СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ Российский патент 1995 года по МПК C07K1/00 

Изобретение относится к твердофазному синтезу аналога гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (ЛН-рилизинг гормона), путем метода минимальной защиты.

Аналоги ЛГ-рилизинг гормона (далее упоминается как ЛГ-РГ) представляют собой нона- или декапептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ и проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-PГ. Аналоги являются предметом широкого клинического исследования вследствие их продемонстрированной способности облегчать симптомы эндометриоза, рака предстательной железы, преждевременного полового созревания и других гормонально-опосредованных заболеваний. Несмотря на то, что определенные аналоги ЛГ-РГ в настоящее время пригодны для терапевтического использования, их синтез является сложным процессом, а следовательно, и дорогостоящая методика их получения повышает стоимость аналогов, так необходимых при лечении. Аналоги ЛГ-РГ традиционно описываются либо как агонисты, либо как антагонисты, в зависимости от образа их действия.

Аналоги ЛГ-РГ в соответствии с изобретением представляют собой нона- и декапептиды и включают как агонистов, так антагонистов. Примерами агонистов ЛГ-РГ, являющихся пригодными в настоящем изобретении, могут стать нафарелин, лейпрорелин, бусерелин, госерелин, гистерелин, трипторелин, и деслорелин, причем они отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения замещением остатка глицина в положении 6 D-аминокислотой. Синтетические агонисты имеют заодно с гормоном природного происхождения, гистидин в положении 2, серин в положении 4, и тирозин в положении 5, причем все эти остатки имеют реакционоспособные боковые цепи, которые могут стать синтетическими трудностями.

Антагонисты ЛГ-РГ отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения, как правило, делецией или замещением остатка гистицидина в положении 2. С точки зрения синтетической перспективы делеция гистидина снижает вероятность возникновения нежелательных побочных реакций, однако, присутствие серина и тирозина все же требует принятия специальных мер с целью устранения возникновения побочных цепных реакций.

Аналоги ЛГ-РГ могут быть синтезированы различными методами, такими, как например, описанные ДжМ.Стюартом и Дж.Д.Янгом, Твердофазный Пептидный Синтез, Уи. Х. Фриман Ко. Сан-Франциско, 1969; Дж.Мейненхофером, Гормональные Белки и Пептиды, Том 2, стр.46, Академик Пресс (Нью-Йорк), 1973; и Е.Шредером и К.Любке, Пептиды, Том l", Академик Пресс (Нью-Йорк), 1965. Методы могут быть в широком смысле охарактеризованы либо как растворно-фазные, либо как твердо-фазные методики. Оба метода включают последовательное прибавление аминокислот в растущую пептидную цепь. Обычно, или амино-, или карбоксильную группу первой аминокислоты защищают посредством пригодной защитной группы. Защищенную аминокислоту затем можно либо присоединить к инертному твердому носителю либо использовать в растворе путем прибавления следующей защищенной аминокислоты в последовательности при условиях, пригодных для образования амидной связи. Защитную группу затем отщепляют от этого вновь прибавленного аминокислотного остатка, после чего осуществляют прибавление следующей аминокислтоы, и так далее. После того, как все требуемые аминокислоты присоединены в должной последовательности, любые оставшиеся защитные группы и любой твердый носитель удаляются с получением конечного полипептида. Путем простой модификации данной общей методики можно прибавить более одной аминокислоты за одно время в растущую цепь, например, путем сочленения защищенного трипептида с защищенным дипептидом, что позволяет получить пентапептид.

Более строгие условия твердофазного синтеза обычно требуют, чтобы любые реакционноспособные боковые цепи на аминокислотах были защищены во время образования амидной связи. Защитные группы боковой цепи обычно отщепляют в отдельной стадии после отщепления образованного полипептида от инертного носителя, или совместно с этим отщеплением.

Один особенно пригодный метод твердофазного синтеза с целью получения аналогов ЛГ-РГ описан в патенте США N 4234571 (Нестор и др.), раскрытие которого введено в данное описание в качестве отсылки. При таком общем подходе функцию α -амино (N^α ) каждой аминокислоты защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию, такой, как трет-бутилоксикарбонил (Вос); любые реакционноспособные боковые цепи, как например, присутствующие на серине, гистидине и тирозине, также защищают сильно связанными группами, которые требуют обработки фторoводородом (HF) или подобных радикальных методик, для их отщепления. Кроме того, отщепление -аминозащитных групп и защитных групп в боковой цепи обычно осуществляют в отдельной стадии. Данный подход является достаточным для получения исследовательских количеств пептидов, однако при крупномасштабном производстве пептидов эти методы являются недостаточными. Аминокислоты с полностью защищенными боковыми цепями являются дорогостоящими, а такие расходы могут стать существенным фактором при коммерческом производстве пептидов. Кроме того, использование фтороводорода, не говоря уже об отравлении окружающей среды, приводит к коммерчески неприемлемым потерям в выходе продукта. И что более важно, вследствие использования отдельной производственной стадии для отщепления защитных групп боковой цепи синтетический процесс требует дополнительного времени и стоимости.

Альтернативные способы не более привлекательны. Тиен и др. Pept. Chem. 375-379, Т, Шиба и С.Сакакибара (Ред.), Организация по Исследованию Белков, Осака (1088), изложили синтез ЛГ-РГ с использованием тозил-защиты относительно гистидина и бензил-защиты относительно тирозина и серина. Данный подход устраняющий необходимость использования фтороводорода, все же предполагает наличие отдельной стадии дегидрирования с целью отщепления бензил-защитных групп; при этом происходит некоторое восстановление триптофана.

Кой Д.Х. и др. Int. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), приводят синтез антагонистов ЛГ-РГ, (D-Phe², D-Trp³, D-Jhe⁶) ЛГ-РГ, с использованием целого ряда методов защиты боковой цепи, при этом все они предполагают освобождение HF от защиты; в результате чего обеспечивается бензил-защита боковой цепи только серина, тозил-защита боковой цепи только аргинина, защита боковой цепи серина и аргинина, а также защита боковой цепи серина, аргинина и тирозина (с 2-бромбензил-оксикарбонилом). Солевая защита аргинина (в виде Arg HCl) также используется в синтезе "только серина". Фтороводород используют для отщепления неочищенного пептида от его носителя, а также для отщепления защитных групп боковой цепи. Только когда пептид "полностью" незащищен (и только солевая защита относительно аргинина), тогда только авторы патента могут избежать фторидной обработки. Все виды синтеза с защитой приводят к плохим результатам по сравнению с синтезом с незащищенной боковой цепью.

Кой и др. далее приводят синтез агониста ЛГ-РГ: этиламида (D-Leu⁶, дес Gly-NH₂¹⁰)-ЛГ-РГ, с использованием защиты боковой цепи динитрофенилом относительно только гистидина, солевой защиты аргинина, но без обработки HF. Динитрофенильную защитную группу боковой цепи отщепляют во время отщепления пептида от его носителя с помощью раствора этиламина в диметилформамиде. Выход в результате синтеза с защитой только гистидина составляет лишь 34% по сравнению с выходом в результате синтеза с полной защитой и обработкой HF. Отсутствует сравнение с незащищенным синтезом.

Известные технические решения предполагают, что среди различных стратегий минимальной защиты защита только гистидина может привести к повышению выхода по сравнению с синтезом на основе полной защиты в отношении некоторых антагонистов ЛГ-РГ, однако никакой определенной выгоды нельзя извлечь в результате рассмотрения приведенных подходов к защите боковой цепи в отношении агонистов ЛГ-РГ.

Тем временем, как идеальный подход к устранению стадии освобождения от защиты HF можно осуществлять в отношении незащищенного синтеза, отсутствие защиты для гистидина приводит к избыточной рацемизации. В соответствии с доктриной Коя и др. заявитель, однако, обнаружил, что использование защиты только гистидина также приводит к получению высоких уровней примеси бис-серина, вследствие ацилирования остатка серина. С целью достижения синтеза с минимальной защитой в отношении аналогов ЛГ-РГ без проведения стадии освобождения от защиты необходимо значительное усовершенствование по сравнению с известными техническими решениями, которое может также обеспечить защиту для тех групп, которые, когда незащищены, оказывают отрицательное влияние на чистоту и выход пептида.

Целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, в котором защищены боковые цепи только минимального числа аминокислотных остатков.

Другой целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, который устраняет необходимость освобождения от защиты HF, а также необходимость использования токсичного HF-реагента, уменьшая токсичный отработанный поток, часто встречающийся в традиционных способах.

Упомянутые аспекты изобретения создают дополнительные преимущества, заключающиеся в снижении стоимости получения соединений лГ-РГ, а также в устранении дополнительной стадии отщепления защитных групп боковой цепи.

Цели изобретения достигаются в отношении аналогов ЛГ-РГ с использованием способа временной минимальной защиты, при которой только гидроксильная боковая цепь аминокислотного остатка защищена группой, которую отщепляют сразу же после связывания серина с пептидной цепью. Защитная группа боковой цепи является группой, лабильной при тех же условиях, которые пригодны для отщепления α-амино защитных групп. Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые содержат остаток гистидина, боковую цепь имидазола также можно защитить группой, лабильной в течение цикла связывания, преимущественно, лабильной для агента разблокировки α -аминогруппы, однако, по выбору, она может быть защищена группой, отщепляемой аминозилом или аммонолизом.

Временная защита боковой цепи серина и защита боковой цепи гистидина, если только имеется в наличии, минимизирует образование примесей и максимизирует выход продукта без необходимости в стадии освобождения от защиты HF.

Способ временной минимальной защиты в соответствии с изобретением приемлем для твердофазного синтеза любого сериносодержащего полипептида, имеющего от нескольких до множества остатков, не взирая на остальную часть последовательности. Аналоги ЛГ-РГ, а также другие нона- и декапептиды являются предпочтительными синтетическими мишенями.

Несмотря на то, что изобретение описано с учетом последовательного прибавления отдельных аминокислот, специалист в данной области техники поймет, что способ в равной мере приемлем для синтеза, в котором блоки меньших полипептидов связывают с образованием более крупных полипептидов, например, путем прибавления тетрапептида к пентапептиду, при условии, что боковая цепь остатков серина временно защищена в течение цикла связывания серина.

Временная защита означает, что боковая цепь серина защищена в течение относительно короткого периода синтетического цикла. Защитная группа боковой цепи и α-амино и карбоксильная защитная группа отщепляются одновременно после осуществления связывания серина. Как правило, решающим критерием отбора защитной группы боковой цепи серина является тот факт, чтобы группа была устойчивой к условиям связывания, однако лабильной к условиям освобождения от защиты α-аминогруппы. В одном варианте настоящего изобретения с использованием α-аминозащиты боковую цепь серина предпочтительно защищают группой, выбранной из трет-бутила, трет-бутилдиметилсилила, триметилсилила, тритила, пивалила и тетрагидропиран-2-ила.

Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые имеют остатки гистидина, как правило, желательно защищать боковую цепь имидазола. Эта защита также может иметь разновидность временной, то есть лабильной во время цикла связывания, или может оставаться на месте до тех пор, пока пептид не будет отщеплен от своего носителя. Предпочтительно, аминолиз или аммонолиз используют для отщепления полимера от своего носителя, и одновременно отщепляют защитную группу для гистидина.

В другом варианте изобретения агент разблокировки выбирают из растворов хлористого водорода в С₃-С₆-спиртах и дихлорметане. Предпочтительно, отношение спирта к дихлорметану составляет от 0,1 до 10,0 (об.), а концентрация кислоты составляет от 2 до 9 н. Наиболее предпочтительно, спиртом является изопропанол.

Сокращения и Определения
Для изобретения выражение "ЛГ-РГ" относится к гормону, высвобождаемому лютеинизирующий гормон, и "аналоги Лг-РГ" подразумевают сам ЛГ-РГ, а также другие полипептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ или происходят от него, и которые проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-РГ.

Сокращения для различных традиционных аминокислот рекомендованы Комиссией по Биохимической Номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии Международного биохимического союза (ИЮПАК-МБС), Биохимия, 11, 1726 (1972). Все упоминаемые здесь пептидные последовательности написаны в соответствии с общепринятой конвенцией, где N концевая аминокислота находится слева и С-концевая аминокислота находится справа.

Сокращения, приводимые здесь, представляют L-аминокислоты, за исключением ахирального аминокислотного глицина, и за другим исключением любой ненатуральной аминокислоты, которая является ахиральной, или же аминокислоты обозначены как D- или D, L-. Et обозначает этил. Bu обозначает бутил и iPr обозначают изопропил. Другие сокращения, пригодные при описании изобретения, включают замещения аминокислот в натуральном пептиде ЛГ-РГ следующими аминокислотными остатками:
Аминокислотный Сокращение
остаток 3-(2-нафтил)аланил Nal (2) 3-(п-фторфенил)аланил р-F-Phe 3-(п-хлорфенил)аланил р-Cl-Phe 3-(3-пиридил)аланил Pal (3)
N^G,N^G'-бис(этил)гомо- аргинил hArg (Et)₂
N^G,N^G'-бис(2,2,2-
трифторэтил)гомо- аргинил hArg (CH₂CF₃)₂ N^G-бутил-гомоаргинил hArg (Bu) N^E-Изопропил-лизил Lys (iPr) (бензил)гистидил His (Bzl)
Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность родственного соединения без побочных токсикологических эффектов. Примерами таких солей являются кислые аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и так далее; и соли, образованные органическими кислотами, такими, как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфокислота, нафталиндисульфокислота, полигалактуроновая кислота и так далее.

Сокращение "N-Ac" относится конкретно к N-ацетил-защитной группе, то есть, ацетильной группе, присоединенной к концевому аминокислотному осстатку на аминном азоте, в соответствии с общепринятой номенклатурой.

Предпочтительные варианты
В одном варианте осуществления изобретения предлагается усовершенствованный способ минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения, имеющего аминокислотную последовательность формулы:
R¹-R²-R³-Ser-Tyr-R⁴-Leu-R⁵-Rro-R⁶ (1) где R¹ выбирают из (пиро) Glu и N-Ac-D-Nal (2); R² выбирают из His. D-p-Cl-Phe и D-p-F-Phe; R³ выбирают из Trp. D-Trp. R⁴ выбирают из D-Nal- (2), D-hArg (Et)₂. D-hArg (Bu), D-hArg (CH₂CF₃)₂. R⁵ выбирают из Arg, L-hArg (Et)₂, D-hArg (Bu), D-hArg- (CH₂CF₃)₂. R⁶ выбирают из Cly-NH₂, D-Ala-NH₂, причем аминокислоты обеспечены N^α -защитой, отличающийся тем, что осуществляют (а) временную защиту боковой цепи серина в положении 4, пригодно, с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления α-аминозащитных групп, без проведения рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от его полимерного носителя, и (b) защиту боковой цепи гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к агенту разблокировки α-аминогруппы или к аминолизу или аммонолизу.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ временной минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения формулы (l), в котором (а) защищают α-аминогруппы аминокислот в полипептиде, (b) защищают боковую цепь серина с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления α-аминозащитной группой, (с) защищают боковую цепь гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к основным агентам разблокировки или группе отщепляемой аминолизом или аммонолизом, (d) привязывают С-концевую аминокислоту к инертному твердому носителю, (е) последовательно связывают, с помощью пригодного связующего средства, одну или более отобранных аминокислот одна с другой в последовательных циклах, начиная с С-конца, (f) отщепляют, к концу каждого цикла, защитные группы путем обработки агентом разблокировки, причем указанный агент разблокировки выбирают из агентов, способных отщеплять как α -аминозащитную группу, так и защитную группу боковой цепи, без рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от полимера, (g) повторяют стадии связывания и отщепления с образованием нона- и декапептида, (h) отщепляют полипептид от носителя аминолизом или аммонолизом и (i) выделяют и очищают полученный полипептид.

В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ твердофазного синтеза соединения формулы l, в котором (а) связывают твердофазным синтезом соответствующий Вос-защищенный и трет-бутил-защищенный серин в последовательных циклах и в порядке справа налево относительно аминокислотной последовательности соединения формулы l, начиная с Вос-R6-O-, ковалентно связанного с инертным твердым носителем, (b) отщепляют, в начале каждого цикла, Вос-защитную группу и одновременно трет-бутиловую группу от серина или D-серина путем обработки агентом разблокировки, выбранным из HCl/CH₂Cl₂ HCl (низший алканоил) СH₂Cl₂, с образованием полипептидной связи с ука- занным твердым носителем, (с) отщепляют полипептид от носителя аммонолизом и (d) выделяют полученный полипептид.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагается способ, описанный выше, для получения полипептида, имеющего приведенную выше формулу, где R¹ обозначает (пиро) Glu или N-Ac-D-Nal (2); R²обозначает His или D-p-Cl-Phe; R³ обозначает Trp; R⁴ обозначает D-Nal (2), D-hArg (Et)₂; R⁵ обозначает Arg или L-hArg (Et)₂ и R⁶ обозначает Gly-NH₂, или D-Ala-NH₂.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения функцию α-амино (N^α) аминокислот защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию. Защитная группа устойчива к условиям образования пептидной связи, хотя легко отщепляется без разрушения растущей пептидной цепи или рацемизизации любого из хиральных центров, содержащихся в ней. Пригодными защитными группами являются трет-бутоксикарбонил (Вос), бифенилизопропилоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, α, α -диметил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, о-нитрофенилсульфенил, 2-циано-трет-бутилоксикарбонил, 9-фторэнилметилоксикарбонил (Fmoc) и так далее. Предпочтительно α -аминозащитной группой является трет-бутоксикарбонил (Вос). Когда желательно получить пептид такой, как бусерелин или госерелин, в котором R⁴ в Формуле (1) выше обозначает D-Ser (трет-Bu), Fmoc является предпочтительным для N^α -защиты в циклах связывания, включающих и следующих за прибавлением D-Ser (tBu). Fmoc является лабильным и к основным реагентам (рН 8,5), таким как пиперидин, который не отщепляет tBu от D-Ser (tBu). В последних циклах после прибавления D-Ser (tBu) необходимо использовать чувствительную к основанию N^α -защиту. Боковую цепь серина в положении 4 защищают группой, которая может быть отщеплена, например, мягкой фторидной обработкой. Предпочтительной защитной группой боковой цепи серина является трет-бутилдиметилсилил.

Гидроксильную боковую цепь остатка серина защищают во время связывания серина с растущим пептидом, как описано для общего варианта настоящего изобретения. Защитную группу боковой цепи отщепляют после связывания и перед прибавлением следующей аминокислоты. Защитную группу боковой цепи серина отщепляют тем же реагентом, который используют для отщепления N^α -защитной группы. Предпочтительными защитными группами боковой цепи серина являются трет-бутил, трет-бутилдиметилсилил, триметилсилил, тритил, пивалил и тетрагидропиран-2-ил.

Кроме того, также защищают имидазоловую боковую цепь гистидина, обычно присутствующего в агониcтах ЛГ-РГ. Защитная группа боковой цепи гистидина может быть также лабильной во время цикла связывания, например, лабильной к агенту разблокировки N^α -группы, однако, необязательно, ее отщепление может быть осуществлено, когда пептид отщеплен от его носителя. Предпочтительными защитными группами боковой цепи для гистидина являются п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил.

Для инициации синтеза первую аминокислоту, которой, как правило, является С-концевая аминокислота в конечном продукте, присоединяют к пригодному твердому носителю. Пригодными твердыми носителями в вышеуказанном синтезе являются те материалы, которые инертны к реагентам и реакционным условиям ступенчатых реакций конденсации-разблокировки, а также нерастворимы в используемых средах. Примерами коммерчески приемлемых полимеров являются стирол/дивинилбензоловые полимеры, модифицированные реакционноспособной группой, например хлорметилированный стирол-дивинилбензоловый сополимер, гидроксиметилированный стирол/дивинилбензоловый сополимер и так далее. Пpедпочтительным является полимер Merrifield (1% сшитый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола).

Присоединение к полимеру, например, хлорметилированному стирол-дивинилбензоловому полимеру, осуществляют при помощи взаимодействия N^α -защищеннoй С-концевой аминокислоты, особенно, N^α -Вос аминокислоты, в виде ее цезиевой, тетраметиламмониевой, триэтиламмониевой, 1,5-диазабицикло(5.4.0)ундец-5-еновой или аналогичной соли в этаноле, ацетонитриле, N,N-диметилформамиде (ДМФ) и так далее, особенно, цезиевой соли в ДМФ, с хлорметилированным полимером при повышенной температуре, например, около 40-60^оС, предпочтительно, около 50^оС, в течение периода времени около 12-72 часов, предпочтительно, около 48 часов.

Связывание последующих защищенных аминокислот осуществляют хорошо известными методами, обычно в автоматизированном пептидном синтезаторе. Каждую защищенную аминокислоту интродуцируют приблизительно при 1,5-2,5-кратном молярном избытке, и связывание осуществляют в инертном, неводном, полярном растворителе, таком как дихлорметан, ДМФ или их смеси, предпочтительно, в дихлорметане, при температуре почти комнатной. Связующий агент выбирают из N, N'-дициклогексилкарбодимида (ДЦК), N,N'-ди-изо-пропилкарбодиимида (ДИК) или другого карбодиимида, либо в отдельности, либо в присутствии 1-гидроксибензотриазола (HBt), О-ацилмочевин, бензотриазол-Δ-ил-окси-трис(пирролидино фосфоний) гексафторфосфата (РуВор), N-гидроксисукцинимида, других N-гидроксиимидов или оксимов. Альтернативно, могут быть использованы активные сложные эфиры защищенных аминокислот (например, п-нитрофенил, пентафторфенил и тому подобное) или симметрические ангидриды.

Пептидный полимер проверяют на полное связывание с использованием Теста Кайзера (Anal. Biochem. 34, 595 (1970) за исключением того, что в случае связывания с пролином используют Тест Хлоранила (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) или Тест Изатина (Anal. Chim. 118, 149 (1980)).

Если тест (ы) на полноту показывают, что реакция не завершена, связывание повторяют с использованием дополнительной аминокислоты, однако, опуская разблокировку дополнительной кислоты. Когда последнее связывание завершено, полимер промывают метанолом или метанолом, содержащим дихлорметан, и сушат при максимальной температуре 60^оС.

В конце каждого цикла, то есть, после каждого прибавления следующей N^α -защищенной аминокислоты в растущую полипептидную цепь, защитную группу отщепляют путем обработки агентом разблокировки. При добавлении серина агент разблокировки удаляет как N -Вос-защитную группу, так и серин-защитную группу. Среди предпочтительных агентов разблокировки следует упомянуть хлорoводород в дихлорметане (HCl/-CH₂Cl₂), трифторуксусную кислоту в дихлорметане (ТФК/СH₂Cl₂) и хлороводород, растворенный в С₃-С₆-спирте, предпочтительно, изопропаноле, смешанном с дихлорметаном. как правило, концентрация HCl составляет от 2 н. до 9 н. предпочтительно от 4 н. до 5 н. Отношение CH₂Cl₂ к С₃-С₆-спирту составляет 0,1-10 (объемн.); предпочтительно, около 1:1. Особенно предпочтительным агентом разблокировки является 4,5 н. раствор HCl в i-PrOH: CH₂Cl₂ (1:1). Стадия разблокировки обычно имеет место при температурах от 0 до 45^оС, предпочтительно при температурах окружающей среды (от 20 до 27^оС).

Специалист в данной области техники поймет, что отбор протокола связывания/разблокировки с использованием агентов иных, нежели, описаны выше, является правильным при условии, что остаток серина освобожден от защиты с помощью агента, который отвечает целям изобретения. Можно использовать методику с применением HCl/iPrOH/CH₂Cl₂ для каждого цикла освобождения от защиты. Альтернативно, также приемлем смешанный метод, в котором ТФК/CH₂Cl₂ используют для определенных циклов, а HCl/iPrOH/CH₂Cl₂ для других. Специалисту станут понятны и другие циклы.

В конце твердофазного синтеза полипептид отщепляют от полимерного носителя. Отщепление проводят с помощью аммонолиза насыщенным раствором аммиака в пригодном растворителе для пептидов с С-концом аланина или глицина; для пептидов, имеющих С-конец пролина, отщепление осуществляют при помощи аминолиза алкиламином или фторалкиламино. Отщепление проводят при температуре приблизительно от 10 до 50^оС, предпочтительно, около 25^оС, в течение периода времени около 12-24 ч, предпочтительно, около 18 ч. Пригодные растворители включают метанол, этанол, изопропанол, диметилформамид, тетрагидрофуран, N,N-диметилэтаноламин, гексаны и их смеси. Предпочтительно, используют насыщенный раствор аммиака в метаноле. Альтернативно, пептид может быть отщеплен от полимера путем трансэстерификации основанием с последующим аминолизом. Затем полипептид очищают с использованием последовательности хроматографических стадий, применяя любой или все следующие типы: ионообменная хроматография на слегка основной смоле в ацетатной форме; гидрофобная абсорбционная хроматография или недериватизированная полистирол-дивинил-бензоловая (например, Amberlite XAD) хроматография; абсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; распределительная хроматография (например, на Sephadex G-25) или противоточное распределение; жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР), особенно, обращеннофазная ЖХВР на колонке с октил- или октадецилсилил-кремнеземом.

Если рацемическую аминокислоту используют в одном или более положениях 1, 2, 3 или 6, и отдельные изомерные продукты представляют интерес, диастереомерные нонапептидные или декапептидные конечные продукты подвергают разделению после чего искомый полипептид, содержащий D-аминокислоту в соответствующем положении, выделяют и очищают, предпочтительно, во время осуществления вышеописанной хроматографической методики. Выделенный и очищенный полипептид, необязательно, превращают в фармацевтически приемлемую соль.

Следующие примеры сравнивают способ временной защиты настоящего изобретения с незащищенным способом как для агониста ЛГ-КРГ, так и для антагониста ЛГ-РГ. Эти примеры представлены для целей только лишь специфичности и не должны ограничивать объем заявленного изобретения.

В обоих продуктах примеров 1 и 3, использующих способ минимальной защиты изобретения, находится значительно меньшее количество примесей по сравнению с продуктами, полученными в примерах 2 и 4, использующих незащищенный синтез.

Кроме меньшего числа примесей, способ настоящего изобретения отличается дополнительными преимуществами в смысле более высоких выходов продукта и использования менее опасных реагентов, в течение более короткого периода времени и с меньшими расходами энергии при выделении и очистке аналогов ЛГ-РГ. Дополнительным преимуществом является производство меньших количеств значительно менее токсичного отработанного потока.

Получение А.

Получение Вос-Gly-O-Полимера.

4,9 г N^α -Вос-глицина растворяют в смеси 50 мл метанола и 50 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до 7,5 водным бикарбонатом цезия. Затем растворитель удаляют в вакууме. Через 18 ч сушки под высоким вакуумом остаток растворяют в 150 мл сухого ДМФ. Прибавляют 25 г в 1% хлорметилированного полистирол/дивинилбензолового (Merrifield) полимера (соответствует 25 ммоль хлорида). Смесь встряхивают при 50^оС течение 24 ч, фильтруют и полимер промывают последовательно ДМФ, водой и этанолом. Полимер сушат в вакууме в течение 3 дней с получением 28,34 г Boc-Gly-О-Полимера.

Получение В.

Получение Вос-Ala-О-Полимера.

В соответствии с методикой Получения A N^α-Boc-D-аланин прибавляют к 1% полимеру Merrifield с получением N^α-Boc-D-Ala-O-Полимера.

П р и м е р 1. Синтез нафарелина с использованием минимальной защиты серина.

В данном примере нафарелин получают с использованием следующего метода защиты боковой цепи: солевая защита относительно аргинина (в виде хлорида), тозиловая защита относительно гистидина и трет-бутиловая защита относительно серина.

N^α-Вос-аминокиcлоты получают из Бачем (Торанс, Калифорния) (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp и Gly). Стар Биокемикал (Торранс, Калифорния) (Pro и Ser (tBu), Свинте Тех (Олбани, Орегон), (D-Nal (2).

4,0-4,5 н. растворы HCl в i-PrOH/CH₂Cl₂ (1/1) получают барботажем HСl в холодный i-PrOH. После насыщения раствора (определено титрованием: приблизительно 9 н.) его сохраняют при комнатной температуре не более 3 дней и разбавляют равным объемом CH₂Cl₂ перед использованием.

1,0 ммоль N^α-Boc-Gly-O-полимера из Получения А помещают в реактор автоматизированного твердофазного пептидного синтезатора Века 296 объемом 5,0 л, снабженного вспомогательными пробирками и колбами для прибавления реагентов и для создания повышенного давления, сбрасывания давления и поддержания инертной атмосферы азота.

Следующие аминокислоты прибавляют к N^α -Boc-Gly-O-полимеру путем DIC или HBt содействующего DIC -связывания в течение 3 ч: N^α-Boc-Pro (2,0 экв,); N^α-Boc-Arg. HCl (2,0 экв. ); N^α-Boc-Leu, H₂O (2,0 экв.); N^α-Boc-D-Nal (2) (1-5 экв.)/HBt; N^α-Boc-Tyr (1,5 экв,)/HBt; N^α-Boc-Ser (tBu) (2,0 экв)/HBt; N -Bic-Trp (1,75 экв.)/-HBt; N^α-Boc-His (Tos) (1,75 экв.)/HBt; (пиро) Glu (2,5 экв.)/-HBt.

Для отщепления N^α -защитной группы после каждого прибавления используют следующие методики.

Программа А: полимер вначале промывают CH₂Cl₂ 1 х 1 мин, ТФК СH₂Cl₂ (40/60) 1 х 1 мин, ТФК СH₂Cl₂ (40/60) 1 х 30 мин, CH₂Cl₂ 5 х 1 мин, Et₃ N CH₂Cl₂ (5/95) 3 х 1 мин, CH₂Cl₂ 4 х 1 мин.

Программа В: полимер вначале промывают CH₂Cl₂ 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н HCl в CH₂CL₂/i-PrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH₂Cl₂/i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, CH₂Cl₂ 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Еt₃ N CH₂Cl₂ (5/95) 3 x 1 мин, ДМФ 1 x 1 мин, СH₂Cl₂ 4 х 1 мин.

Программу А используют для отщепления N^α-защитных групп на Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) и Tyr. Программу В используют для отщепления N^α-защитных групп на Ser, Trp и His, а также для отщепления защитной группы боковой цепи серина.

После осуществления каждой стадии освобождения от защиты и промывки в соответствии с Пpотоколом А или В, следующую аминокислоту в последовательности прибавляют к полипептидной цепи и полимер промывают CH₂Cl₂ 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и CH₂Cl₂ 4 х 1 мин. После построения последовательности пептид отщепляют от полимера путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле при температуре около 25^оС в течение 18 ч.

Неочищенный пептид растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-Х4А (Био-Рад), после чего ацетат растворяют в минимальном количестве метанола, и прибавляют ацетон с целью преципитации пептида. Обращеннофазовую ЖХВР (Partisil ODS-3, 40 мкм, ацетонитрил с 0,5% уксусной кислотой) используют для удаления полярных и неполярных примесей. Фракции, содержащие по крайней мере 97% наферелин-ацетата, объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР и промывают 1% уксусной кислотой в воде. Остаток преципицируют, фильтруют, промывают и сушат под вакуумом. Аминокислотный анализ осуществляют на аминокислотном анализаторе Бекман 119СL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют 4 н. раствором CH₃SO₃H (0,2% -3-(2-аминометилиндол)HCl) в течение 20 часов при температуре 110^оС.

Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием колонки ODS-11 из Олтех, 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыска, расход 1,5 мл/мин, 27,5% CH₃CN, 72,5% 0,16 М КР₂РО₄, рН 5,1, температура 40^оС. ЖХВР анализ неочищенного пептида показывает основной пик с временем удерживания 18 мин в отношении нафарелина и отсутствие примесей в присутствии 1% при величине времени удерживания 14 мин.

П р и м е р 2. Синтез нафарелина без защиты серина.

Повторяют методику примера 1 за исключением того, что вместо N^α-Boc-Ser (tBu) используют N^α-Boc-Ser.

ЖХВР -анализ показывает основной пик со временем удерживания 18 минут в отношении нафарелина, а также от 8,1 до 11,5% примеси при времени удерживания (ву) 14 мин.

Кроме того, выход в результате этого "незащищенного" синтеза приблизительно равен выходу в результате полностью защищенного синтеза с использованием обработки фтороводородом; в последнем случае выход продукта значительно ниже того, который достигнут в результате синтеза с временной защитой Примера 1.

П р и м е р 3. Синтез антагонистов ЛГ-РГ с использованием временной защиты серина.

В данном примере антагонисты ЛГ-РГ, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et₂) Leu-hArg (Et₂) Prp-D-Ala NH₂, получают с использованием следующего протокола защиты боковой цепи: солевая защита относительно L- и D-hArg (Et₂) (в качестве хлорида) и трет-бутиловая защита серина. N^α-Вос-аминокислоты получают из Бачем (Торранс, Калифорния) )D-Ala, Arg и Leu); Стар Биокемикалз (Торранс, Калифорния), (Pro); Синте Тех (Олбани, Орген) (D-Nal (2)), Инцель (Милуоки, Висконсин) (D-Pal (3)) и UCB Бaйопродактс (Бельгия) (p-Cl-Phe).

Аминокислоты прибавляют к Na^α-Boc-D-Ala-полимеру Получения В в следующей последовательности: N -Boc-Pro (2,3 экв.); Na^α-Boc-hAtg (Et)₂. HCl (1 экв. )/HBt; Na^α-Boc-Leu, H₂O (2,3 экв.); Na^α-Boc-D-hArg (Et)₂. HCl (1,6 экв.)/-HBt; Na^α-Boc-Tyr (2,1 экв.)/HBt; Na^α -Boc-Ser (tBu) (2,0 экв.); Na^α-Boc-D-Pal (3) (1,8 экв.)/HBt; Na^α -Boc-D-p-Cl-Phe (2,0 экв.); Na^α-Boc-D-Nal (2) (2,1 экв)/HBt; уксусный ангидрид.

Ацетилирование осуществляют после Ala, Pro и Leu. Избыток HBt (2 экв.), используют для связывания основных аминоокислот, hArg (Ey)₂ и Pal (3). Аминокислоты присоединяют путем DIC или HBt опосредованного DIC -связывания в течение 3 часов, и полимер последовательно промывают CH₂Cl₂ 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и СН₂Сl₂ 4 х 1 мин.

Следующий протокол используют для отщепления N^α -защитной группы после каждого прибавления аминокислот.

Программа А: полимер вначале промывают с помощью CH₂Cl₂ 1 х 1 мин, ТФК CH₂Cl₂ (40/60) 1 х 1 мин, ТФК CH₂Cl₂ (40/60) 1 х 30 мин, CH₂Cl₂5 х 1 мин, Et₃ N CH₂Cl₂ (5/95) 3 х 1 мин, CH₂Cl₂ 4 х 1 мин.

Программа B: полимер вначале промывают с помощью CH₂Cl₂ 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH₂Cl₂/-iPrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH₂Cl₂/i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, СH₂Cl₂ 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Et₃ N CH₂Cl₂ (5/95) 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, CH₂Cl₂ 4 х 1 мин.

Программу А используют для отщепления защитных групп на Ala. Pro, D-hArg (Et)₂, Leu и D-Nal (2), Программу В используют для отщепления защитных групп на D-hArg (Et)₂, Tyr, Ser, D-Pal (3) и p-Cl-Phe. После каждого освобождения от защиты и промывки, в соответствии с протоколом А или В, прибавляют следующую аминокислоту в последовательности и полимер промывают с помощью CH₂Cl₂ 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин, CH₂Cl₂ 4 х 1 мин. После завершения cоставления последовательности пептид отщепляют от полимерного носителя путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле в течение приблизительно 18 ч при температуре около 25^оС. Неочищенный пептид вначале растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в его ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-X4A (Био-Рад). Ацетат подвергают хроматографии на колонке силикагеля (CH₂Cl₂/i-PrOH/MeOH/H₂O/HOAc в качестве растворителя); ацетатные фракции растворяют в воде и загружают на обращеннофазную колонку (Vydec c-18, 15-20 мкм) и очищают с использованием ацетонитрила/ТЕАР (рН 3,0). Фракции желательной степени чистоты объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР, затем промывают 1% уксусной кислотой в воде. Пептид десорбируют смесью MeOH/CH₃CN/HOAc/H₂O (44/50/1/5). Остаток растворяют в метаноле или уксусной кислоте и преципицируют в присутствии простого эфира, фильтруют, промывают простым эфиром и сушат в вакууме. Аминокислотный анализ осуществляют на анализаторе аминокислотном Бекман 119CL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют с помощью 6 н. раствора HCl при температуре 110^оС в течение 20 ч. Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием Spherisord C-8 (Олтех), 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыск, расход 1,5 мл/мин, 30% СР₃CN. 70% NH₄H₂PO₄ 0,04 М, диметилоктиламин 4,3 х 10^-3, температура 40^оС. Синтез антагониста подтверждают наличием основного пика при времени удерживания 18 мин; других пиков при 1% не обнаружено при времени удерживания 16 мин.

П р и м е р 4. Синтез антагониста ЛГ-РГ без временной защиты серина
Повторяют пример 3 с использованием N^α-Boc-Ser вместо N^α-Boc-Ser (tBu). ЖХВР -анализ показывает присутствие основного пика при времени удерживания 18 мин относительно антагониста и присутствие примеси при концентрации 6,5% в отношении времени удержания 16 мин.

Следующая формула изобретения раскрывает и заявляет предмет технического решения, которое заявитель считает своим изобретением. Приведенная формула изобретения нацелена на полный диапазон эквивалентных решений, признаваемых специалистами в данной области техники, относящейся к твердофазному пептидному синтезу.

Использование: в химии пептидов при синтезе пептидных цепей, содержащих гистидин и серин. Сущность изобретения: способ твердофазного синтеза пептидов общей ф-лы 1, включающий присоединение N-защищенных концевых аминокислот к инертному твердому носителю, последующее добавление N-защищенных аминокислот к наращиваемой пептидной цепи, причем боковую цепь остатка серина временно защищают группой, лабильной по отношению к агентам, используемым для удаления альфа-аминозащитных групп, а боковую цепь гистидина, если она присутствует, защищают группой, лабильной по отношению к альфа-аминодеблокирующему агенту; удалением в конце каждого цикла защитной группы, отщеплением полипептида от носителя с использованием аминолиза или аммонолиза, выделением образующегося соединения I. Ф-ла I: R₁-R₂-R₃-Ser-Tyr-R₄-heu-R₅-Pro-R₆, где R₁ -пиро -Glu, N-AcDNal; R₂His, DpClPhe, DpFPho, R₃= Тгр, Д-Тгр; R₄= DNal(2), Dh Arg(Et)₂ Dh Агд(Bu), Dh Arg(CH₂CF₃)₂ R₅= Агд, L-Arg(Et)₂ L-hАгд(Bu), L-hArg(CH₂CF₃)₂ R₆ GlyNH₂ DAla NH₂

СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ общей формулы
R₁ R₂ R₃ Ser Tyr R₄ Leu R₅ - Pro R₆,
где R₁ выбирают из группы пиро-Glu, N-AcD Nal;
R₂ His, DpClPhe, DpFPhe;
R₃ Trp, DTrp;
R₄ DNal(2), DhArg(Et)₂, DhArg (Bu), DhArg (CH₂CF₃)₂;
R₅ Arg, L-Arg (Et)₂, L h Arg(Bu), L h Arg(CH₂CF₃)₂;
R₆ GlyNH₂, DAla NH₂,
который включает следующие стадии: присоединение N^α защищенных концевых аминокислот к инертному твердому носителю; последующее добавление других N^α защищенных аминокислот к наращиваемой пептидной цепи; удаление в конце каждого цикла защитной группы; отщепление полипептида от носителя; выделение образующегося полипептида, отличающийся тем, что боковую цепь серина временно защищают группой, лабильной по отношению к агентам, используемым для удаления α аминозащитных групп, а боковую цепь гистидина, если она присутствует, защищают группой, лабильной по отношению к агенту для удаления a аминозащитных групп, при этом группу, защищающую боковую цепь гистидина, можно удалить либо путем аминолиза или аммонолиза по мере того, как пептид отщепляется от носителя.