ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству питательных сред, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при диагностике туберкулеза.

Известна среда Левенштейна-Йенсена, включающая солевой раствор (калий фосфорнокислый - 2,4 г, магний сернокислый - 0,34 г, магний лимоннокислый - 0,6 г, аспарагин - 3,6 г, глицерин - 12 мл, вода дистиллированная - до 600 мл), яичную массу - 1000 мл (20-25 яиц), водный 2%-ный раствор малахитовой зелени - 20 мл, картофельный крахмал - 30 г («Наставление по диагностике туберкулеза». - М., 2002. - С.47 - прототип).

Однако с использованием данной среды не всегда удается изолировать микобактерии туберкулеза бычьего вида, а в случае положительных результатов рост культур визуально обнаруживается на 20-60 сутки, что удлиняет сроки постановки диагноза на туберкулез. Кроме этого в связи с эволюционной изменчивостью возбудителя туберкулеза, бесконтрольным применением лекарственных средств и биопрепаратов снизилась информативность бактериологических исследований при туберкулезе.

Необходима разработка питательной среды, обеспечивающей микроскопически видимый рост культур микобактерий в более ранние сроки для ускоренной диагностики туберкулеза и своевременного проведения мероприятий по ликвидации инфекции.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда для культивирования микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза (включающая солевой раствор, яичную массу, водный раствор малахитовой зелени и картофельный крахмал) дополнительно содержит водный экстракт из порошка хвостов марала при следующем содержании компонентов среды:

- солевой раствор:

калий фосфорнокислый - 2 г,

магний сернокислый - 0,28 г,

магний лимоннокислый - 0,5 г,

аспарагин- 3,0 г,

глицерин - 10 мл,

вода дистиллированная - 500 мл;

- водный экстракт из хвостов марала - 100 мл,

- яичная масса - 1000 мл,

- водный 2% раствор малахитовой зелени - 20 мл,

- картофельный крахмал - 30 г.

При этом водную экстракцию из порошка хвостов проводят при разведении порошок:вода 1:10 в течение 2-3 часов при температуре 95,5°С и атмосферном давлении.

Основанием для изучения возможности использования экстракта хвостов марала в качестве эффективного стимулятора роста микобактерий туберкулеза бычьего вида явились данные сравнительного биохимического состава различных видов биопродукции пантового оленеводства, представленные в таблице 1.

Таблица 1 Биохимический состав Панты марала Панты пятнистого оленя Кровь марала Кровь пятнистого оленя Мясо марала Хвосты Плоды Пенисы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Аминокислоты г/кг Изолейцин 0,40 1,05 1,28 0,26 2,69 3,25 1,48 2,84 Треонин 0,42 2,12 2,59 0,14 1,82 2,24 1,69 1,88 Серии 0,63 0,69 1,25 0,03 1,27 1,39 1,0 1,29 Глицин 0,79 0,85 1,34 0,21 1,36 1,47 1,09 1,37 Алании 0,81 0,98 1,67 0,46 1,77 1,97 1,36 1,79 Валин 0,58 0,77 1,46 0,83 1,53 1,70 1,13 1,54 Метионин 0,08 0,89 1,10 0,17 0,76 0,95 0,70 0,78 Лейцин 0,26 1,38 3,14 0,79 5,38 6,39 2,71 5,43 Глутамин 1,31 2,15 4,46 1,44 4,96 5,52 3,74 4,83

Пролин - 0,26 1,93 - 2,32 2,95 1,01 2,33 Фенилаланин 0,28 0,49 1,11 0,24 1,23 1,40 0,88 1,22 Лизин 0,87 3,23 3,87 0,60 2,80 3,39 2,63 2,88 Аргинин 0,86 0,87 1,40 0,16 2,20 2,42 1,25 2,32 Триптофан - 0,44 - - 0,35 0,48 0,32 0,37 Оксипролин - 0,04 - - 0,03 0,03 0,02 0,03 Сумма аминокислот 7,03 16,20 26,60 5,33 31,80 37,30 22,20 32,30 Витамины А, млн И.Е. - - - 34,3 36,6 35,7 30,9 31,3 Е, мг/кг 0,58 0,60 0,11 0,45 12,21 11,83 10,28 10,46 В₁, мг/кг 0,58 0,60 0,10 0,10 1,22 1,18 1,03 1,05 В₂, мг/кг 1,75 1,80 0,33 3,06 3,66 3,55 3,84 3,14 В₃, мг/кг 2,57 2,82 0,47 3,85 5,68 5,65 4,90 4,84 В₅, мг/кг 8,78 9,63 1,62 13,15 64,50 64,0 55,70 55,00 В₆, мг/кг 1,14 - - 2,04 2,44 2,36 2,25 2,1 В₁₂, мг/кг 5,83 6,00 1,12 5,04 12,20 11,80 10,30 10,50 Минеральный состав Зола, % 41,4 38,14 - - 3,69 2,32 15,29 2,73 Кальций, % 12,4 12,5 10,50 10,80 0,05 0,11 1,60 0,06 Фосфор, % 7,34 4,01 5,74 7,99 0,60 0,36 1,34 0,41 Калий, г/кг 4,41 3,70 2,25 6,50 12,0 5,0 16,0 6,0 Натрий, г/кг 8,42 7,50 1,33 7,29 2,50 3,30 31,7 5,0 Магний г/кг 2,0 1,24 0,07 0,15 0,96 0,65 1,17 0,69 Железо, мг/кг 235,6 675,0 1000,0 1812,0 276,0 130,0 270,0 110,0 Марганец, мг/кг 10,9 8,0 0,17 0,33 1,70 3,30 8,30 1,70 Медь, мг/кг 9,68 6,90 2,50 3,7 1,0 4,60 25,0 3,7 Цинк, мг/кг 60,9 71,20 6,90 10,0 30,0 25,0 27,5 27,5

Как видно из таблицы 1, показатель аминокислот и витаминов наиболее значителен в хвостах маралов, где такие востребованные для роста и развития микобактерий аминокислоты как глицерин, аланин, лейцин, а также глутамин (доступный источник азота) находятся в приоритетном количестве. Кроме того, при изготовлении водных экстрактов из хвостов они обогащаются жирами и фосфолипидами, суммарно обеспечивающими энергетический потенциал жизнеобеспечения микроорганизмов.

Кроме этого следует отметить, что микобактерии очень устойчивы к химическим веществам и факторам воздействия внешней среды из-за наличия в микробной клетке жировосковых веществ. Микобактерии туберкулеза, в отличие от других микроорганизмов, характеризуются высоким содержанием липидов, достигающих 10-14% сухого вещества микобактерий, при этом фосфолипиды составляют около 20% от всех липидов микобактерий.

Исследования по содержанию липидов в ткани хвостов составляет 3,8%, в то время как в пантах этот показатель был на уровне 0,73%, т.е. в 5,2 раза меньше.

При этом фосфолипиды составляют 39,6% от суммы липидов в хвостовых железах. В растущих клетках микобактерий происходит как синтез, так и расщепление фосфолипидов, являющихся существенными структурными элементами клеточных стенок микобактерий. Известно то, что когда клетка использует весь субстрат питательной среды, она начинает потреблять внутренние резервы (глицериды, воски и т.д.). Таким образом, при увеличении липидной составляющей питательной среды (модифицированной составляющей среды Левенштейна-Йенсена), более высоком содержании аминокислот и витаминов заявленная питательная среда должна обеспечивать более высокий энергетический потенциал жизнеобеспечения микобактерий. Минеральный состав экстрактов из хвостов, как показали дальнейшие исследования, оказался оптимальным по количеству необходимых макро- и микроэлементов для достижения (всей совокупностью биохимических составляющих находящихся в экстракте) ускоренного культивирование микобактерий. Удельный вес этих экстрагируемых веществ составляет 24-25% на 100 г сухой навески.

На основании предварительных исследований был проведен опыт по выявлению оптимальных параметров процесса экстракции из порошка хвостов маралов.

Было выявлено положительное влияние степени разведения и времени экстракции на выход сухого вещества в процессе экстракции при атмосферном давлении и щадящей температуре 99,5°С. При более высоких температурах и давлении отмечалась динамика снижения содержания витаминов. Результаты влияния параметров процесса экстракции из порошка хвостов марала на процент выхода сухого вещества отражены в таблице 2.

Таблица 2 Показатель Время проведения процесса при соотношении порошок (из хвостов): вода, час 1 2 3 1:5 1:10 1:15 1:5 1:10 1:15 1:5 1:10 1:15 Сухое вещество, 16,50 22,20 21,10 17,40 23,40 22,10 19,80 24,250 23,30

Как видно из таблицы 2, при 2- и 3-часовой экстракции высокий выход сухого вещества наблюдался при разведении 1:10 (23,4-24,25%) и 1:15 (22,1-23,3%) - оптимальным режимом водной экстракции порошка из хвостов следует считать 2- 3-часовую экстракцию при разведении 1:10, при атмосферном давлении и температуре 99,5°С. Выход сухого вещества находится на уровне 23,4-24,25%, т.е. на предельно близком уровне к максимально возможному (24-25%). В целом, следует отметить, что биохимический состав экстракта из хвостов марала отвечает требованиям, предъявляемым к сырью, для производства коллоидной основы плотной питательной среды при наличии необходимых для ускорения культивирования микобактерий веществ.

Питательная среда с водным экстрактом из хвостов марала была испытана на пробе биоматериала, отобранного от реагирующего на туберкулин и убитого с диагностической целью марала, у которого на вскрытии во внутренних органах и лимфатических узлах выявлены характерные для туберкулеза изменения в виде гнойно-некротических абсцессов, окруженных соединительно-тканной капсулой.

В таблице 3 приведены сравнительные испытания питательных сред (характер роста микобактерий) по прототипу (среда Левенштейна-Иенсена) и питательной смеси по заявленному изобретению (среда на основе экстракта из хвостов марала).

Результаты исследований свидетельствуют о том, что по показателю первичного роста питательная среда с экстрактом из хвостов марала превосходит прототип в 4 раза, поскольку рост колоний микобактерий туберкулеза бычьего вида в субкультуре на этой среде обнаружен уже на 5 день, в то время как в прототипе - на 20 сутки.

Среднестатистические показатели интенсивности роста крупных колоний на обеих сравниваемых средах равны 1. Однако средней величины колоний в 3,18 раза и мелких в 14,1 раза больше выросло на питательной среде с экстрактом из хвостов марала.

Параметры размера в абсолютных цифровых показателях изучаемых колоний микобактерий отличаются незначительно как в прототипе, так и на питательной среде на основе экстракта хвостов марала, но, вместе с тем, высеваемость на 25% выше на среде с использованием экстракта из хвостов марала. Пророст банальной микрофлоры на обеих сравниваемых средах не выявлен.

Пример 1. Питательную среду для культивирования микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза готовят следующим образом.

1) Сначала, согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза». - М., 2002. - С.47, готовили солевой раствор среды Левенштейна-Йенсена состоящий из:

- калия фосфорнокислого - 2,4 г;

- магния сернокислого - 0,34 г;

- магния лимоннокислого - 0,6 г;

- L-аспарагина - 3,6 г;

- глицерина - 12 мл;

- воды дистиллированной до 600 мл.

2) Далее готовили экстракт из порошка хвостов марала. Порошок из хвостов (размер частиц 100-400 мкм) помещали в рабочую емкость экстрактора и заливали водой в соотношении порошок:вода 1:10. Экстракцию проводили при температуре, близкой к 100°С (99,5°С), под атмосферным давлением в течение 3 часов. Содержимое емкости фильтровали через марлевый фильтр с последующей стерилизацией (20 мин) при той же температуре.

3) 500 мл солевого раствора смешивали со 100 мл экстракта из хвостов марала и добавляли все оставшиеся составляющие среды Левенштейна-Йенсена:

- яичную массу 1000 мл (20-25 яиц);

- водный 2% раствор малахитовой зелени - 20 мл;

- крахмал картофельный - 30 г.

После полного растворения ингредиентов устанавливали рН 7,6 (первоначально у экстракции рН 5,7) после чего смесь фильтровали, разливали по пробиркам (по 4-5 мл), помещали в наклонном положении в свертыватель сред, стерилизовали при 85°С в течение 30 минут.

Из отобранного биоматериала (пораженные органы и лимфатические узлы от убитого с диагностической целью, реагирующего на туберкулин марала), обработанного по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши, произвели посев на среды по прототипу и питательную среду по заявленному способу (среда с экстрактом из хвостов марала). Результаты отражены в таблице 4.

Таблица 4 Среда Левенштейна-Иенсена (прототип) Первичный рост в культуре из биоматериала, сут Интенсивность роста колоний, кол-во Размер колоний, % Кол-во пробирок среды Рост культур Рост банальной микрофлоры к с м к с м пробирок % пробирок % 41-55 - - 20 - - 100 60 32 53,3 - - Питательная среда на основе экстракта хвостов марала Первичный рост в культуре из биоматериала, сут Интенсивность роста, колоний, шт Размеры колоний, % Кол-во пробирок среды Рост культур Рост банальной микрофлоры к с м к с м пробирок % пробирок % 8-11 1 2,0 19,4 0,001 2,7 97,2 60 57 95 - -

Как видно из таблицы 4, первичный рост культур микобактерий (по результатам культурально-морфологических и биологических исследований, отнесенных к микобактериям туберкулеза бычьего вида) по прототипу составляет 41-55 дней, а на питательной среде с экстрактом из хвостов марала - 8-11 дней, что дало возможность на 33 дня раньше поставить диагноз на туберкулез и начать превентивные мероприятия по его ликвидации в мараловодстве.

По интенсивности роста питательная среда с экстрактом из хвостов марала превосходила прототип в 9,7 раза по росту мелких колоний, в 2 и 1 по средним и крупным.

Из 60 пробирок рост культур на питательной среде с экстрактом из хвостов марала обнаружен в 95% пробирок, в то же время по прототипу 0 в 53,3%, что меньше на 41,7%.

Пример 2. В связи с тем, что изъятие 100 мл солевого раствора замещают (в составе солевого раствора среды Левенштейна-Йенсена) в процессе приготовления заявленной питательной среды на экстракт из порошка хвостов, то следует отметить некоторые потери компонентов солевого раствора (тем более при изготовлении среды). Поэтому можно приготовить сразу не 600, а 500 мл солевого раствора, используемого в заявленной среде при сохранении прежней концентрации компонентов. В этом случае содержание компонентов солевого раствора следующее:

- калий фосфорнокислый - 2,0 г;

- магний сернокислый - 0,28 г;

- магний лимоннокислый - 0,5 г;

- L-аспарагин - 3,0 г;

- глицерин - 10 мл;

- вода дистиллированная до 500 мл.

Остальные компоненты среды в том же составе и количестве как в примере 1.

Весь последующий текст также по 1-му примеру.

Таким образом, использование заявленной питательной среды для культивирования микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза позволяет сократить сроки изоляции микобактерий туберкулеза, что обеспечивает ускоренную диагностику туберкулеза животных, а значит и своевременное проведение мероприятий по ликвидации инфекции.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при диагностике туберкулеза. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый, магний сернокислый, магний лимоннокислый, L-аспарагин, глицерин, картофельный крахмал, дистиллированную воду, водный экстракт из порошка хвостов марала, водный 2%-ный раствор малахитового зеленого и яичную массу. Изобретение позволяет сократить сроки изоляции микобактерий. 4 табл.

Питательная среда для культивирования микобактерий туберкулеза, содержащая калий фосфорнокислый, магний сернокислый, магний лимоннокислый, L-аспарагин, глицерин, картофельный крахмал, дистиллированную воду, яичную массу, 2%-ный раствор малахитового зеленого, отличающаяся тем, что дополнительно к смеси этих компонентов среда содержит водный экстракт порошка из хвостов марала, приготовленный путем экстракции порошка водой в соотношении 1:10 соответственно при температуре 95,5-99,5°С и атмосферном давлении в течение 2-3 ч, при следующем содержании компонентов:
калий фосфорнокислый 2,0 г магний сернокислый 0,28 г магний лимоннокислый 0,5 г L-аспарагин 3,0 г глицерин 10 мл картофельный крахмал 30 г дистиллированная вода до 500 мл водный экстракт порошка из хвостов марала 100 мл водный 2%-ный раствор малахитового зеленого 20 мл яичная масса 1000 мл