СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТЕРОГЕННОСТИ КРОВИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 G01N33/539 G01N33/92 

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для определения атерогенности крови для ранней диагностики атеросклероза.

Атерогенность крови характеризуется накоплением модифицированных липопротеинов, обладающих иммуногенными свойствами и способствующих гиперагрегации тромбоцитов, и в конечном итоге приводит к возникновению атеросклеротических заболеваний.

Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [1]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность, длительность проведения исследования (более 2 суток).

Задачей изобретения является разработка способа, устраняющего вышеуказанные недостатки, расширение арсенала способов для ранней диагностики атеросклероза для клинико-диагностических лабораторий за счет упрощения технологии и визуальной оценки результатов теста, сокращения времени проведения процедуры (до 10 мин), а также его многократное удешевление.

Эта задача решается тем, что определение атерогенности плазмы крови человека проводят путем обработки ее 10% раствором поливинилпирролидона (ПВП) 12600±2700 при объемном соотношении плазма:среда (1:8), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, и при наличии помутнения в опытной пробе визуально констатируют атерогенность крови.

Среду для определения атерогенности крови готовят растворением 10 г ПВП (относительная молекулярная масса 12600±2700) в 100 мл 0,01М Трис-HCl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Среду добавляют к плазме крови, тщательно перемешивают, инкубируют и определяют помутнение в опытной пробе.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП для выявления атерогенности плазмы крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной плазмы крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) добавляют 100-800 мкл 10% раствора ПВП в 0,01М Трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Степень помутнение раствора определяют визуально по сравнению с контрольной пробой и оценивают как слабое помутнение - (+) и сильное - (++++). В качестве контроля используют пробы плазмы крови с соответствующим количеством буфера, не содержащего ПВП, и оценивают как - (-). Полученные результаты приведены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации ПВП в инкубационной системе с 7,1% до 8,9% наблюдается помутнение, обусловленное агрегацией ммЛП, с максимальным помутнением при 8,9% ПВП, т.е. при объемном соотношении плазма:среда (1:8). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 8,9% наблюдается снижение степени агрегации, которое характеризуется уменьшением мутности.

Для подтверждения агрегации ммЛП плазмы крови больных ИБС в 8,9% растворе ПВП нами была исследована пулированная плазма 10 здоровых доноров при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Добавление к пулированной плазме крови здоровых доноров возрастающих концентраций 10% ПВП не приводит к агрегации нормальных липопротеинов низкой и очень низкой плотности.

Пример 2. Определение содержания холестерина, триацилглицерола (ТАГ) и общих белков в ПВП-преципитатах. Для подтверждения наличия ммЛП в ПВП-преципитатах из плазмы крови были проведены следующие эксперименты. Из 0,5 мл пулированной плазмы больных ИБС и контрольных здоровых доноров были приготовлены ПВП-преципитаты в условиях 8,9% ПВП. Преципитат был осажден путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантировали, ПВП-преципитат 2 раза отмывали 8,9% раствором ПВП и ресуспендировали в 0,5 мл 0,01М Трис-НС1-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. В полученных ПВП-преципитатах определяли содержание холестерина, ТАГ и общих белков с использованием реактивов фирмы «Диакон» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, в ПВП-преципитате пулированной плазмы больных ИБС содержание холестерина в 12 раз, а ТАГ - в 16 раз больше, чем в ПВП-преципитате из плазмы здоровых доноров. Содержание общего белка в 1,3 раза выше в ПВП-преципитате больных.

Таким образом, наличие холестерина, ТАГ и общего белка в ПВП-преципитатах, приготовленных из пулированной плазмы крови, свидетельствует о липопротеиновой природе агрегатов, образующихся в присутствии 8,9% ПВП. Повышенный уровень ПВП-преципитата, содержащего ммЛП у больных с ИБС, является специфическим маркером атеросклеротического процесса.

Пример 3. Подбор оптимального времени инкубации смеси цельной плазмы крови с ПВП для агрегации ммЛП. К 50 мкл пулированной плазмы крови больных ИБС и здоровых доноров добавляют 400 мкл 10% раствора ПВП в 0,01 М трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10, 20, 30 и 60 мин в прозрачных пробирках. Степень помутнения определяют визуально. В качестве бланка используют пробы плазмы крови с соответствующим количеством 0,01 М Трис-НСl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, в пулированной плазме крови больных ИБС агрегация ммЛП протекает в течение 10 минут. В пулированной плазме крови визуально не определяется помутнение в течение 60 мин инкубации.

Таким образом, для выявления повышенного уровня [ммЛП] 10 минутная инкубация является оптимальной для рутинных исследований атерогенности крови экспресс-методом.

Пример 4. Определение связывания комплемента морской свинки преципитатами ммЛП из плазмы крови в зависимости от концентрации. К 10-160 мкл раствора ПВП-преципитата (4,3 мг/мл по белку), приготовленного из пулированной плазмы крови больных ИБС и разбавленного в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, добавляли 20 мкл раствора, разбавленного 1:19 комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS²⁺ и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и инкубировали 30 мин при 37°С. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину А₄₀₅ супернатанта. Контрольная проба не содержала ПВП-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

У (%)=[(X-R)/(H-R)×100],

где Н, R и X-величины оптической плотности A₄₁₂ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:

ССК (%)=100-У

Данные о степени связывания комплемента при разных концентрациях ПВП-преципитата приведены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, ммЛП, преципитированные в растворе 8,9% ПВП, обладают комплемент-связывающей способностью, причем эффект является дозо-зависимым.

Таким образом, определение комплемент-связывающей способности ПВП-преципитата свидетельствует о наличии ммЛП и о специфическом взаимодействии ммЛП с комплементом морской свинки. Определение холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитате при концентрации 8,9%, а также максимальная комплемент-связывающая способность подтверждает оптимальную концентрацию ПВП (8,9%) для специфической агрегации ммЛП из плазмы крови больных с атеросклеротической болезнью.

Пример 5. Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов. ммЛП были приготовлены в условиях 8,9% ПВП, как описано в примере 2. Для исследования агрегации тромбоцитов получали кровь из краевой вены уха кролика в 3,8% раствор цитрата натрия (9:1 по объему). Центрифугировали кровь при 150 g в течение 10 мин. Супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму (БТП) крови, использовали для анализа агрегации тромбоцитов. Исследования агрегации тромбоцитов проводили по методу Born [2] в модификации O'Brien [3, 4] с графической регистрацией на агрегометре фирмы Crono-Log Co. (США). Принцип метода основан на изменении оптической плотности БТП при добавлении индукторов агрегации. При агрегации суспензия тромбоцитов становится более прозрачной, и за счет падения оптической плотности светопропускание растет. Графически это отображается отклонением кривой от нулевой линии (0% агрегации) до 100% агрегации.

Ход определения: 0,25 мл ТБП помещали в кювету агрегометра, прогревали до 37°С в течение 1 мин при постоянном перемешивании и выставляли 0% агрегации. В опытную пробу вносили препарат ммЛП, дополнительно инкубировали в течение 4 мин и проводили агрегацию тромбоцитов введением индуктора АДФ (конечная концентрация 1,25 мкМ). Регистрировали агрегацию в течение 5 мин. За 100% агрегации принимали светопропускание пробы, содержащей 0,25 мл плазмы, обедненной тромбоцитами. В качестве параметров агрегации использовали максимальный процент снижения оптической плотности - В (%). Степень агрегации тромбоцитов при действии ммЛП характеризовали величиной В_оп/В_к, где В_оп и В_к - изменение светопропускания соответственно богатой тромбоцитами плазмы, содержащей ммЛП, и контрольного образца. Результаты представлены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, предварительное введение ммЛП при конечной концентрации 0,4 мкг/мл вызывает усиление агрегации, в то время как ПВП-преципитат из плазмы крови контрольной группы здоровых доноров практически не оказывает влияния на функцию тромбоцитов.

Таким образом, ПВП-преципитат, приготовленный из плазмы больных ИБС, вызывает гиперагрегацию тромбоцитов кролика.

Пример 6. Определение атерогенности крови у больных ИБС и здоровых доноров. Проведены исследования атерогенности плазмы крови предлагаемым экспресс-способом у 64 больных ИБС и 60 здоровых доноров (контрольная группа). К 50 мкл исследуемой плазме крови добавляли 400 мкл 10% ПВП в 0,01 М трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в прозрачных пробирках. Степень помутнения (атерогенность) определяли визуально по сравнению с контрольной пробой. В качестве контроля использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01 М Трис-НСl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Полученные результаты приведены в таблице 7.

В контрольной группе доноров атерогенность не выявлена ни у одного испытуемого. В то время как у больных ИБС атерогенность выявлена в 53 случаях, что составляет 79% обследованных больных ИБС.

Таким образом, из приведенных выше примеров следует, что:

1. 10 мин инкубация плазмы крови в 8,9% растворе ПВП обеспечивает полную преципитацию ммЛП;

2. В присутствии 8,9% ПВП из плазмы крови больных с ИБС преципитируют ммЛП, в то время как у здоровых доноров не наблюдается преципитация нативных ЛП;

3. Атерогенность ммЛП подтверждается двумя независимыми тестами (ммЛП способны связывать и активировать систему комплемента и вызывать гиперагрегацию тромбоцитов кролика);

Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание плазмы крови с раствором ПВП и визуальную регистрацию мутности. Для приготовления среды необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие ммЛП непосредственно в плазме без предварительного ее фракционирования. Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет проводить скрининг и выявлять людей с предрасположенностью к атеросклерозу на доклинических стадиях заболевания. Дальнейшие углубленные исследования таких пациентов позволят установить индивидуальную причину атерогенности крови и проводить этиотропную терапию на доклинической стадии атеросклероза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann. Med. - 1989. - V.21(6). - P.455-459.

2. Born G.V. Aggregation of bkood platelets by ADP and its reversal // Nature. - 1962. - V.194. - P.927-929.

3. O'Brien J.R. Platelet aggregation: Part I Some effect of the adenosine phosphates, thrombin, and cocaine upon platelet adehesiveness // J.Clin. Path. - 1962. - V.15, №5. - P.446-452.

4. O'Brien J.R. Platelet aggregation: Part II Some resalts from a new method of study // J. Clin. Path. - 1962. - V.15, №5. - P.452-455.

Таблица 1 Влияние ПВП на агрегацию множественно модифицированных липопротеинов (ммЛП) в пулированной плазме крови больных ИБС № Серии экспер. Сыв., мкл ПВП, 10%, мкл 0,9% NaCl % ПВП в системе Помутнение Раствора (Атерогенность) 1 Опыт 50 100 - 6,7% (-)   Бланк 50 - 100 0% (-) 2 Опыт 50 125 - 7,1% (+)   Бланк 50 - 125 0% (-) 3 Опыт 50 150 - 7,5% (++)   Бланк 50 - 150 0% (-) 4 Опыт 50 175 - 8,0% (++)   Бланк 50 - 175 0% (-) 5 Опыт 50 200 - 8,6% (+++)   Бланк 50 - 200 0% (-) 6 Опыт 50 400 - 8,9% (++++)   Бланк 50 - 400 0% (-) 7 Опыт 50 800 - 9,4% (++)   Бланк 50 - 800 0% (-)

Таблица 2 Влияние ПВП на агрегацию нативных липопротеинов в пулированной плазме крови здоровых доноров № Серии экспер. Сыв., мкл ПВП, 10%, мкл 0,9% NaCl %ПВП в системе Помутнение раствора (Атерогенность) 1 Опыт 50 100 - 6,7% (-)   Бланк 50 - 100 0% (-) 2 Опыт 50 125 - 7,1% (-)   Бланк 50 - 125 0% (-) 3 Опыт 50 150 - 7,5% (-)   Бланк 50 - 150 0% (-) 4 Опыт 50 175 - 8,0% (-)   Бланк 50 - 175 0% (-) 5 Опыт 50 200 - 8,6% (-)   Бланк 50 - 200 0% (-) 6 Опыт 50 400 - 8,9% (-)   Бланк 50 - 400 0% (-) 7 Опыт 50 800 - 9,4% (-)   Бланк 50 - 800 0% (-)

Таблица 3 Содержание холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитатах приготовленных из плазмы крови больных ИБС и здоровых доноров   Холестерин, мг/дл ТАГ, мкМ/л Белок, мг/мл ПВП-преципитат из сыворотки больных ИБС 4,6 117 4,3 5,1 117 4,5 5,2 116 4,2 М±m 4,97±0,32 116,7±0,6 4,3±0,2 ПВП-преципитат из сыворотки доноров 0,5 7 3,4 0,3 10 2,9 0,4 5 3,2 М±m 0,4±0,1 7,3±2,5 3,2±0,3

Таблица 4 Влияние времени инкубации сыворотки с 8,9% ПВП на агрегацию ммЛП в пулированной плазме крови больных ИБС Время инкубации, мин 10 20 30 60 [ммЛП] в пулированной плазме крови больных ИБС (+++) (+++) (+++) (+++) [ммЛП] в пулированной плазме крови доноров (-) (-) (-) (-)

Таблица 5 Степень связывания комплемента ммЛП в ПВП-преципитате в зависимости от концентрации [ммЛП], мкл 0 10 20 40 80 160 ССК, % 0 27 57 83 97 100

Таблица 6 Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов (индуктор АДФ, 1,25 мкМ/л) Пробы В, % B_оп/B_контр Контроль 22 1,0 Опыт (0,4 мкг/мл ммЛП, ПВП-прец. из пул. сыворотки больных ИБС) 36 1,64 Опыт (0,4 мкг/мл ПВП-прец. из пул. сыворотки контрольных доноров) 21 0,95

Таблица 7 Атерогенность (ммЛП) крови больных ИБС и здоровых доноров по результатам экспресс-анализа   Количество обследованных, n ммЛП ммЛП (+++) (-) n (%) n (%) Плазма крови больных ИБС 64 53 (79%) 11 (21%) Плазма контрольной группы доноров 60 0 60 (100%)

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для экспресс-определения атерогенности плазмы крови человека. Сущность изобретения состоит в том, что плазму крови обрабатывают средой, содержащей 10% раствор поливинилпирролидона. Атерогенность крови констатируют визуально при помутнении, наблюдаемом в опытной пробе. Использование способа позволяет в короткие сроки проводить скрининг и выявлять людей с предрасположенностью к атеросклерозу. Дальнейшие углубленные исследования таких пациентов позволят выявить индивидуальную причину атерогенности крови и проводить этиотропную терапию на доклинических стадиях атеросклероза. 7 табл.

Способ экспресс-определения атерогенности крови человека, заключающийся в том, что цельную плазму крови обрабатывают буфером, содержащим 10% поливинилпирролидон (ПВП) при объемном соотношении плазма: ПВП (1:8), инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и при визуальном определении помутнения в опытной пробе констатируют атерогенность крови.