СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/04 C12Q1/70 G01N33/569 B82B3/00 

Изобретение относится к области нанотехнологии, в частности к наномедицине, нанобиотехнологии, способу скрининга для быстрого определения бактерий с множественной лекарственной устойчивостью с помощью наноагентов, имитирующих фаги и представляющих собой конъюгат наночастицы золота с ферментом деполимераза, выделенной из бактериофага или профага, иммобилизованным на поверхности наночастицы.

Способ может быть использован для прикладных разработок в молекулярной биологии и медицинской микробиологии, а также для создания различных наборов для in vitro диагностики.

Уровень техники

Растущее использование антибактериальных препаратов в клинике, уходе за животными и сельском хозяйстве привело к глобальному распространению устойчивых к лекарственным средствам патогенных штаммов. Долгое время преобладающей стратегией решения этой проблемы было введение нового класса антибиотиков каждый раз, когда предыдущий терпел неудачу. Следовательно, распространение мультирезистентных штаммов превратилось из гипотетической угрозы в повседневную медицинскую проблему (Подольский, 2018). Несмотря на недавние успехи в скрининге библиотек соединений, потребность в новом подходе к антибактериальной терапии остается актуальной (Murray et al., 2022).

Фаговая терапия имеет ряд преимуществ перед другими подходами к лечению бактериальных инфекций. По сравнению с малыми молекулами бактериофаги более избирательны и менее склонны к развитию лекарственной устойчивости (Pires et al., 2011; Sillankorva et al., 2008). Их высокая специфичность по отношению к конкретному штамму является ключевым преимуществом. Выбор фага для терапии каждый раз должен производиться в зависимости от штамма бактерии, которым инфицирован больной.

Специфичность фага определяется рецептор-связывающими белками (хвостовыми волокнами или хвостовыми шипами), которые распознают молекулы, образующие бактериальную клеточную стенку, или полисахариды капсулы. Хвостовые шипы или структурные деполимеразы разрушают капсульные полисахариды (КПС) и могут независимо использоваться в качестве антибактериальных агентов.

Известно, что деполимеразы снижают вирулентность и терапевтически эффективны против инфекций, вызванных различными бактериальными патогенами, такими как Escherichia coli (Lin et al., 2017; Mushtaq et al., 2005), Klebsiella pneumonia (Hsieh et al., 2017; Xcy и др., 2013; Лин и др., 2014; Pan et al., 2015) и Acinetobacter baumannii (Liu et al., 2019). В случае A. baumannii, одного из наиболее значимых нозокомиальных патогенов, в последнее время идентифицировано более 144 типов капсульных локусов (типов K), и их количество постоянно увеличивается. Модификация связывающих рецепторов на клеточной поверхности считается вероятным механизмом развития устойчивости к фагам. Однако фаги обладают способностью быстро преодолевать иммунитет и резистентность хозяина посредством коэволюционного процесса.

Аэробные грамотрицательные бактерии Acinetobacter baumannii являются одним из наиболее важных клинических патогенов - возбудителей внутрибольничных инфекций во всем мире. Бактериальную клетку A. baumannii окружает капсула, которая состоит из толстого вязкого слоя структурно вариабельного капсульного полисахарида (КПС). Капсула защищает бактерии от неблагоприятных условий окружающей среды и биологических систем, включая механизмы иммунной защиты хозяина и бактериофаги. Многие фаги A. baumannii имеют структурные деполимеразы (хвостовые шипы), которые специфически распознают и ферментативно расщепляют бактериальные КПС.

Одним из ключевых факторов, обеспечивающих успешное внедрение бактериофагов в клинику, является разработка быстрого и надежного метода подбора штамма фага к пациенту. Такой метод скрининга должен проверять специфичность рекомбинантной деполимеразы, полученной из фага, к штамму, присутствующему у пациента.

Золотым стандартом скрининга является двухслойный метод (Адамс, 1959) или его модификация - метод «спот-тест». Этот метод требует культивирования бактериального штамма в чашке и нанесения раствора определенного фага или фермента, полученного из фага, на поверхность питательной среды. Если деполимераза активна в отношении бактерий, последние декапсулируются, что приводит к полупрозрачному ореолу в месте нанесения белкового раствора. Общепринятой альтернативой является реакция ферментсубстрат, которая требует выделения бактериальных КПС. Однако оба подхода требуют много времени и плохо масштабируются.

Разработка быстрого и эффективного инструмента для скрининга бактериофагов была бы очень полезна как для диагностики, так и для терапии бактериальных инфекций. Подходы биозондирования на основе наночастиц дают возможность разработать такой инструмент благодаря физической, а не биологической природе сигнала от датчика, который является быстрым, дискретным и поддающимся количественной оценке. Одним из лучших примеров успешного применения нанотехнологий в медицинской диагностике являются методы, основанные на поверхностном плазмонном резонансе (ППР).

Сдвиг в спектре ППР, наблюдаемый при зависимой от аналита ассоциации или диссоциации плазмонных наночастиц на твердой фазе, используется во множестве биосенсоров (Хлебцов, 2008). Показана эффективность систем на основе ППР для обнаружения бактерий (Chen et al., 2015; Huang, 2007; Peng, Chen, 2019; Tiet et al., 2017), антибиотиков (Шевченко и др., 2018) и раковые клетки (El-sayed et al., 2005; Medley et al., 2008).

Наночастицами называют любые объекты размером от 1 до 100 нанометров (1 нм=1×10^-9 м), полученные как с помощью химического синтеза, так и естественным путем [Bhushan, 2017]. В природе они встречаются повсеместно, и в ряде случаев могут формироваться живыми объектами, как например магнетосомы у некоторых видов бактерий или экзосомы у эукариот [Faivre, Schüler, 2008; Sun et al., 2010]. Вследствие небольшого размера наночастицы обладают рядом уникальных физических, химических и биологических свойств, востребованных в различных областях биомедицины [Gao, Gu, Xu, 2009; Li et al., 2012]. Так, частицы из благородных металлов, за счет эффекта локализованного поверхностного плазмонного резонанса (ЛППР) являются одними из наиболее востребованных компонентов различного рода биосенсоров [Li, Cushing, Wu, 2015], квантовые точки за счет контролируемой флуоресценции могут служить универсальными метками для различных процессов [Medintz et al., 2005], а контролируемый нагрев магнитных наночастиц в переменном магнитном поле позволяет использовать их в качестве агентов для терапии солидных опухолей [Jordan et al., 1999].

Целью настоящего изобретения является поиск и разработка новых способов выявления госпитальных Acinetobacter-инфекций.

Техническая проблема заключается в том, что ряд патогенных микроорганизмов, включая бактерию Acinetobacter baumannii, являются наиболее частой причиной внутрибольничных инфекций, в то время как способов для быстрого определения указанных бактерий недостаточно. Этот возбудитель характеризуется естественной множественной лекарственной устойчивостью, а также вторичной устойчивостью к антибиотикам, дезинфицирующим средствам, моющим средствам и УФ-облучению.

Для решения данной проблемы было исследовано несколько подходов, проведен поиск и анализ источников информации из общедоступного уровня техники до даты испрашиваемого приоритета.

Известен патент на изобретение RU 2439151 от 10.01.2012, в котором описан штамм бактериофага Acinetobacter baumannii ар22 для идентификации бактерий Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных A.baumannii-инфекций. Видоспецифический вирулентный штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 семейства Myoviridae выделен из клинического материала и депонирован в коллекции музея микроорганизмов ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» под номером Ph-42. Бактериофаг обладает выраженной литической активностью, лизирует 68% штаммов А. baumannii, выделенных из клинического материала, и использован для идентификации микроорганизмов этого вида при бактериологическом анализе клинического материала, а также для разработки комплексных лечебных препаратов против А. baumannii-инфекций.

Известен источник информации (Шашков А.С., 2015 г.), в котором описан штамм бактерий Acinetobacter baumannii 1053, который является типовым штаммом бактерий для поддержания специфического бактериофага АР22, который заражает достаточно широкий спектр штаммов A. baumannii, циркулирующих в российских клиниках и больницах. A.baumannii 1053 принадлежит к новой группе, обозначенной KL91.

Известен источник информации (Сенченкова С.Н. и др., 2021), из которого известен штамм бактерий Acinetobacter baumannii В8300 типа K92.

Известен источник информации (Попова А.В. и др., 2017), из которого известен литический фаг Acinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12.

Известен источник информации - Шевченко К.Г., дис. на соиск. уч. степ. к.б.н., 2019 г., который выбран наиболее близким аналогом и принят за прототип.

В указанном источнике на примере деполимераз профагов и бактериофагов Acinetobacter baumannii В8300 была показана возможность использования метода для оценки специфичности и эффективности связывания с мембраной клеток молекул, конъюгированных с поверхностью наночастиц золота. Описан метод анализа специфичности связывания деполимеразами бактериофагов капсульных полисахаридов бактерий и показана его эффективность на примере взаимодействия деполимеразы профага штамма A. baumannii 8300 (Dpo8300). Проводилось добавление специфичных золотых наночастиц с иммобилизованной на них деполимеразой профага штамма A. baumannii 8300 (Dpo8300) к клеткам А. Baumannii. Проводилось добавление неспецифичных золотых наночастиц с иммобилизованной на них деполимеразой Dpo8300 к клеткам Е. Coli в качестве контрольного образца, добавление неспецифичных золотых наночастиц с иммобилизованным на них стрептавидином к клеткам A. baumannii. Описан спектрофотометрический метод для исследования в режиме реального времени взаимодействия наночастиц друг с другом в составе лиганд-зависимых комплексов, анализа кинетики различных молекулярных процессов в условиях in situ и скрининга антибактериальных препаратов, связывающих и разрушающих мембрану.

Недостатком известного метода является то, что недостаточно широк выбор доступных антимикробных препаратов, ограничено количество используемых в способе ферментов деполимераз, входящих в состав наноагентов, имитирующих фаги, и соответствующих штаммов патогенных бактерий, время исследования занимает 12 ч и более.

На основании вышеприведенного, предлагаемый способ может быть признан соответствующим условиям патентоспособности «Новизна» и «Изобретательский уровень».

Раскрытие изобретения

Для решения технической проблемы заявителем предложен новый способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, характеризующийся тем, что проводят скрининг наноагента, представляющего собой конъюгат наночастицы золота с ферментом деполимераза бактериофага или профага, иммобилизованным на поверхности наночастицы. Способ реализован с помощью скрининга специфичности деполимеразы и мониторинга ее активности в режиме реального времени, который должен проверять специфичность рекомбинантной деполимеразы, полученной из фага, к штамму бактерий, присутствующему у пациента.

Технический результат заключается:

- в ускорении определения патогенного штамма бактерии до 1-3 минут за счет скрининга активности фермента деполимеразы, входящей в состав наноагента, и меньших размеров наноагента,

- в повышении специфичности способа, которая определяется взаимодействием фермента на поверхности наночастиц с соответствующими КПС патогенной бактерии, по сравнению с использованием бактериофагов или их ферментов деполимераз в чистом виде,

- в расширении арсенала способов распознавания патогенных бактерий с использованием различных наноагентов (наночастиц), имитирующих фаги, в формате планшета для скрининга коллекции в режиме реального времени.

С этой целью авторами разработан способ скрининга для более быстрого определения бактерий с множественной лекарственной устойчивостью с помощью наноагентов, имитирующих фаги или профаги, с помощью УФ-видимого спектрометра в более короткие сроки.

В предлагаемом изобретении расширен выбор наноагентов, содержащих наночастицы, имитирующие фаги, за счет использования патогенных бактерий других штаммов и типов (штамм Acinetobacter baumannii 1053, принадлежащий к капсульному типу K91, штамм Acinetobacter baumannii 1432, принадлежащий к капсульному типу K27), а также соответствующих ферментов деполимераз:

- деполимераза Dpo1053, кодируемая в геноме литического фага Acinetobacter baumannii АР22, представляет собой полисахаридлиазу, которая отщепляет КПС от Acinetobacter baumannii 1053 путем р-элиминирования по одному из остатков ManNAcA;

- деполимераза Dpo1432, кодируемая в геноме литического фага Acinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, представляющая собой специфическую гликозидазу, отщепляющую КПС от Acinetobacter baumannii 1432 по гидролитическому механизму.

По биоинформационным данным существует более 144 тыс.видов А. baumannii, различающихся конституцией и структурой КПС (Arbatsky et al., 2019; Kenyon et al., 2021), каждый из которых способен приобретать гены множественной лекарственной устойчивости. Разработка фаговой терапии, по крайней мере, для этого патогена требует создания фаговой библиотеки и скрининга на соответствие фагу/деполимеразе и бактериальному штамму. Однако даже при установлении таких пар этап скрининга все равно потребуется для корректировки лечения для конкретного пациента.

Стандартная микробиологическая оценка специфичности деполимеразы занимает от 12 до 24 часов, что является одним из основных ограничений на пути фаготерапии от кабинета к постели больного.

Разработанный способ значительно сокращает время анализа до 1-3 минут и требует только стандартного УФ-видимого спектрометра. Предлагаемый способ скрининга можно выполнить в формате планшета для скрининга коллекции в режиме реального времени.

Предложенный способ скрининга может быть использован в качестве теста исключения на первом этапе коррекции антибактериальной терапии. Назначение определенного фага или деполимеразы без истории их клинического применения потребует дополнительного анализа клинической эффективности конкретного штамма по отношению к соответствующему ферменту. Последнее обосновано неопределенностью количества звеньев фермента, адсорбированных на поверхности наночастиц, а также различием в поведении свободных и иммобилизованных молекул. Однако, предлагаемый способ достаточно эффективен для теста ДА/НЕТ или сравнительного исследования двух деполимераз.

В одной из неограничивающих реализаций способа определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, данной способ характеризуется тем, что проводят скрининг ферментативной активности наноагента, представляющего собой конъюгат наночастицы золота с ферментом деполимераза бактериофага или профага, иммобилизованным на поверхности наночастицы. Скрининг включает следующие стадии/этапы:

a) автоматически добавляют с использованием многорежимного микропланшетного ридера 10 мкл предварительно подготовленного наноагента к 60 мкл предварительно подготовленному бактериальному образцу с оптической плотностью OD600=0,2,

b) после чего проводят УФ-спектроскопию в 96-луночных планшетах,

c) измеряют оптическую плотность путем спектрального сканирования сразу после автоматического введения наноагента в бактериальный образец для измерения образования комплексов в режиме реального времени,

d) проводят регистрацию специфического сдвига поверхностного плазмонового резонанса при специфической агрегации наноагента на поверхности бактериальных клеток,

e) оценивают специфичность наноагентов за счет конвергенции частиц на клеточных стенках бактерии, их ферментативную активность по разрушению клеточной капсулы бактерии путем обнаружения отрыва наноагента от поверхности бактерий в режиме реального времени, отличающийся тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053 или деполимеразу Dpo1432, размеры наночастиц золота составляют от 20 нм до 32+4 нм и скрининг ферментативной активности наноагента проводят в течение 1-2 минут.

В одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что наночастицы золота с ферментом деполимеразой профага DpoB8300 в концентрации 10 мкл добавляют в бактериальный раствор, содержащий штамм A.baumannii В8300 с концентрацией 100 мкл при оптической плотности OD600=0,2.

В другом примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что патогенной бактерией является штамм Acinetobacter baumannii 1053, принадлежащий к капсульному типу K91.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что патогенной бактерией является штамм Acinetobacter baumannii 1432, принадлежащий к капсульному типу K27.

Еще в другом примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что патогенной бактерией является штамм Acinetobacter baumannii В8300, принадлежащий к капсульному типу K92.

В другом примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что патогенная бактерия в качестве контрольного образца представляет собой Escherichia coli.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053, кодируемую в геноме литического фага Acinetobacter baumannii АР22.

В другом примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053, кодируемую в геноме литического фага Acinetobacter baumannii АР22 и представляет собой полисахаридлиазу.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053, кодируемую в геноме литического фага Acinetobacter baumannii АР22 и представляет собой полисахаридлиазу, которая отщепляет КПС от Acinetobacter baumannii 1053 путем Р-элиминирования по одному из остатков ManNAcA.

В другом примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1432, кодируемую в геноме литического фага Acinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1432, кодируемую в геноме литического фага Acinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, представляющую собой специфическую гликозидазу.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью отличается тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1432, кодируемую в геноме литического фага Acinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, представляющую собой специфическую гликозидазу, отщепляющую капсульные полисахариды от Acinetobacter baumannii 1432 по гидролитическому механизму.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что фермент представляет собой деполимеразу профага DpoB8300.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что фермент представляет собой деполимеразу профага DpoB8300, кодируемую в геноме Acinetobacter baumannii В8300.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что фермент представляет собой деполимеразу профага DpoB8300, кодируемую в геноме Acinetobacter baumannii В8300, являющуюся специфической гликозидазой.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что фермент представляет собой деполимеразу профага DpoB8300, кодируемую в геноме Acinetobacter baumannii В8300, являющуюся специфической гликозидазой, расщепляющей CPS Acinetobacter baumannii B8300 по гидролитическому механизму с образованием мономера и димера повторяющегося полисахаридного звена.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что оценивают специфичность наноагентов за счет конвергенции частиц на клеточных стенках бактерии в режиме реального времени.

Еще в одном примере данной реализации способ определения патогенных штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью характеризуется тем, что оценивают ферментативную активность наноагентов по разрушению клеточной капсулы бактерии путем обнаружения отрыва наноагента от поверхности бактерий в режиме реального времени.

Краткое описание чертежей

Изобретение иллюстрируются следующими графическими материалами:

На фиг. 1 показано схематическое изображение анализа.

На фиг. 2 представлен анализ ферментативной активности функционализированных наночастиц AuNP.

На фиг. 3 показано взаимодействие AuNPs@Dpo с бактериями.

На фиг. 4. показано изменение формы и максимума спектра ППР в зависимости от бактерий и концентрации AuNPs@Dpo в системе.

На фиг. 5 представлена селективность AuNPs@Dpo.

Если не указано иначе, предполагается, что все термины и обозначения, используемые в данной заявке, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в этой области, к которой относится настоящее изобретение.

Сокращения, используемые в настоящем описании, включая приведенные в иллюстративных схемах и последующих примерах, хорошо известны специалисту в этой области. Некоторые из сокращений используют как следующие:

AuNP - наночастицы золота

AuNPs@Dpo - наночастицы золота с иммобилизованной на их поверхности фаговой деполимеразой

БСА - Бычий сывороточный альбумин

ГМДС - раствор гексаметилдисилазана (HMDS)

FITC - изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ)

FC - проточная цитометрия (Flow cytometry) - метод для обнаружения и измерения физических и химических характеристик популяции клеток или частиц.

КПС - капсульный полисахарид, из которого состоит защитная капсула клетки бактерии A. Baumannii

LB - среда (бульон) Луриа-Бертани

ManNAcA - полисахарид-лиаза, расщепляющая КПС A. baumannii 1053 по механизму β-элиминирования в остатках гексуроновой кислоты

OD - оптическая плотность

ППР - поверхностный плазмонный резонанс

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

СПР - SPR-метод основан на явлении поверхностного плазмонового резонанса (surface plasmon resonance)

Гипотеза заключается в том, что аппроксимации наночастиц золота (AuNP), функционализированных белками хвостовых шипов бактериофага, будет достаточно, чтобы вызвать сдвиг ППР при их специфическом связывании с соответствующими КПС на поверхности бактерий. И этот сдвиг будет использован для скрининга специфичности деполимеразы и для мониторинга ее активности в реальном времени.

Заявленное техническое решение представляет собой новый быстрый качественный скрининг фаговых и профаговых деполимераз. Для оценки клинической применимости метода был выбран скрининг белков деполимеразы хвостовых шипов, активных в отношении определенных К видов A. baumannii - наиболее частой причины внутрибольничных инфекций. Этот возбудитель характеризуется естественной множественной лекарственной устойчивостью, а также вторичной устойчивостью к антибиотикам, дезинфицирующим средствам, моющим средствам и УФ-облучению (Tacconelli et al., 2017).

Авторами показно, что предложенный подход на основе ППР позволяет проводить скрининг фагов в короткие сроки и только с помощью УФ- спектрометра, что значительно расширяет выбор доступных антимикробных препаратов.

Материалы.

Бычий сывороточный альбумин (БСА) и бульон Лурия-Бертани Леннокс («Диа-М», Россия); агароза (ПанЭко, Россия); фосфатно-солевой буфер (PBS), гексаметилдисилазан (HMDS), глутаровый альдегид, флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ, FITC) (все от Sigma-Aldrich, Германия), хлороауриновая кислота (золотохлористоводородная кислота) (Драгцветмет, Россия); хлорид натрия (PanReac AppliChem). Все реактивы имели аналитическую чистоту и использовались в том виде, в каком они были получены. Вода Milli-Q использовалась для приготовления водных растворов.

Для исследования выбраны три различные хорошо охарактеризованные структурные деполимеразы, условно обозначенные как Dpo1053, Dpo1432 и DpoB8300, с определенной специфичностью к капсульным полисахаридам (КПС) А. baumannii, принадлежащим к капсульным типам K91, K27 и K92 (K типы) соответственно.

Деполимераза Dpo1053 (Genbank: YP_006383804, PDB: 4Y9V), кодируемая в геноме литического фага A. baumannii АР22, представляет собой полисахаридлиазу, которая отщепляет КПС от A. baumannii 1053 путем β-элиминирования по одному из остатков ManNAcA (Knirel et al. др., 2020).

Деполимераза Dpo1432 (Genbank: YP_009599229, PDB: 6EU4), кодируемая в геноме литического фага A. baumannii vB_AbaP_AS12, представляет собой специфическую гликозидазу, отщепляющую КПС от A. baumannii 1432 по гидролитическому механизму (Knirel et al., 2020).

Деполимераза профага DpoB8300 (Genbank: KMV24774), кодируемая в геноме A. baumannii В8300, также является специфической гликозидазой, расщепляющей КПС A. baumannii В8300 по гидролитическому механизму с образованием мономера и димера повторяющегося полисахаридного звена (Дробязко и др., 2022).

Получение фаговых деполимераз Dpo1053 и Dpo1432 и деполимеразы профага DpoB8300 проводили, как описано ранее (Drobiazko et al., 2022; Knirel et al., 2020).

Штаммы A. baumannii 1053 (капсульный тип K91) (Шашков и др., 2015) и 1432 (К27) (Шашков и др., 2016) получены из СКПМ-Оболенск (инвентарные номера В-7129 и В-7134 соответственно).

Штамм В8300 (K92) (Senchenkova et al., 2021) любезно предоставлен доктором Вирарагхаван Баладжи (Христианский медицинский колледж, Веллор, Индия).

Ниже приведены экспериментальные данные. Сущность и промышленная применимость заявленного изобретения поясняются следующими примерами, ни в коей мере не уменьшая притязания по формуле изобретения во всех частных формах воплощения признаков.

Наночастицы золота.

Наночастицы золота (AuNP) предварительно получали восстановлением цитратом раствора HAuC14 по модифицированному протоколу Туркевича.

Конъюгаты наночастиц золота с деполимеразами (Dpos) предварительно получали по следующему протоколу:

200 мкг Dpo1053, 100 мкг DpoB8300 или 200 мкг Dpo1432 добавляли к 1 мл раствора наночастиц золота (OD530 нм=0,63, 130 пМ) и инкубировали в течение 1 мин при обработке ультразвуком. Затем добавляли 0,25 мл 5% БСА в PBS. Все конъюгаты не менее трех раз промывали, центрифугировали (10 мин, 10000 g) и хранили по 0,1 мл в 1% БСА в PBS.

Культура бактерий. Е. coli и A. baumannii культивировали по стандартным протоколам. Все бактерии выращивали в течение ночи перед экспериментами в среде Луриа-Бертани (LB) при 37°С при перемешивании (150 об/мин). Затем ночную культуру разводили 1:20 в свежей среде LB и выращивали до достижения бактериями необходимого значения оптической плотности (OD600).

Анализ активности деполимеразы.

Активность деполимеразы предварительно анализировали методом точечной пробы или модификацией двухслойного метода (Adams, 1959). 100 мкл культуры бактерий (OD600=0,4) смешивали с 5 мл мягкого агара (среда LB с добавлением 0,6% агарозы), выливали на поверхность чашек со средой LB и давали затвердеть. Затем на мягкий агар наносили 1 мкг (10 мкл) суспензии деполимеразы или 10 мкл (1 нМ) конъюгатов наночастиц золота и инкубировали в течение ночи при 37°С. Для измерения селективности смесь двух штаммов A. baumannii в объеме 100 мкл каждый с оптической плотностью OD600=0,1 смешивали с 10 мкл (1 нМ) конъюгатов наночастиц золота. Спектры экстинкции от 450 до 650 нм измеряли каждую 1 мин в течение 10 мин.

Наночастицы золота AuNP - образование комплексов бактерий.

Ранее полученные наночастицы золота, покрытые деполимеразами, инкубировали с бактериями по следующему протоколу. 10 мкл (1 нМ) конъюгатов золота добавляли к 100 мкл культуры бактерий с оптической плотностью OD600=0,2.

УФ-видимая спектроскопия.

УФ-спектроскопию проводили в 96-луночных планшетах после добавления AuNP к бактериальным образцам с использованием многорежимного микропланшетного ридера CLARIOstar® (BMG Labtech, Германия), как описано ранее. Для точных измерений образования комплексов в режиме реального времени оптическую плотность измеряли путем спектрального сканирования сразу после автоматического введения 10 мкл (1 нМ) AuNPs@DepB8300 в образец (60 мкл; OD600=0,2). Все спектры, соответствующие образованию комплекса AuNP бактерий, были скорректированы по базовой линии. Базовый уровень был взят из спектров поглощения бактерий в бульоне LB с добавлением 10 мкл 1% БСА в растворе PBS.

Дополнительно для подтверждения образования комплекса бактерии-наночастицы дополнительно проводили сканирующую электронную микроскопию с помощью микроскопа MAIA3 (Tescan, Чехия).

Образцы фиксировали 1% глутаровым альдегидом (в PBS) в течение 2,5 часов. Затем клетки последовательно обезвоживали, переводя в этанол (30, 50, 70, 80, 95%) с последующей 10-минутной инкубацией на каждом этапе. Далее клетки фиксировали 50 и 100% растворами гексаметилдисилазана (ГМДС) по 10 мин каждый. Наконец, полученные образцы помещали на кремниевую пластину и сушили при комнатной температуре.

Дополнительно проводили проточную цитометрию.

Чтобы отличить отдельные клетки от мусора для измерения FC, мы пометили бактериальные клетки флуоресцентным красителем. Конъюгаты бактерии-FITC получали следующим образом. 1 мл A. baumanii В8300, выращенных до OD600=1,5, дважды отмывали от среды LB карбонатнобикарбонатным буфером (рН=9). Далее 1 мл бактерий в буфере смешивали с 20 мкг раствора ФИТЦ в 50 мкл ДМСО. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре и 5 раз отмывали 1% БСА в PBS (рН 7,4) от непрореагировавшего ФИТЦ. Затем 100 мкл FITC-меченых бактерий смешивали с 10 мкл (1 нМ) AuNPs@DpoB8300, AuNPs@BSA или 1% BSA. Клетки фиксировали добавлением 100 мкл 37% формальдегида через 1 мин, 15 мин или 60 мин инкубации. Индекс FSC-H анализировали на проточном цитометре Novocyte (Agilent, США). 105 Пороговое значение FSC-H было установлено заранее, чтобы исключить клеточный дебрис и несвязанные наночастицы.

Обработка данных.

Все исследования проводили не менее трех раз. Все значения графиков представляют собой средние значения, а показатели погрешностей указывают на стандартные отклонения.

Результаты.

Предлагаемый метод скрининга деполимераз фагового и профагового происхождения основан на регистрации специфического сдвига SPR. Сдвиг наблюдается при специфической агрегации функционализированных ферментами наночастиц золота (AuNP) на поверхности бактериальных клеток. Эффект аналогичен тому, который наблюдается при сборке наночастиц золота в гомогенные нанокомплексы в растворе или в гетерогенные комплексы на поверхности более крупных частиц (Шевченко и др., 2017). Мы предполагаем, что наночастицы золота с иммобилизованной на их поверхности фаговой деполимеразой (AuNPs@Dpo) будут способны специфически распознавать и связываться с капсульными полисахаридами штаммов-мишеней бактерий так же, как и свободные молекулы деполимеразы. Из-за высокой плотности целевых полисахаридов в клеточной стенке частицы будут связываться достаточно близко друг к другу, чтобы вызвать сдвиг максимума спектра ППР в сторону большей длины волны. Затем при разрушении подложки частицы диссоциируют от поверхности, расстояние между ними увеличивается, а максимум поглощения ППР смещается обратно в сторону более короткой волны.

Затем при деградации субстрата частицы будут отделяться от поверхности, расстояние между ними увеличится, и максимум поглощения SPR сместится обратно в область с более короткой длиной волны. В то же время немодифицированные частицы или частицы, модифицированные неспецифической деполимеразой, не будут агрегировать на поверхности бактерий или не будут достаточно плотным, чтобы вызвать такое смещение.

Взаимодействие между фаговой деполимеразой и бактериями-хозяевами будет обнаруживаются с помощью УФ-видимой спектроскопии с той же специфичностью, что и с помощью микробиологического анализа (фигуры 1А и Б). Тогда измеряемым параметром будет максимум поглощения раствора наночастиц.

На фиг. 1 показано схематическое изображение анализа.

A. Функционализация наночастиц золота рекомбинантными деполимеразами.

B. Специфическая сборка агрегатов AuNPs@Dpo на поверхности A.baumannii, что приводит к смещению SPR. Ферментативная деградация бактериальной капсулы из-за активности деполимеразы приводит к разборке AuNPs@Dpo и обратному сдвигу SPR. При добавлении AuNP, функционализированных неспецифическими белками хвостовых шипов, положение максимума SPR не меняется.

Гипотеза заключается в том, что переход от микробиологического к физическому методам оценки активности деполимеразы по отношению к целевому штамму значительно сократит время анализа.

Для проверки этой гипотезы авторы разработали конъюгаты AuNP с различными фаговыми и профаговыми деполимеразами. Далее провели оценку их взаимодействия с целевыми штаммами A. baumannii с использованием предложенного подхода и провели сравнительный анализ разработанного метода со стандартным микробиологическим экспресс-тестом.

Синтез наночастиц предварительно проводили по протоколу стандартного метода синтеза Туркевича восстановлением золотохлористоводородной кислоты HAuCl₄ цитратом натрия (Туркевич и др., 1951).

Частицы были охарактеризованы с помощью динамического рассеяния света (DLS), сканированием (ПЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). Их размер составил 32±4 нм (рис. 2А, рис. S1). Химический состав наночастиц был подтвержден методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (рис. S1).

На фиг. 2. показан анализ ферментативной активности функционализированных AuNP.

A. СЭМ-микрофотография синтезированных AuNP с помощью сканирующего электронного микроскопа. Масштабная линейка показывает 200 нм.

B. Анализ спот-теста деполимеразной активности AuNP, функционализированных деполимеразой (Dpo). Слева вверху - AuNPs@DpoB8300, вверху справа - AuNPs@BSA, внизу слева - супернатант отмытых AuNPs@DpoB8300, внизу справа - 1 мкг очищенного DpoB8300. Образовавшийся ореол указывает на декапсуляцию бактерий в месте нанесения пробы.

С. СЭМ-микрофотография связывания AuNPs@DepB8300 с A. baumannii В8300 после 1-минутной инкубации. Масштабная линейка показывает 500 нм.

D-F. Спектр ППР AuNP (10 мкл, 1 нМ), функционализированных различными деполимеразами в разные моменты времени после добавления специфических штаммов A. baumannii (100 мкл, OD600).

За синтезом следовала сорбция соответствующих рекомбинантных деполимераз фагового или профагового происхождения, специфичных к K типам, присутствующим на поверхности различных штаммов A. baumannii. При функционализации наночастиц мы наблюдали небольшой сдвиг ППР в сторону большей длины волны, который мы связываем с изменением диэлектрической проницаемости наночастиц. Это изменение можно обнаружить и подтвердить с помощью спектроскопии в УФ-видимой области (рис. S2).

Поскольку связывание с твердой фазой может изменить конформацию фермента или повлиять на его активный центр, был проведен качественный анализ деполимеразной активности с помощью стандартного анализа спот-теста.

Пример такого выборочного теста для A. baumannii В8300, принадлежащего к капсульному типу K92, представлен на рис. 2В.

Бактериальную культуру A. baumannii В8300, смешанную с полужидким агаром, инкубировали в течение 12-18 ч с AuNP, функционализированными специфической деполимеразой профага (обозначенной как AuNPs@DpoB8300), нанесенными на поверхность газона. Полученный ореол при точечном нанесении подтверждает сохраненную активность фермента. Совместная инкубация AuNP, покрытых бычьим сывороточным альбумином (AuNPs@BSA), не сопровождалась образованием эффекта «Гало», что свидетельствует об отсутствии деполимеразоподобной активности наночастиц как таковой. Добавление супернатанта отмытых AuNPs@DpoB8300 также не приводило к образованию эффекта «Гало», что свидетельствует об отсутствии несвязанных молекул деполимеразы в растворе (рис. 2Б).

Связывание AuNPs с поверхностью бактериальной клетки.

Фаговые деполимеразы способны к специфическому связыванию и деградации КПС и могут использоваться в качестве биосенсора или терапевтического агента (Kunstmann et al., 2018). Однако у них отсутствуют специфические маркеры для прямого обнаружения без метки физическими методами. Иммобилизация ферментов на поверхности плазмонных наночастиц золота позволяет неинвазивно визуализировать специфическую активность деполимеразы по отношению к бактериям-мишеням за счет сдвига спектра ППР.

Для проверки справедливости этой гипотезы наноагенты AuNPs@DpoB8300 добавили в раствор соответствующего К типа A. baumannii и подтвердили образование комплекса бактерии-наночастицы с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), как показано на рис. 2С.

Затем был проведен УФ-видимый анализ спектров поглощения растворов до добавления AuNPs@Dpo и после 1-2-минутной инкубации.

Для проверки единообразия метода и его применимости в целях скрининга были исследованы AuNP, функционализированные тремя различными деполимеразами, которые специфически взаимодействуют с различными K-типами A. baumannii.

Как и ожидалось, комплексообразование во всех случаях сопровождалось сдвигом ППР в более длинноволновую область (А=10 нм для штаммов A. baumannii 1053 и В8300, Δ=23 нм для штамма A. baumannii 1432).

Сдвиг был вызван конкретными агрегация AuNPs@Dpo на поверхности бактерий-мишеней (рис. 2D-F).

Это произошло за удивительно короткое время и для его обнаружения потребовался спектральный анализ в реальном времени. На основании полученных данных среднее время полувыведения специфического связывания наноагентов AuNPs@DpoB300 с клеточной поверхностью составило всего 95 с (рис. 3А). Подход оказался пригодным для сверхбыстрого скрининга и значительно превзошел все существующие подходы по времени анализа.

Стоит отметить, что сдвига SPR не наблюдалось при добавлении неспецифических AuNP, таких как частицы, функционализированные лизоцим-гликозидгидролазой или стрептавидином (рис. S4).

Инкубация AuNPs@Dpo с нецелевыми бактериями Е. coli также не изменила положения максимума SPR (рис. S5).

Было проведено сравнение эффективности предложенного подхода с использованием наночастиц AuNP меньшего размера (20 нм). В этом случае было обнаружено, что максимальный сдвиг составляет Δ=7 нм для штамма A. baumannii В8300 (рис. S6).

Повидимому, взаимодействие между более крупными частицами более эффективно и приводит к более выраженному сдвигу ППР. Специфический сдвиг служит индикатором сродства белка, иммобилизованного на поверхности частицы, к определенным бактериям. Следовательно, его можно использовать для оценки их взаимодействия.

Различия в диапазоне сдвига SPR для разных штаммов A. baumannii можно объяснить неодинаковым распределением боковых связывающих доменов для разных деполимераз, а именно фермент-специфические повторяющиеся звенья гликозидной связи или структура поверхности функционализированных наночастиц. Сдвиг ППР был обратимым, и в конечном итоге максимум поглощения возвращался к исходным значениям, что предположительно связано с деградацией субстрата, декапсуляцией бактерий и разборкой наночастиц золота с поверхности клетки.

Данные УФ-видимой спектрофотометрии об агрегации и десорбции AuNP были подтверждены результатами СЭМ (фиг. 3В) и анализом бокового рассеяния проточной цитометрией (фиг. S7).

На фиг. 3 показано взаимодействие наноагентов AuNPs@Dpo с бактериями:

A. Сборка комплекса AuNPs-бактерии. Эволюцию сдвига SPR оценивали с помощью непрерывной УФ-видимой спектроскопии после автоматического введения 10 мкл (1 нМ) раствора AuNPs@DpoB8300 в образец A. baumannii В8300 (60 мкл, OD600=0,2).

B. Взаимодействие AuNPs@Dpo с бактериями. Данные были нормализованы к образцу необработанных бактерий. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (N=3). Динамика взаимодействия AuNPs@DpoB8300 с клеточной поверхностью A. baumannii В8300 по оценке СЭМ. Сборка частиц на клеточной поверхности через 1 мин после добавления 1 нМ наночастиц к бактериям OD600 ≈0,2 (вверху) и их разборка через 40 мин (внизу).

C. Жизнеспособность A. baumannii после инкубации с функционализированными наночастицами AuNP в течение 30 мин. Данные были нормализованы к образцу необработанных бактерий. Данные показаны как среднее значение ± стандартное отклонение (N=3).

Были определены оптимальные концентрации бактерий и функционализированных ферментом деполимеразой наночастиц AuNPs@Dpo для использования в скрининговых анализах. Был проведен сравнительный анализ формы и максимума спектра ППР в зависимости от соотношения концентраций бактерий и AuNPs@Dpo в системе.

Первоначально концентрация наноагентов AuNPs@Dpo была зафиксирована на уровне 1 нМ, в то время как концентрация A. baumannii варьировала от 3,6×10⁷ клеток/мл (OD600=0,091) до 1,43×10⁸ клеток/мл (OD600=0,359).

Минимальная концентрация бактерий, необходимая для появления обнаруживаемого ППР-сдвига, составила 6,5×10⁷ кл/мл (OD600=0,163), концентрация 9,6×10⁷ кл/ мл (OD600=0,239) была оптимальной (Фиг. 4).

На Фиг. 4. показано изменение формы и максимума спектра ППР в зависимости от бактерий и концентрации AuNPs@Dpo в системе:

A. Изменение формы и максимума спектра ППР при добавлении 1 нМ AuNPs@DpoB8300 (10 мкл) к растворам с различной концентрацией штамма А. baumannii В8300.

B. Изменение формы и максимума спектра ППР при добавлении различных концентраций наночастиц золота (10 мкл, AuNPs@DpoB8300) к раствору штамма A. baumanmi В8300 (100 мкл, OD600=0,2).

Соответствующие концентрации AuNPs@Dpo составляли 0,25 нМ и 1 нМ при фиксированной концентрации бактерий 8⋅10⁷ клеток/мл (OD600=0,2). Сотношение [OD600=4×10⁸ КОЕ/мл] использовали для расчета приблизительной бактериальной концентрации ресуспендированного препарата (Nielsen et al., 2015).

Дополнительно была выявлена специфическая декапсуляция штамма А. baumannii В8300 после его инкубации в течение 1 ч со специфическими AuNP@DpoB8300. Хотя декапсуляция не сопровождалась каким-либо видимым изменением оптической плотности (рис. S8), она значительно уменьшала количество колониеобразующих единиц (КОЕ) по сравнению с необработанным образцом (рис. 3С). Предположительно, ингибирование роста может быть отдаленным эффектом декапсуляции.

Специфичность скрининга деполимеразы.

Наноагенты (наночастицы) AuNPs@Dpo имитируют активность фаговых деполимераз и могут быть использованы в качестве мощного инструмента для скрининга их специфичности к различным К типам A. baumannii. Обычный анализ «спот-тест» требует культивирование бактерий с деполимеразами, чтобы четко увидеть декапсуляцию через формирование эффекта «Гало». Реализация такого протокола занимает до 18 часов (Alsan and Klompas, 2010).

Предложенный способ не требует длительного роста бактерий, а специфическое распознавание может быть зарегистрировано сразу после добавления потенциального терапевтического агента с помощью УФ-видимой спектроскопии. Анализ прост в использовании и может быть выполнен в режиме планшета, что позволяет увеличить ее масштаб (рис. 5А).

Рис. 5. Селективность AuNPs@Dpo:

A. Ключевой принцип анализа. Сравнение обычного метода точечного теста для скрининга активности деполимеразы в отношении определенных бактериальных штаммов (вверху) и разработанного анализа на основе SPR (внизу).

B. Анализ специфичности разработанного теста по отношению к разным штаммам A. baumannii разных типов K. AuNPs@Dpol053, AuNPs@DpoB8300 и AuNPs@Dpo1432 были обнаружены на бактериальных газонах A. baumannii 1053 (верхний ряд), A. baumannii В8300 (средний ряд) и A. baumannii 1432 (нижний ряд). AuNPs@Dpo наносили в количестве 10 мкл (1 нМ), 1 мкг каждого очищенного Dpo служил положительным контролем (левый столбец). Затем специфичность активности AuNPs@Dpo оценивали с помощью разработанного анализа на основе SPR после 3 минут инкубации (средний столбец) и регистрировали временную эволюцию спектральных максимумов (правый столбец). Для колонок, где ошибка эксперимента не могла быть получена из-за воспроизводимости результатов, применяется инструментальная ошибка (±0,5 нм). Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (N=3).

Основным преимуществом метода над уже известными из уровня техники является высокая специфичность, которая определяется взаимодействием фермента на поверхности наночастиц с соответствующими КПС.

Для выявления ограничений разработанного способа анализа (скрининга) были проведены исследования с целью проверки и подтверждения деполимеразной активности AuNPs@Dpo, функционализированных различными ферментами фагового и профагового происхождения.

Наночастицы AuNP, конъюгированные с ферментами Dpo1053, DpoB8300 и Dpo1432, специфичные для КПС A. baumannii 1053 (капсульный тип K91), А. baumannii В8300 (K92) и A. baumannii 1432 (K27) соответственно, были нанесены на бактериальные газоны этих штаммов, которые затем инкубировали в течение ночи. Наноагенты AuNPs@Dpo продемонстрировали ту же специфичность декапсуляции, что и очищенные белки деполимеразы, которые служили в качестве положительного контроля (рис. 5В - слева).

Затем был проведен анализ для подтверждения сдвига специфичности ППР как показателя связывания наночастиц с поверхностью бактериальной клетки.

Анализ проводили для различных AuNP@Dpo (1 нМ), которые добавляли к растворам трех разных штаммов A. baumannii (1053, В8300, 1432 соответственно) и Е. coli (100 мкл 2,9×10⁸ клеток/мл, OD600=0,2). Последний служил отрицательным контролем.

Частицы и бактерии смешивали и совместно инкубировали в течение 3 минут, после чего проводили УФ-видимый анализ максимума поглощения ППР. Заметный сдвиг наблюдался только при добавлении специфических AuNP@Dpo к соответствующему штамму в первые минуты инкубации. В то же время взаимодействие других неспецифических AuNPs@Dpo со штаммом не приводило к сдвигу SPR, что свидетельствует о высокой селективности разработанного подхода (рис. 5В - центр).

Несмотря на последние достижения в исследованиях фагов, точный механизм активности деполимеразы изучен недостаточно. Хотя мониторинг обратного сдвига ППР, вызванного диссоциацией наночастиц с клеточной поверхности, не является прямым измерением деградации субстрата, разница в активности деполимеразы очевидна (рис. 5В - справа). Например, обратный сдвиг ППР для наноагента AuNPs@Dpo1432 занимает более 1 ч, а для Dpo1053 и DpoB8300 - 10 и 25 мин соответственно. Предполагается, что этот эффект зависит от скорости деградации субстрата, и данный подход может быть полезен для сравнительного изучения взаимодействия фагов и бактерий.

Резюмируя вышесказанное, представлен новый быстрый и простой способ на основе SPR для обнаружения пар бактериофаг-бактерия. Предлагаемый способ может быть признан соответствующим критерию патентоспособности «Промышленная применимость». Принцип основан на функционализации AuNP деполимеразами фагового происхождения и мониторинге поведения наночастиц при смешивании их с различными штаммами бактерий. Наноагенты проявляют фагоподобное поведение, повторяя распознавание лигандов специфических бактерий и дальнейшую ферментативную реакцию. Это взаимодействие можно отслеживать с помощью простого и удобного метода спектрофотометрии. Представленная стратегия имеет преимущество перед традиционной техникой, поскольку она не требует длительных процедур, а результаты могут быть получены в течение нескольких минут. Учитывая рост резистентности бактерий к лекарственным препаратам, предлагаемый подход может стать новой возможностью для повышения эффективности лечения и предотвращения распространения бактериальных инфекций.

Источники литературы:

1. Adams, М.Н., 1959. Bacteriophages. Inter-science Publishers, New York (& London). Alsan, M., Klompas, M., 2010. Acinetobacter baumannii: an emerging and important pathogen. J. Clin. Outcome Manag. 17, 363-369.

2. Arbatsky, N.P. et. al, 2019. Structure of the K128 capsular polysaccharide produced by Acinetobacter baumannii KZ-1093 from Kazakhstan. Carbohydr. Res. 485, 107814 https://doi.org/l0.1016/j.carres.2019.107814.

3. Campos, M.A. et. al, 2004. Capsule polysaccharide mediates bacterial resistance to antimicrobial peptides. Infect. Immun. 72, 7107-7114. https://doi.org/10.1128/IAI.72.12.7107.

4. Carlton, R.M., 1999. Phage therapy: past history and future prospects. Arch. Immunol. Ther. Exp.47,267-274. Chen, J., Jiang, Z., Ackerman, J.D., Yazdani, M., Hou, S., Nugen, S.R., Rotello, V.M., 2015. Electrochemical nanoparticle-enzyme sensors for screening bacterial contamination in drinking water. Analyst 140, 4991-4996. https://doi.org/10.1039/c5an00637f.

5. Drobiazko, A.Y. et. al, 2022. Capsuletargeting depolymerases derived from acinetobacter baumannii prophage regions. Int. J. Mol. Sci. 23, 4971. https://doi.org/10.3390/ijms23094971.

6. El-sayed, I.H., Huang, X., Ell-sayed, M.A., 2005. Surface plasmon resonance scattering and absorption of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics: applications in oral cancer. Nano Lett. 5, 829-834. https://doi.org/ 10.1021/n1050074e.

7. Hsieh, P.F. et. al, 2017. Two T7-like bacteriophages, K5-2 and K5-4, each encodes two capsule depolymerases: isolation and functional characterization. Sci. Rep.7, 4624. https://doi.org/10.1038/s41598-017-04644-2.

8. Hsu, C.-R., Lin, T.-L., Pan, Y.-J., Hsieh, P.-F., Wang, J.-T., 2013. Isolation of a bacteriophage specific for a new capsular type of Klebsiella pneumoniae and characterization of its polysaccharide depolymerase. PLoS One 8, e70092. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0070092.

9. Huang, S., 2007. Gold nanoparticle-based immunochromatographic assay for the detection of Staphylococcus aureus. Sensor. Actuator. В Chem. 127, 335-340. https://doi.org/10.1016/j.snb.2007.04.027.

10. Kenyon, J.J et. al, 2021. Correlation of Acinetobacter baumannii K144 and K86 capsular polysaccharide structures with genes at the K locus reveals the involvement of a novel multifunctional rhamnosyltransferase for structural synthesis. Int. J. Biol. Macromol. 193, 1294-1300. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2021.10.178.

11. Khlebtsov, N.G., 2008. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from extinction spectra. Anal. Chem. 80, 6620-6625. https://doi.org/10.1021/ac800834n. Knirel, Y.A., Shneider, M.M., Popova, A.V., Kasimova, A.A., Senchenkova, S.N., Shashkov, A.S., Chizhov, A.O., 2020. Mechanisms of acinetobacter baumannii capsular polysaccharide cleavage by phage depolymerases. Biochemistry 85, 567-574. https://doi.org/10.1134/S0006297920050053.

12. Kunstmann, S et. al, 2018. Bacteriophage Sf6 tailspike protein for detection of Shigella flexneri pathogens. Viruses 10, 431. https://doi.org/10.3390/vl0080431.

13. Lee, I.-M. et. al, 2017. Structural basis for fragmenting the exopolysaccharide of Acinetobacter baumannii by bacteriophage ФАВ6 tailspike protein. Sci. Rep.7, 42711 https://doi.org/10.1038/srep42711.

14. Lin, H., Paff, M.L., Molineux, I.J., Bull, J. J., 2017. Therapeutic application of phage capsule depolymerases against K1, K5, and K30 capsulated E.coli in mice. Front. Microbiol. 8 https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02257.

15. Lin, T.-L. et. al, 2014. Isolation of a bacteriophage and its depolymerase specific for K1 capsule of Klebsiella pneumoniae: implication in typing and treatment. J. Infect. Dis. 210, 1734-1744. https://doi.org/10.1093/infdis/jiu332.

16. Liu, Y. et. al, 2019. The capsule depolymerase Dpo48 rescues Galleria mellonella and mice from acinetobacter baumannii systemic infections. Front. Microbiol. 10 https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00545.

17. Medley, CD. et. al, 2008. Gold nanoparticle-based colorimetric assay for the direct detection of cancerous cells. Anal. Chem. 80, 1067-1072. https://doi.org/10.1021/ac702037y.

18. Murray, C.J. et al., M., 2022. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet 399, 629-655. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)02724-0.

19. Mushtaq, N. et al., P.W., 2005. Treatment of experimental Escherichia coli infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56, 160-165. https://doi.org/10.1093/jac/dki177.

20. Nielsen, T.B. et. al, 2015. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiol. 15, 252. https://doi.org/10.1186/s12866-015-0580-8.

21. Pan, Y.-J. et. al, 2015. Identification of capsular types in carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae strains by wzc sequencing and implications for capsule depolymerase treatment. Antimicrob. Agents Chemother. 59, 1038-1047. https://doi.org/10.1128/AAC.03560-14.

22. Peng, H., Chen, I.A., 2019. Rapid colorimetric detection of bacterial species through the capture of gold nanoparticles by chimeric phages. ACS Nano 13, 1244-1252. https://doi.org/10.1021/acsnano.8b06395.

23. Pires, D. et. al, J., 2011. Use of newly isolated phages for control of Pseudomonas aeruginosa PAO1 and ATCC 10145 biofilms. Res. Microbiol. 162, 798-806. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2011.06.010.

24. Podolsky, S.H., 2018. The evolving response to antibiotic resistance (1945-2018). Palgrave Commun. 4, 124. https://doi.org/10.1057/s41599-018-0181-x. Popova, A.V., Shneider, M.M., Arbatsky, N.P., Kasimova, A.A., Senchenkova, S.N., Shashkov, A.S., Dmitrenok, A.S. et. al, 2020. Specific interaction of novel friunavirus phages encoding tailspike depolymerases with corresponding acinetobacter baumannii capsular types. J. Virol. 95 https://doi.org/10.1128/JVI.01714-20.

25. Senchenkova, S.N et. al, J.J., 2021. A novel ItrA4-galactosyl 1-phosphate transferase is predicted to initiate synthesis of an amino sugar-lacking K92 capsular polysaccharide of B8300. Res. Microbiol., 103815 https://doi.org/10.1016/j.resmic.2021.103815.

26. Shashkov, A.S. et. al, 2016. Acinetobacter baumannii K27 and K44 capsular polysaccharides have the same K unit but different structures due to the presence of distinct wzy genes in otherwise closely related K gene clusters. Glycobiology 26, 501-508. https://doi.org/10.1093/glycob/cwv168.

27. Shashkov, A.S. et. al, 2015. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii 1053 having the KL91 capsule biosynthesis gene locus. Carbohydr. Res. 404, 79-82. https://doi.org/10.1016/j.carres.2014.11.013.

28. Shchurova, A.S. et. al, 2021. Novel acinetobacter baumannii myovirus TaPaz encoding two tailspike depolymerases: characterization and host-recognition strategy. Viruses 978. Shevchenko, K.G., Cherkasov, V.R., Nikitina, I.L., Babenyshev, A.V., Nikitin, M.P., 2018. Smart multifunctional nanoagents for in situ monitoring of small molecules with a switchable affinity towards biomedical targets. Appl. Nanosci. 8, 195-203. https://doi.org/10.1007/s13204-018-0659-2.

29. Shevchenko, K.G. et. al, 2017. Surface plasmon resonance as a tool for investigation of non-covalent nanoparticle interactions in heterogeneous self-assembly & disassembly systems. Biosens. Bioelectron. 88, 3-8. https://doi.org/10.1016/j.bios.2016.09.042.

30. Sillankorva S., Neubauer, P., Azeredo, J., 2008. Pseudomonas fluorescens biofilms subjected to phage phiIBB-PF7A. BMC Biotechnol. 12, 79. https://doi.org/10.1186/1472-6750-8-79.

31. Tacconelli E. et. al, 2017. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis. Lancet 3099, 1-10. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30753-3.

32. Tiet, P., Clark, K.C., Mcnamara, J.O., Berlin, J.M., 2017. Colorimetric detection of Staphylococcus aureus contaminated solutions without purification. Bioconjugate Chem. 28, 183-193. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.6b00571.

33. Turkevich, J., Stevenson, P.C., Hillier, J., 1951. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday Soc. 11, 55. https://doi.org/10.1039/df9511100055

34. Диссертация Шевченко К.Г., дис.на соиск. уч. степ.к.б.н. «Разработка метода исследования комплексов гетерогенных наночастиц на основе эффекта локализованного поверхностного плазмонного резонанса и его использование для биомедицинских приложений», М., 2019 г. (прототип).

35. Патент на изобретение RU 2439151 (ФГУН ГНЦ ПМБ) (RU)), 10.01.2012 «Штамм бактериофага Acinetobacter baumannii АР22 для идентификации бактерий Acinetobacter baumannii при бактериологическом анализе клинического материала и для получения препарата против внутрибольничных A. baumannii-инфекций».

36. Шашков А.С.«Структура капсульного полисахарида Acinetobacter baumannii1053, имеющего локус гена биосинтеза капсулы KL91», Исследования углеводов, выпуск 404, 02.03.2015 г., с. 79-82. https://doi.org/10.1016/j.carres.2014.11.013.

37. Сенченкова С.Н. и др. «Предполагается, что новая ItrA4 D-галактозил-1-фосфаттрансфераза инициирует синтез аминосахарного капсульного полисахарида K92 без сахара Acinetobacter baumannii В8300», Исследования в области микробиологии, том 172, выпуск 3, апрель-май 2021 г., https://doi.org/10.1016/j.resmic.2021.103815.

38. Popova A.V. et al. «Novel Fri1-like Viruses Infecting Acinetobacter baumannii-vB_AbaP_AS11 and vB_AbaP_AS12-Characterization, Comparative Genomic Analysis, and Host-Recognition Strategy)), Viruses 2017, 9, 188; doi:10.3390/v9070188.

39. Книрель Ю.А. «Расщепление по различным механизмам капсульных полисахаридов Acinetobacter baumannii фаговыми деполимеразами)), 2020, БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып.5, с. 663-671, DOI: 10.31857/S032097252005005X.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения патогенных штаммов бактерий Acinetobacter baumannii с множественной лекарственной устойчивостью, включающий скрининг ферментативной активности наноагента - конъюгата наночастицы золота размером от 20 до 32±4 нм с ферментом деполимеразой Dpo1053, кодируемой в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii AP22, или деполимеразой Dpo1432, кодируемой в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, иммобилизованным на поверхности наночастицы. При этом 10 мкл наноагента в концентрации 1 нМ добавляют к 100 мкл бактериального образца и к контрольному образцу, содержащему Escherihia coli с OD600=0,2; затем проводят УФ-спектроскопию в 96-луночных планшетах, измеряют оптическую плотность в течение 1-3 мин; в случае обнаружения сдвигов поверхностного плазмонного резонанса в более длинноволновую область при добавлении наноагента к анализируемому штамму в первые минуты инкубации считают, что анализируемый штамм является патогенным штаммом Acinetobacter baumannii. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов распознавания патогенных бактерий в режиме реального времени. 6 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ определения патогенных штаммов бактерий Acinetobacter baumannii с множественной лекарственной устойчивостью, характеризующийся тем, что проводят скрининг ферментативной активности наноагента, представляющего собой конъюгат наночастицы золота с ферментом деполимераза бактериофага или профага, иммобилизованным на поверхности наночастицы, включающий:

а) автоматическое добавление с использованием многорежимного микропланшетного ридера предварительно подготовленного наноагента к предварительно подготовленному бактериальному образцу и к контрольному образцу, содержащему патогенные бактерии Escherihia coli, с оптической плотностью OD600=0,2,

b) проведение УФ-спектроскопии в 96-луночных планшетах,

с) измерение оптической плотности путем спектрального сканирования сразу после автоматического введения наноагента в бактериальный образец для измерения образования комплексов в режиме реального времени,

d) проведение регистрации специфического сдвига поверхностного плазмонного резонанса при специфической агрегации наноагента на поверхности бактериальных клеток,

е) оценка специфичности наноагентов за счет конвергенции частиц на клеточных стенках бактерии, их ферментативной активности по разрушению клеточной капсулы бактерии путем обнаружения отрыва наноагента от поверхности бактерий в режиме реального времени,

отличающийся тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053, кодируемую в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii AP22, или фермент представляет собой деполимеразу Dpo1432, кодируемую в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, размеры наночастиц золота составляют от 20 до 32±4 нм, при этом 10 мкл предварительно подготовленного наноагента в концентрации 1 нМ добавляют к предварительно подготовленному бактериальному образцу в количестве 100 мкл, проводят скрининг ферментативной активности наноагента в течение 1-3 мин, в случае обнаружения сдвигов поверхностного плазмонного резонанса в более длинноволновую область при добавлении наноагента к анализируемому штамму в первые минуты инкубации считают, что анализируемый штамм является патогенным штаммом Acinetobacter baumannii.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что патогенной бактерией является штамм Аcinetobacter baumannii 1053, принадлежащий к капсульному типу K91.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что патогенной бактерией является штамм Аcinetobacter baumannii 1432, принадлежащий к капсульному типу K27.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053, кодируемую в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii AP22, и представляет собой полисахаридлиазу.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1053, кодируемую в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii AP22, и представляет собой полисахаридлиазу, которая отщепляет КПС от Аcinetobacter baumannii 1053 путем β-элиминирования по одному из остатков ManNAcA.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1432, кодируемую в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, представляющую собой специфическую гликозидазу.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что фермент представляет собой деполимеразу Dpo1432, кодируемую в геноме литического фага Аcinetobacter baumannii vB_AbaP_AS12, представляющую собой специфическую гликозидазу, отщепляющую капсульные полисахариды от Аcinetobacter baumannii 1432 по гидролитическому механизму.