НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ КОДИРУЮЩЕЙ ЧАСТИ ГЕНА BRCA1 И ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2012 года по МПК C12N15/12 C12Q1/68 

1. Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для выявления онкологических мутаций гена BRCA1, ассоциированных с наследственным раком молочной железы, и оценки рисков развития заболевания.

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин: он поражает как минимум каждую десятую жительницу развитых стран и занимает лидирующие позиции по смертности вследствие несовершенства ранней диагностики. Индивидуальный риск РМЖ зачастую ассоциирован с отягощенной наследственностью, т.е. с накоплением случаев опухолей молочной железы у кровных родственниц больной.

2. Уровень техники

Из литературных данных известно, что у жительниц России примерно 20% РМЖ, возникших в молодом возрасте (до 40-50 лет) и/или на фоне неблагоприятной наследственности, и/или в форме билатерального процесса, объясняются мутациями в гене BRCA1. У женщин с наличием мутаций гена BRCA1 риск развития рака РМЖ на протяжении жизни составляет 50-80%, развития рака во второй молочной железе - 40-60%. Мутации в этом гене также приводят к повышенному риску развития опухолей яичников: 15-45%. BRCA1 - ген-супрессор клеточной пролиферации, мутации в котором приводят к неконтролируемому делению и в итоге к возникновению злокачественной опухоли. В кодирующей части гена BRCA1 описано более 800 мутаций, связанных с формированием РМЖ.

Из аналогов данного изобретения можно выделить следующие:

1) Способ выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в реальном времени»: Mitrofanov D.V., Chasovnikova О.В., Kovalenko S.P., Liakhovich V.V. Detection of 5382insC mutation in human BRCA1 gene using fluorescent labeled oligonucleotides. // Mol Biol (Mosk). 2009 Nov-Dec; 43(6):999-1005.

2) Способ выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 при помощи обнаружения полиморфизма конформаций одноцепочечной ДНК: Tamboom K, Kaasik K, Arsavskaja J, Tekkel M, Lilleorg A, Padrik P, Metspalu A, Veidebaum. BRCA1 mutations in women with familial or early-onset breast cancer and BRCA2 mutations in familial cancer in Estonia. // Hered Cancer Clin Pract. 2010 Apr 9; 8(1):4.

Недостатком этих подходов является необходимость использования специфических олигонуклеотидов, предназначенных для выявления уже заранее известных мутаций.

3) Способ выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 при помощи обнаружения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью высокоточного анализа кинетики плавления: Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. // Hum Mutat. 2009 Jun; 30(6):857-9.

Недостаток этого способа состоит в том, что он позволяет установить только факт изменения последовательности, но не конкретный тип мутации.

Самым эффективным способом выявления онкологических мутаций в гене BRCA1 является полное определение его кодирующей последовательности с помощью метода секвенирования.

Предлагаемое изобретение, представляющее собой набор синтетических олигонуклеотидов для осуществления полного секвенирования кодирующей части гена BRCA1, позволяет с высокой точностью и достоверностью выявлять все генетические изменения в последовательности гена BRCA1 в той или иной степени, ассоциированные с развитием РМЖ.

Изобретение может быть использовано как для идентификации мутаций у больных с наследственными формами РМЖ с целью выбора наиболее подходящей тактики лечения, так и для проведения генетического тестирования здоровых членов семьи с целью оценки возможных рисков развития заболевания и обнаружения рака на ранних стадиях.

2. Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является определение полной нуклеотидной последовательности гена BRCA1 и достоверное обнаружение всех онкологических мутаций, присутствующих в данной последовательности.

Указанный результат достигается в результате амплификации кодирующей части гена BRCA1 с помощью предлагаемых синтетических олигонуклеотидов с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации с использованием этих же синтетических олигонуклеотидов.

Создание специфических праймеров для амплификации (предмет изобретения)

Выбор специфических праймеров для амплификации интересующего фрагмента ДНК осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области.

Работа над созданием праймеров строится обычно следующим образом:

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей человеческого генома в интересующем исследователя гене выбирается уникальный участок, отличающий его от любого другого фрагмента любого другого организма.

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения полимеразной цепной реакции (как правило, 2 праймера). Многие из таких программ находятся в свободном доступе в интернете. Среди них можно упомянуть Oligo (версия 6.42), Primer Select из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (ИМБ), Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), Primer Quest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др.

3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей праймеров для конкретных целей.

Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для амплификации кодирующей части гена BRCA1 отличается тем, что содержит праймеры следующего нуклеотидного состава:

Помимо предлагаемых праймеров, в реакционную смесь для амплификации входят следующие компоненты:

- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dgTP, dCTP);

- фермент Taq-полимераза;

- реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl₂);

Амплификация кодирующей части гена BRCA1

Кодирующая часть гена BRCA1 (5592 п.н.) состоит из 24 фрагментов (экзонов). Большинство экзонов имеет небольшие размеры, часто менее 100 п.н., и есть один большой экзон (10-й), который составляет ~60% кодирующей области. В случае небольших экзонов предлагаемый набор праймеров позволяет амплифицировать целый экзон с прилегающими фрагментами интронов (некодирующие участки гена). В случае больших экзонов амплификация проводится в виде нескольких перекрывающихся фрагментов.

Амплификация кодирующей части гена BRCA1 с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов (праймеров) осуществляется из расчета 29 реакций на один образец геномной ДНК по следующей схеме:

Реакция амплификации проводится с использованием специализированного оборудования - амплификаторов Терцик, ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) согласно следующему температурному режиму:

№ п.п. Температура Время Количество циклов 1. 94°C 1 мин 1   94°C 15 с   2. 64°C 15 с 5 72°C 15 с   94°C 5 с   3. 64°C 15 с 35 67°C 15 с 4. 10°C Хранение

Секвенирование кодирующей части гена BRCA1

После окончания реакции амплификации полученные на первом этапе анализа продукты амплификации используются для постановки реакции секвенирования.

В реакции секвенирования продуктов амплификации, полученных в результате первого этапа анализа, используется только 1 праймер из пары, используемой для постановки реакции амплификации.

Реакция секвенирования кодирующей части гена BRCA1 с использованием предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов (праймеров) осуществляется из расчета 29 реакций на один образец ДНК по следующей схеме:

Реакция секвенирования проводится с применением набора меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов (BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, США) и специализированного оборудования - амплификаторов Терцик, ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) согласно следующему температурному режиму:

№ п.п. Температура Время Количество циклов 1. 96°C 1 мин 1   96°C 10 с   2. 56°C 20 с 40 72°C 20 с 4. 10°C Хранение

Секвенирование проводится с использованием автоматического секвенатора genetic Analyzer 3130/3130x1 (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя.

4. Осуществление изобретения

Данный набор применяется следующим образом:

1) Получение биологического материала от больного. В качестве образцов для проведения анализа могут быть использованы биоптаты тканей, кровь, соскобы букального эпителия.

2) Выделение и очистка препаратов ДНК из исходных образцов. Способы выделения ДНК из биологического материала хорошо известны специалистам и, как правило, включают стадии лизиса клеток, выделения ДНК и ее очистки. Быстрое и качественное выделение ДНК можно проводить с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (не являются предметом данного патента).

3) Амплификация полученных препаратов геномной ДНК с применением предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов, специфичных к кодирующей части гена BRCA1 (23 отдельных реакции).

4) Секвенирование продуктов амплификации, полученных в п.3 с применением предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов, специфичных к кодирующей части гена BRCA1 (29 отдельных реакций).

5) Анализ результатов реакции секвенирования проводится с использованием программного обеспечения Sequencing Analysis v5.3.1 (Applied Biosystems, США), Chromas, SeqMan.

Пример графического представления результатов, полученных с использованием предлагаемого набора праймеров, приведен на чертеже.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к набору синтетических олигонуклеотидов для осуществления генетического скрининга мутаций гена BRCA1. Выявляют онкологические мутации, ассоциированные с наследственным раком молочной железы, путем определения полной нуклеотидной последовательности кодирующей части гена BRCA1. Осуществляют амплификацию кодирующей части гена BRCA1 с помощью 28 пар синтетических олигонуклеотидов с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации. Предложенное изобретение позволяет с высокой точностью и достоверностью выявлять мутации, связанные с наследственными формами рака молочной железы. 1 ил., 5 табл.

Набор синтетических олигонуклеотидов для определения нуклеотидной последовательности кодирующей части гена BRCA1 и выявления мутаций, ассоциированных с наследственными формами рака молочной железы, отличающийся тем, что включает в свой состав праймеры следующей нуклеотидной последовательности: