микроорганизмов, 10,0 г пептона ферментативного, 5,0 г витаминного препарата "ЭКД", 1,0 г Д(+) - глюкозы, 5,0 г натрия хлорида, 0,1 г метабисульфита натрия, 0,001 г кристаллического фиолетового, 11,0 г агара микробиологического.

Среду доводят до кипения и кипятят 2 минуты. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,02 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% раствора NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды) и вносят в питательную среду. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 16,0 г питательного бульона для культивирования микроорганизмов, 11,0 г пептона ферментативного, 6,0 г витаминного препарата "ЭКД", 1,5 г Д(+) - глюкозы, 6,0 г натрия хлорида, 0,15 г метабисульфита натрия, 0,0015 г кристаллического фиолетового, 12,0 г агара микробиологического.

Среду доводят до кипения и кипятят 2 минуты. Перед стерилизацией вносят налидиксовую кислоту (0,025 г налидиксовой кислоты растворяют в 0,5 мл 1% раствора NaOH при добавлении 4,5 мл дистиллированной воды) и вносят в питательную среду. Далее согласно примерам 1, 2. Контроль качества среды осуществляли путем посева тест-штаммов Brucella abortus ВА 19 из разведения 10^-6 и 10^-7, Echerichia coli 168/59, Proteus vulgaris HX 19 N 222, Stafylococcus aureus 209-P из разведения 10^-3. Через 72-120 часов инкубации посевов в термостате при 37°С определяют наличие роста.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда обладает более высокими ростовыми свойствами. На предлагаемой среде бруцеллы формируют типичные колонии на 3 сутки, в то время как на известной среде на 4-5 сутки.

Представленные преимущества предлагаемой среды позволят повысить эффективность диагностики бруцеллеза при бактериологическом исследовании клинического материала на наличие бруцелл.

Источники информации

1. Г.И.Лямкин, Л.В.Ляпустина, О.В.Малецкая, И.А.Соколова, И.Ф.Таран, Л.И.Ткаченко, В.Г.Дальвадянц, А.В.Тамбовцев. Состояние и перспективы лабораторной диагностики бруцеллеза. "Клиническая лабораторная диагностика", 2002, №12, с.46-47.

2. П.А.Вершилова, Бруцеллез. Москва, 1972, с.55-57.

3. Ю.А.Козлов, Питательные среды. Москва, 1950, с.62, 169.

4. Каталог сухих микробиологических питательных сред. Махачкала, 1998, с.48.

5. Каталог фирмы "Мерк", 1990, с.66.

6. ФС 42-3520-98.

7. ФС 42-3G ВС-91.

8. Химические реактивы и высококачественные химические вещества, Каталог, Москва, Химия, 1983, с.145, 365, 284.

ТаблицаСравнительная характеристика биологических показателей предлагаемой и известной средПитательные средыТест-штаммыСкорость ростаЧувствительностьИнгибицияПредлагаемая питательная средаBrucella abortus 19 ВА2-3 сутокКолонии бесцветные, с перламутровым оттенком, d=0,2-0,5 мм из разведения 10^-6Тест-штаммов S.aureus 209-P, E.coli 168/59, Pr.vulgaris HX19 n 222 полная из разведения 10^-3Известная питательная среда для выделения бруцелл + селективная добавкаBrucella abortus 19 ВА4-5 сутокКолонии бесцветные, с перламутровым оттенком, d=0,2-0,5 мм из разведения 10^-6Тест-штаммов S.aureus 209-P, E.coli 168/59, Pr.vulgaris Hxl9 N 222 из разведения 10^-3

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к клинической микробиологии, и может быть использовано для бактериологической диагностики бруцеллеза. Питательная среда содержит питательный бульон, пептон ферментативный, витаминный препарат "ЭКД", Д(+) глюкозу, натрия хлорид, метабисульфит натрия, налидиксовую кислоту, кристаллический фиолетовый, агар микробиологический, дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды и удешевить ее стоимость. 1 табл.

Питательная среда для выделения бруцелл, содержащая источник азотистого питания, стимулятор роста, агар микробиологический, Д(+) глюкозу, натрия хлорид, ингибиторы сопутствующей микрофлоры, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в качестве источника азотистого питания питательный бульон для культивирования микроорганизмов и пептон ферментативный, в качестве стимулятора роста - витаминный препарат "ЭКД" и метабисульфит натрия, в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры - налидиксовую кислоту и кристаллический фиолетовый при следующем содержании компонентов, г/л дистиллированной воды:

Питательный бульон для Культивирования микроорганизмов14,0-16,0Пептон ферментативный9,0-11,0Витаминный препарат "ЭКД"4,0-6,0Д(+) глюкоза0,5-1,5Натрия хлорид4,0-6,0Метабисульфит натрия0,05-0,15Кристаллический фиолетовый0,0005-0,0015Налидиксовая кислота0,015-0,025Агар микробиологический10,0-12,0