БИФАЗНАЯ ТРАНСПОРТНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ВЫРАЩИВАНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО МИКРОБА Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования бруцеллезного микроба.

Известна двухфазная среда, включающая: Е-агар, состоящий, г/л: папаиновый гидролизат соевой муки USP - 20 г; натрия хлорида - 5 г; глюкоза - 5 г; агар - 10 г; деионизированная вода - 1000 мл (плотная фаза). Е-бульон, состоящий, г/л: папаиновый гидролизат соевой муки USP - 20 г; натрия хлорида - 5 г; глюкоза - 5 г; феноловый красный 2%-ный водный раствор - 2 мл: деионизированная вода - 1000 мл (жидкая фаза). Для получения данной среды в стерильные пробирки с завинчивающими крышками с соблюдением правил асептики разливают по - 3 мл Е-агара, после затвердения на среду наслаивают - 3 мл Е-бульона и хранят пробирки при комнатной температуре (Ф.Герхард. Методы общей бактериологии, том 1. С.331-332. Москва, Мир, 1983). Недостатком данной питательной среды является наличие в ее составе дорогого и мало распространенного компонента - папаинового гидролизата соевой муки USP, и долгий срок результата высева - месяц.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является двухфазная питательная среда для выделения бруцеллезного микроба, совокупность существенных признаков плотной фазы которой наиболее близка к совокупности существенных признаков предлагаемого изобретения.

Плотная фаза содержит, г/л: патоку рафинадную - 20,0; натрия хлорида - 5,0; натрия фосфорнокислого двузамещенного - 4,0; дрожжевого экстракта - 10,0; микробиологического агара - 18,0; водопроводной - воды остальное (Патент RU 2346052, опубликован 10.02.2009. Бюл. №4).

Недостатком данной питательной среды является получение ограниченного количества колоний бруцеллезного микроба.

Целью изобретения является разработка рецептуры бифазной транспортной питательной среды для выделения и выращивания возбудителя бруцеллеза, которая обеспечивает активный рост бруцеллезного микроба через 46±2 ч в жидкой фазе и через 60±2 ч на пластинках питательного агара.

Цель достигается тем, что предлагаемая бифазная транспортная питательная среда содержит плотную фазу, содержащую соответственно, г/л:

Мясная вода 400,0-600,0 Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 Печеночный настой 400,0-600,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Агар микробиологический 14,0-20,0

Мясная вода - говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку 1 кг мясного фарша, заливают 2 л водопроводной воды и кипятят в течение часа, накипь снимают. После кипения мясную воду остужают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют 20 минут при 120°С (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологичеких исследований. Издательство «Медицина». Москва, - 1972, 437 с.).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - ГОСТ 13805-76. Производитель «НПО Порт-Петровск».

Печеночный настой - фарш из свежей говяжьей печени заливают питьевой водой (1 л на 1 кг фарша), затем настаивают 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4-10°С, затем варят около 2 ч; после варки настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 115-120°С 20 мин (Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Москва, «Медицина», 1982, 82.с.).

Натрий хлористый - ХЧ ГОСТ 423377. Партия 1.

Агар микробиологический (европейский тип). Производитель: Испания. Партия LF15110173.

Использование мясной воды, пептона сухого ферментативного с печеночным настоем в качестве основы является отличительным признаком плотной фазы предлагаемой питательной среды.

Жидкая фаза по прототипу представлена питательной средой (жидкой) для культивирования бруцелл (патент РФ RU №2238973. Бюл. №30 от 27.10.2004 г.), но в отличие от прототипа предлагаемая среда дополнительно содержит метабисульфит натрия при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Гидролизат говяжьего мяса 160,0-180,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Глицерин 19,0-21,0 Глюкоза 9,0-11,0 Цитрат натрия 4,0-6,0 Липоевая кислота 0,4-0,6 Метабисульфит натрия 0,1-0,4 Дистиллированная вода остальное

Метабисульфит натрия ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Использование в качестве нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов метабисульфита натрия является отличительным признаком жидкой фазы заявляемой питательной среды.

Посев изучаемых культур материала осуществляют в двухфазную среду, завальцованную во флаконы (V 100 мл) по 30 мл плотной среды и 10 мл жидкой среды, стерильную.

Приготовление бифазной транспортной питательной среды для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба включает два этапа.

Плотная фаза питательной среды

Для приготовления плотной фазы питательной среды отмеряют - 500,0 мл мясной воды в мерном стакане, выливают в эмалированную кастрюлю, затем вливают печеночный настой - 500,0 мл, взвешивают на механических весах пептон сухой ферментативный - 10,0 г, натрий хлористый - 5,0 и агар микробиологический 17,0 г ссыпают в эмалированную кастрюлю, тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до кипения, затем кипятят до полного расплавления агара в течение 5 мин. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр Сбор фильтрата помещают в эмалированную кастрюлю. Готовый фильтрат имеет светло-желтый цвет.

рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до 7,3±0,1.

Приготовленную среду разливают во флаконы (V 100) по 30 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют в автоклаве при 114±1°С в течение 20 мин. После стерилизации и остуживания до 56°С укладывают флаконы на бок, чтобы расплавленная агаровая среда образовала твердый скошенный слой на ее боковой стенке. Через 3-е суток флаконы ставят вертикально и выдерживают в термостате 3-е суток при 37°С на стерильность.

Плотная фаза питательной среды содержит следующие ингредиенты,

г/л:

Мясная вода 400,0-600,0 Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 Печеночный настой 400,0-600,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Агар микробиологический 14,0-20,0

Жидкая фаза питательной среды

Для приготовления жидкой фазы питательной среды отмеряют - 170,0 мл ферментативного гидролизата говяжьего мяса, выливают в эмалированную кастрюлю, затем заливают дистиллированной водой - 830 мл, взвешивают на механических весах натрий хлористый - 5,0 г, глицерин - 20,0 г, глюкозу - 10,0 г, цитрат натрия - 5,0 г, липоевую кислоту - 0,5 г, метабисульфит натрия - 0,3 г ссыпают в эмалированную кастрюлю, тщательно перемешивают. Среду нагревают при непрерывном помешивании до полного растворения ее компонентов, фильтруют через тканевой фильтр, затем устанавливают рН до 7,3±0,1 20% гидроокисью натрия или раствором соляной кислоты в соотношении 1:1.

Жидкая фаза питательной среды содержит следующие ингредиенты,

г/л:

Гидролизат говяжьего мяса 160,0-180,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Глицерин 19,0-21,0 Глюкоза 9,0-11,0 Цитрат натрия 4,0-6,0 Липоевая кислота 0,4-0,6 Метабисульфит натрия 0,1-0,4 Дистиллированная вода остальное

Приготовленную среду разливают в стерильные бактериологические пробирки мерно по 10±0,1 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 мин. После стерилизации и остуживания штативы с пробирками ставят в термостат и выдерживают 3-е суток при 37°С на стерильность. После проверки стерильности твердой и жидкой фаз питательный среды с соблюдением правил асептики стерильно над факелом жидкую питательную среду вливают во флаконы с плотной питательной средой. Флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками, накрывают алюминиевыми колпачками, затем вальцуют. Завальцованные флаконы выдерживают в термостате при температуре 37°С 3-е суток (проверка на стерильность). Сочетанное применение вышеописанных плотной и жидкой фаз заявляемой бифазной транспортной среды обеспечивает существенное усиление ростовых качеств бруцеллезного микроба в значительно ранние сроки через 46±2 ч в жидкой фазе и через 60±2 ч на пластинках питательного агара.

Готовую бифазную транспортную питательную среду используют для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба.

Эффективность полученной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-06) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием в качестве тест-культур В. melitensis 16 М, В. abortus 19 ВА и В. suis 1330. Испытуемые культуры выращивали на поверхности скошенного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц, эквивалентную 1,7×109 бруцелл 1 мл, по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П ГИСК им. Л.А.Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 и 100 м.к. Из данных разведений взвесей культур высевали одноразовым шприцем по 0,1 мл в 3 флакона. Посевы инкубировали при температуре 37°С. Через каждые 24-48-72-120 ч флаконы наклоняют, так чтобы жидкая среда смачивала всю поверхность скошенного агара, а затем из жидкой среды стерильно одноразовым шприцем над спиртовкой через прокол резиновой пробки забирают пробу в количестве 0.1 мл и засевают на 3 чашки Петри из каждого разведения и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности.

Оценку ростовых свойств бифазной транспортной питательной среды для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба проводили путем подсчета количества выросших колоний бруцелл при посеве содержимого флаконов посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на бифазной транспортной питательной среде для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба, содержащей, г/л: (плотная фаза) мясная вода - 400,0; печеночный настой - 400,0; пептон сухой ферментативный - 8,0; натрий хлористый 4,0; агар микробиологический - 15,0; (жидкая фаза) гидролизат говяжьего мяса -160,0; натрий хлористый - 4,0; глицерин - 19,0; глюкоза - 9,0; цитрат натрия - 4,0; липоевая кислота- 0.4; метабисульфит натрия - 0,1; дистиллированная вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, через 46-60 ч подращивания при посевной дозе 100 и 10 м.к. для В. abortus 19 В А составило 561 и 101 колоний диаметром 1,2 мм, для В. melitensis 16 М - 445 и 100 колоний диаметром 1,1 мм, а для В. suis 1330 составило соответственно 350 и 97 колоний диаметром 1,2 мм. То есть накопительный эффект после 48-60 ч подращивания составил: для В. abortus 19 ВА - 67%, В. melitensis 16 М - 53%, В. suis 1330- 47%.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на бифазной транспортной питательной среде для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба, содержащей, г/л: (плотная фаза) мясная вода - 500,0; печеночный настой - 500,0; пептон сухой ферментативный - 10,0; натрий хлористый 5,0; агар микробиологический - 17,0; (жидкая фаза) гидролизат говяжьего мяса - 170,0; натрий хлористый - 5,0; глицерин - 20,0; глюкоза - 10,0; цитрат натрия - 5,0; липоевая кислота - 0,5; метабисульфит натрия - 0,3; дистиллированная вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, через 46-60 ч при посевной дозе 100 и 10 м.к. для В. abortus 19 ВА составило сплошной рост и 430 колоний диаметром 1,5 мм, для В. melitensis 16 М - сплошной рост и 444 колоний диаметром 1,5 мм, а для В. suis 1330 составило соответственно сплошной рост и 425 колоний диаметром 2,0 мм. То есть накопительный эффект после 48-60 ч подращивания составил: для В. abortus 19 В А - 99%, В. melitensis 16 М - 82%, В. suis 1330-79%.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на бифазной транспортной питательной среде для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба, содержащей, г/л: (плотная фаза) мясная вода - 600,0; печеночный настой - 600,0; пептон сухой ферментативный - 12,0; натрий хлористый 6,0; агар микробиологический - 20,0; (жидкая фаза) гидролизат говяжьего мяса - 180,0; натрий хлористый - 6,0; глицерин - 21,0; глюкоза - 11,0; цитрат натрия - 6,0; липоевая кислота - 0,6; метабисульфит натрия - 0,4; дистиллированная вода - остальное.

При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, через 46-60 ч при посевной дозе 100 и 10 м.к. для В. abortus 19 В А составило 495 и 192 колоний диаметром 1,1 мм, для В. melitensis 16 М - 400 и 187 колоний диаметром 1,1 мм, а для В. suis 1330 составило соответственно 258 и 181 колоний диаметром 1,2 мм. То есть накопительный эффект после 48-60 ч подращивания составил: для В. abortus 19 ВА - 65%, В. melitensis 16 М - 59%, В. suis 1330 - 52%.

Таким образом, пример №2 бифазной питательной среды является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов двух фаз питательной среды, что позволяет получить достаточное количество колоний бруцеллезного микроба в ранние сроки (через 46-60 ч). Рентабельность среды составляет 31%.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для выделения и выращивания бруцеллезного микроба. Питательная среда включает плотную и жидкую фазы. Плотная фаза содержит мясную воду, пептон сухой ферментативный, печеночный настой, натрий хлористый, агар микробиологический в заданном соотношении компонентов. Жидкая фаза содержит гидролизат говяжьего мяса, натрий хлористый, глицерин, глюкозу, цитрат натрия, липоевую кислоту, метабисульфит натрия и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания бруцеллезного микроба. 2 пр.

Бифазная транспортная питательная среда для выделения и выращивания возбудителя бруцеллезного микроба, содержащая плотную фазу, включающую соответственно, г/л:
Мясная вода 400,0-600,0 Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 Печеночный настой 400,0-600,0 Натрий хлористый 4,0-6,0 Агар микробиологический 14,0-20,0