Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для выделения и дифференциации шигелл и сальмонелл при исследовании объектов окружающей среды, а также различного биологического материала при подозрении на шигеллез и сальмонеллез.
Сальмонеллы (Salmonella spp.) - патогенные микроорганизмы, которые вызывают инфекционные заболевания (сальмонеллезы) у человека и животных. Одной из этиологических особенностей современных сальмонеллезов является увеличение числа циркулирующих серологических вариантов возбудителя. Такая тенденция отмечается во всех экономически развитых странах. Распространению сальмонелл на территориях, где они раньше не встречались, в значительной степени способствуют социально-экономические факторы: расширение международных связей и туризма, а также торговля животными, птицей, пищевыми продуктами, кормами для животных и птиц, которые часто оказываются контаминированы сальмонеллами.
Шигеллы (Shigella spp.) - возбудители бактериальной дизентерии (шигеллезов) человека - антропонозного инфекционного заболевания с фекально-оральным механизмом передачи. Характерным синдромальным признаком является гемоколит. В настоящее время в 50% случаев заболевания протекают как острый колит, без примеси крови в испражнениях, который клинически невозможно отличить от диареи, вызванной другими патогенными энтеробактериями. Естественным хозяином и источником инфекции является человек (больной острой или хронической формой дизентерии, реконвалесцент или транзиторный носитель). Наибольшую опасность представляют больные с легкой и стертой формами дизентерии, работающие в пищевой промышленности, и приравненные к ним декретированные группы населения. Шигеллы часто встречаются в воде открытых водоемов, пищевых продуктах, на поверхности объектов внешней среды. Пути передачи инфекции различные: пищевой, дополнительные - водный и контактный. Пищевой путь передачи инфекции при шигеллезах является ведущим.
Для выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий, в частности, сальмонелл и шигелл при проведении бактериологических исследований в клинической и санитарной микробиологии обязательны к использованию дифференциально-диагностические питательные среды. Питательные среды Эндо, агар Плоскирева, SS-агар обеспечивают дифференциацию лактозоотрицательных шигелл и сальмонелл от лактозоположительных бактерий, но на средах наблюдается рост протея в виде роения, либо очагового роения. Агар МакКонки с лактозой также позволяет провести дифференциацию микроорганизмов по признаку ферментации лактозы, но на среде возможен рост грамположительной микрофлоры. Более селективная питательная среда XLD-агар обеспечивают четкую дифференциацию сальмонелл, шигелл, от других энтеробактерий, но на среде обильно растет кишечная палочка.
Действующие нормативные документы ГОСТ ISO 21567:2004 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных - Горизонтальный метод выявления Shigella spp.» и ГОСТ 32010- 2013 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Shigella» регламентируют использование селективно-диагностической питательной среды-Энтероагар гектоеновый.
Прототипом предлагаемой питательной среды является коммерческая среда Hektoen Enteric Agar,
Дифференциально-селективная питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл сухая (Гектоеновый энтеро-агар) предназначена для проведения исследований клинического материала с целью выделения и дифференциации шигелл и сальмонелл - возбудителей кишечных инфекционных заболеваний человека. Среда обеспечивает хороший рост бактерий родов Salmonella и Shigella и их четкую дифференциацию не только между собой, но и от других представителей энтеробактерий.
В процессе ферментации микроорганизмами специфических углеводов: лактозы, сахарозы и салицина происходит образование кислоты, что приводит к изменению цвета индикаторов: бромтимолового синего и кислого фуксина на Гектоеновом энтеро-агаре.
Присутствие в среде тиосульфата натрия и цитрата аммонийного железа приводит к почернению колоний в результате роста сероводород-положительных штаммов сальмонелл и протеев. Соли желчных кислот и новобиоцин подавляют рост большинства сопутствующих микроорганизмов.
В настоящее время в России такая питательная среда не производится.
Недостатком коммерческой среды является:
- слабые селективные свойства в отношении кишечной палочки;
- ограниченная доступность;
- высокая стоимость
- Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для выделения и дифференциации шигелл и сальмонелл, обладающей стабильностью результатов по ростовым и ингибирующим свойствам, обеспечивающей доступность получения объективных результатов бактериологического контроля.
Технический результат достигается тем, что предлагаемая Селективная питательная среда Гектоеновый энтеро-агар сухая, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, лактозу, сахарозу и салицин, смесь желчных солей, натрий хлористый, натрий тиосульфат, железа аммонийного цитрат, фуксин кислый, бромтимоловый синий, агар бактериологический и отличающаяся тем, что содержит уменьшенную концентрацию салицина и комбинацию желчных солей импортных с желчью очищенной сухой отечественного производства, дополнительно содержит натрий углекислый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
СД, г/л новобиоцин 0,015
Предложенная питательная среда содержит в качестве источника азотистого питания мясной или ферментативный пептон, дрожжевой экстракт - источник витаминов. Высокие концентрации лактозы и сахарозы с пептоном и салицином смягчают подавляющий эффект желчных солей, при этом рост сальмонелл и шигелл хорошо заметен, а рост нормальной кишечной микрофлоры подавляется. Лактоза способствует более четкому выявлению кишечных патогенов. В присутствии тиосульфата натрия и соли железа колонии микроорганизмов, продуцирующих сероводород, имеют черный центр. С целью повышения селективности среды и подавления роста цитробактеров и протеев в среду вводят 15 мг/л новобиоцина.
Дифференциально-селективная питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл сухая (Гектоеновый энтеро-агар) представляет собой смесь сухих компонентов из расчета, г/л:
СД, г/л новобиоцин 0,015
Отличием предлагаемой среды от прототипа является: дополнительное содержание натрия углекислого, уменьшенная концентрация дорогостоящего салицина по сравнению со средой-прототипом и использование комбинация импортных желчных солей с желчью очищенной сухой отечественного производства, позволяющие снизить стоимость среды.
В Гектоеновом энтеро-агаре пептон и дрожжевой экстракт являются источниками питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов: азота, витаминов, минеральных солей и аминокислот. Лактоза, сахароза и салицин являются ферментируемыми и дифференцирующими субстратами. Среда обеспечивает селективность в отношении грамположительной и грамотрицательной сопутствующей микрофлоры за счет присутствия в среде желчных солей № 3 и желчи очищенной крупного рогатого скота, а также новобиоцина. В составе среды прототипа желчных солей 9,0 г/л, содержащих холевой и дезоксихолевой кислот- 45-55%. В отечественной очищенной желчи (ЖОГ) - содержание желчных кислот - не менее 40-45%. Наиболее оптимальной в данной среде является концентрация желчных солей №3 и ЖОГ в количествах по 4,5 г/л соответственно. Замена дорогостоящего компонента (желчные соли №3) в Гектоеновом энтеро-агаре не ухудшает качества среды, но значительно ее удешевляет.
Пример 1. Способ получения питательной среды предусматривает смешивание сухих компонентов. Для приготовления среды берут навески следующих ингредиентов, г/л:
Состав СД, г/л новобиоцин 0,015
Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят при постоянном помешивании не более 2 мин до полного расплавления агара. Питательную среду не автоклавируют. Содержимое флакона с селективной добавкой растворяют в 5 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают, вносят в стерильную, охлажденную до температуры 50-55°С питательную среду из расчета 5 мл на 1 л среды и разливают в стерильные чашки Петри.
Готовая питательная среда с СД зеленого цвета.
Для контроля полученной среды использовали тест-штаммы микроорганизмов из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».
Готовили стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10-6 (для E. coli ATCC 25922 и E. faecalis 19433- до разведения 10-4)
Для определения ростовых свойств засев производили по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма S.enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 11272, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 79, S. flexneri 1а 8516 и E. aerogenes АТСС 13048 NCTC 10006 из разведений 10-6 соответственно на две чашки Петри с приготовленной питательной средой и стерильным шпателем распределяли взвесь по поверхности среды. Через 18-24 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С визуально учитывали наличие и характер роста:
- S.enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 11272, S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 79 - обильный рост зеленовато-голубых колоний, с черным центром (продуцирование сероводорода);
- S. flexneri 1а 8516 - обильный рост зеленовато-голубых колоний;
- E. aerogenes АТСС 13048 NCTC 10006 - рост колоний от желтого до оранжево цвета.
Питательная среда ингибирует рост тест-штаммов E. coli ATCC 25922 и E. faecalis АТСС19433 из разведения 10-4.
Результаты биологического контроля лабораторных образцов Гектоенового энтеро-агара на наборе тест-штаммов представлены в таблице 1.
Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.
СД, г/л новобиоцин 0,015
Результаты биологического контроля, представленные в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.
СД, г/л новобиоцин 0,015
Результаты биологического контроля, представленным в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.
Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.
СД, г/л:
СД, г/л новобиоцин 0,015
Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примере 4 ведет к ухудшению ростовых свойств в отношении шигелл и ингибирующих свойств к микробам ассоциантам.
Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.
Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.
СД, г/л новобиоцин 0,015
Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.
Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в большую сторону на примере 5 ведет к значительному повышению ингибирующих свойств, что негативно сказывается на специфической активности среды.
Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна в накоплении представителей родов шигелл и сальмонелл и подавляет рост ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Визуальный учет результатов выявления бактерий и их дифференциации по способности ферментировать углеводы по окончании срока инкубации посевов показал идентичные результаты в испытуемых (Гектоеновый энтеро-агар) и контрольной (Hektoen Enteric Agar М 467) средах.
Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.
Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается снижение специфической активности и изменение ингибирующей способности среды:
- при концентрации компонентов ниже минимальных пределов наблюдался рост E. faecalis АТСС19433 и E. coli ATCC 25922.
- при концентрации компонентов выше максимальных пределов
подавляется рост S. flexneri 1а 8516 (наличие мелких колоний):
- ингибирующий эффект среды более значительный.
Предварительно были проведены исследования по оптимизации салицина: были изучены варианты Гектоенового энтеро-агара с концентрациями салицина от 0,5 до 2,0 г/л (по аналогии со средой-прототипом). Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы, увеличенная концентрация салицина до значения 2,0 г/л не влияет на специфическую активность и ингибирующую способность Гектоенового энтеро-агара.
Таким образом, разработана сухая отечественная конкурентоспособная питательная среда Гектоеновый энтеро-агар;
Преимуществом отечественной предлагаемой среды, является:
- доступность для потребителей;
- стабильность ростовых свойств в отношении шигелл и сальмонелл при высокой селективности в отношении кишечной палочки;
- снижение концентрации дорогостоящего салицина и частичная замена коммерческих импортных желчных солей на желчь очищенную сухую отечественного производства позволили снизить стоимость среды на 15-20% в сравнении с прототипом.
(Hektoen Enteric Agar М 467)
посевной дозы на среде ГРМ-агар (среднее значение)
81
85
83
76
72
78
84
74
79
58
Продолжение таблицы 1.
78
84
86
36
27
85
92
53
68
С концентрацией салицина 0,5 г/л
С концентрацией салицина 2,0 г/л
(Hektoen Enteric Agar М 467)
посевной дозы на среде ГРМ-агар (среднее значение)
71
78/
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШИГЕЛЛ И САЛЬМОНЕЛЛ | 2002 |
|
RU2233885C2 |
| Дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения иерсиний | 1991 |
|
SU1778182A1 |
| ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ "АВМ" | 2006 |
|
RU2332459C1 |
| СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА Shewanella | 2010 |
|
RU2435845C1 |
| ПЛОТНАЯ ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 1995 |
|
RU2103367C1 |
| СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ СЕРОТИПА 0157 | 2004 |
|
RU2273661C2 |
| СЕЛЕКТИВНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕБСИЕЛЛ | 2003 |
|
RU2265056C2 |
| Селективная питательная среда для выделения аэромонад из водных объектов | 2022 |
|
RU2795907C1 |
| ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА | 1995 |
|
RU2101342C1 |
| Набор штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики холеры | 2019 |
|
RU2743454C1 |
Изобретение относится к биотехнологии. Предложена селективная питательная среда гектоеновый энтеро-агар сухая для выделения шигелл и сальмонелл, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, лактозу, сахарозу и салицин, смесь желчных солей - желчные соли N3 и желчь очищенную сухую, натрий хлористый, натрий тиосульфат, железа аммонийного цитрат, фуксин кислый, бромтимоловый синий, натрий углекислый, агар бактериологический и селективную добавку новобиоцин при заданном содержании исходных компонентов. Изобретение обеспечивает расширение арсенала селективных питательных сред для проведения исследований клинического материала с целью выделения и дифференциации шигелл и сальмонелл - возбудителей кишечных инфекционных заболеваний человека. 2 табл., 5 пр.
Селективная питательная среда Гектоеновый энтеро-агар сухая для выделения шигелл и сальмонелл, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, лактозу, сахарозу и салицин, смесь желчных солей, натрий хлористый, натрий тиосульфат, железа аммонийного цитрат, фуксин кислый, бромтимоловый синий, и агар бактериологический отличающаяся тем, что в качестве смеси желчных кислот содержит желчные соли N3 и дополнительно содержит желчь очищенную сухую, натрий углекислый и селективную добавку (СД) новобиоцин при следующем содержании исходных компонентов, г/л:
| Детекторный радиоприемник гетеродин | 1923 |
|
SU467A1 |
| ШЕПЕЛИН А.П., ПОЛОСЕНКО О.В | |||
| "Новая отечественная питательная среда для выявления шигелл и сальмонелл-Гектоенагар", Справочник заведующего КДЛ, 2021, N 9, с.13-24 | |||
| ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ШИГЕЛЛ И САЛЬМОНЕЛЛ | 2002 |
|
RU2233885C2 |
| ШЕПЕЛИН А.П | |||
