СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В ИММУННЫХ КОМПЛЕКСАХ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК) в сыворотке крови человека.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения ХИК. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛПНП), при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения ХИК [1, 4].

Известны способы определения ХИК в сыворотке крови преципитацией их 2,5%, 3,5% и 4% растворами полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000). Агрегированные иммунные комплексы, содержащие множественно модифицированные ЛПНП (ммЛПНП), осаждают центрифугированием, промывают преципитат буфером, содержащим соответствующую концентрацию ПЭГ-6000 и определяют в преципитате холестерин после экстракции [2,5-7].

Недостатком приведенных способов является длительность процедуры, неполная преципитация иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, и как следствие - низкие значения ХИК.

В качестве прототипа использован способ определения уровня циркулирующих иммунных комплексов с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 [3].

Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа экспресс-определения уровня холестерина в иммунных комплексах для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (ЦИК-ммЛПНП), проводят путем обработки сыворотки крови человека буферным раствором, содержащим препарат ПЭГ-3350, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты ЦИК-ммЛПНП осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПЭГ-3350 и определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах с использованием ферментативного набора. При уровне содержания ХИК свыше 8,4 мг/дл констатируют повышенный уровень.

Способ определения ХИК включает:

1. Буфер-1 для преципитации ХИК содержит 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 в 0,01 М трис-HCl-буфере с pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;

2. Буфер-2 для растворения преципитата ХИК - 0,01 М Трис-HCl-буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.

Способ экспресс-определения холестерина иммунных комплексов осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина в иммунных комплексах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 для преципитации ХИК в соотношении 1:3, инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме Буфера-2. Содержание ХИК определяют с использованием ферментативного набора «Холестерин» и при содержании ХИК свыше 8,4 мг/дл констатируют повышенный уровень.

Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют гемолитическим методом с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×10⁸ кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (EA), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺).

Содержание IgG в составе преципитата определяют с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА) эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека, антителами барана против IgG человека. В качестве стандарта используют препарат человеческого IgG с концентрацией 1 мг/мл.

Этап 1. Подбор оптимальной концентрации ПЭГ-3350 для осаждения циркулирующих иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП (ЦИК-ммЛПНП) из пулированной сыворотки крови здоровых доноров.

1.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при возрастающих концентрациях ПЭГ-3350. К 100 мкл пулированной сыворотки крови здоровых доноров добавляют от 100 до 500 мкл раствора Буфера-1, тщательно перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием при 3100 g в течение 5 мин при 23°C. Супернатант тщательно декантируют и преципитат растворяют в 100 мкл Буфера-2.

1.2. Определение холестерина в ПЭГ-преципитатах. В преципитатах после растворения в 100 мкл Буфера-2 определяют содержание холестерина с использованием наборов реагентов фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице 1.

1.3. Определение степени связывания комплемента морской свинки циркулирующими иммунными комплексами в преципитатах, приготовленных при возрастающих концентрациях ПЭГ-3350. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺ добавляют 20 мкл раствора разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводят до 0,3 мл буфером VBS²⁺,и инкубируют 20 мин при 37°C. После предварительной инкубации добавляют 200 мкл EA и повторно инкубируют 30 мин при 37°C. После 30-минутной инкубации реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержит преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствует о наличии связывания комплемента циркулирующими иммунными комплексами. Степень лизиса эритроцитов (Y) определяют по формуле:

Y(%)=[(X-R)/(H-R)×100],

где H, R и X - величины оптической плотности A₄₀₅ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса EA и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяют по формуле:

CCK(%)=100-Y.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

1.4. Определение содержания IgG в ПЭГ-преципитате.

Предварительно титруют преципитаты иммунных комплексов, разведенные 1:99, на 12 лунок в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках. В качестве стандарта титруют препарат IgG с исходной концентрацией 1 мг/мл. После титрования преципитатов и стандартного препарата IgG добавляют равный объем разбавленного раствора антител против IgG человека, содержащего 4 гемагглютинирующие единицы (ГАЕ), т.е. препарат антител был разбавлен 1:8100. Тщательно перемешивают и добавляют равный объем 1% суспензии иммунных комплексов эрироцитов барана, сенсибилизированных антителами человека (EA_ч), тщательно перемешивают и инкубируют в течение 1-1,5 ч при комнатной температуре. После инкубации определяют для каждой пробы лунку, где наблюдается торможение гемагглютинации. Расчеты проводят с использованием результатов по торможению гемагглютинации стандартным раствором IgG человека. Полученные данные представлены в таблице 1.

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при концентрации от 7,5% до 8,0% ПЭГ-3350 в сыворотке наблюдается агрегация иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины (ммЛПНП). Дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ-3350 выше 8,0% в системе приводит к агрегации и преципитации нативных ЛПНП. Сохранение степени связывания комплемента на уровне 80% и возрастание концентрации холестерина в преципитатах при увеличении концентрации ПЭГ-3350 (более 7,5%) свидетельствует, с одной стороны, о полной агрегации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, с другой стороны, об агрегации нативных ЛПНП, которые не обладают комплемент связывающей способностью. Наличие IgG в преципитахах, приготовленных в присутствии ПЭГ, свидетельствует об иммунных комплексах, содержащих ммЛПНП, также как постоянный уровень IgG в преципитатах, полученных при концентрации ПЭГ от 7,5% и выше, свидетельствует о специфической преципитации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП.

Таким образом, при концентрации ПЭГ-3350 от 7,5% до 8,0% наблюдается избирательная агрегация и преципитация иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, и не наблюдается агрегация и преципитация как нативных ЛПНП, так и свободных IgG.

Этап 2. Определение содержания холестерина в иммунных комплексах в сыворотках крови доноров и неврологических больных с атеросклерозом каротидных артерий.

2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 7,5% ПЭГ-3350. К 100 мкл сыворотки крови больных с атеросклерозом каротидных артерий и относительно здоровых доноров добавляли 300 мкл буфера-1 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 23°C в течение 5 мин при 3100 g. Супернатант декантировали и осадок растворяли в 100 мкл буфера-2. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в группе относительно здоровых доноров средний уровень холестерина в иммунных комплексах составил 6,2±1,7 мг/дл при колебаниях от 2,3 до 8,4 мг/дл. Следовательно, уровень ХИК до 8,4 мг/дл можно предварительно считать нормальным уровнем у здоровых людей при использовании условий, разработанных в предлагаемом способе. В группе неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий в 100% случаев определяется повышенный уровень ХИК, и колебания составили от 11,0 до 38,0 мг/дл.

Таким образом, способ позволяет повысить точность количественного определения холестерина в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови человека. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволит проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, реализация изобретения позволит как контролировать эффективность проводимого лечения, так и выявлять доклинические состояния атеросклероза.

Литература

1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103.

2. Тертов В.В., Качарава А.Г., Саядян Х.С.и др. Холестеринсодержащие циркулирующие иммунные комплексы - компонент сыворотки крови больных с ишемической болезнью сердца, обуславливающий ее атерогенность // Кардиология. - 1989. - Т.29, №8. - С.35-38.

3. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ и тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов // Патент РФ №2452962 от 10.06.2012 г. Бюл. №16.

4. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V.61, №7. - P.679-689.

5. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.

6. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V.46, - P.93-98.

7. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V.127, №3. - P.394-400.

Таблица 1 Содержание холестерина, IgG в преципитатах и степень связывания комплемента (CCK) иммунными комплексами, содержащими ммЛПНП, приготовленными из пулированной сыворотки крови доноров, в зависимости от концентрации ПЭГ-3350 Концентрация ПЭГ-3350, % 5 6 6,7 7,1 7,5 7,8 8,0 8,2 8,3 Холестерин, мг/дл 3,0 6,9 9,3 11,0 13,1 14,2 14,5 20,0 21,8 IgG мг/мл 0,163 0,324 0,648 0,648 0,648 0,648 0,648 0,648 0,648 CCK, % 19 20 61 69 80 80 77 87 85

Таблица 2 Содержание холестерина иммунных комплексов (ХИК) в сыворотках крови доноров и неврологических больных Доноры ХИК, мг/дл Больные ХИК, мг/дл 1 5,2 1 11,0 2 6,4 2 26,1 3 2,3 3 20,9 4 4,5 4 15,9 5 9,2 5 18,5 6 6,4 6 20,4 7 5,0 7 10,6 8 6,0 8 24,9 9 5,3 9 21,0 10 5,7 10 18,3 11 6,8 11 20,6 12 7,8 12 31,3 13 8,4 13 10,6 14 6,2 14 14,0 15 7,4 15 38,0 M±m 6,2±1,7 M±m 20,1±7,7

Изобретение относится к лабораторной диагностике и может быть использовано для экспресс-определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК). Сущность изобретения состоит в том, что преципитат иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности из сыворотки крови человека готовят путем обработки ее буфером, содержащим 10%-ый ПЭГ 3350, в соотношении 1:3, инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Преципитат, содержащий ХИК, отделяют центрифугированием при 3100 g в течение 10 мин при 23°C, растворяют в буфере без ПЭГ, определяют содержание холестерина с использованием ферментативного набора и при уровне содержания ХИК свыше 8,4 мг/дл констатируют повышенный уровень. Изобретение позволяет повысить точность количественного определения ХИК, проводить широкие скрининговые исследования для выявления атеросклероза как на доклинической стадии, так и контролировать эффективность проводимой терапии. 2 табл.

Способ экспресс-определения уровня холестерина в иммунных комплексах (ХИК), включающий приготовление преципитата из сыворотки крови человека в растворе полиэтиленгликоля, его центрифугирование, растворение, определение содержания холестерина с использованием стандартных ферментативных наборов, отличающийся тем, что преципитат готовят путем обработки сыворотки крови буфером для преципитации ХИК, содержащим 10% ПЭГ 3350, в соотношении 1:3, инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, центрифугировании при 3100 g в течение 10 мин при 23°C, и при уровне содержания ХИК свыше 8,4 мг/дл констатируют повышенный уровень.