ОСНОВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОНИРОВАНИЯ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ ПО ПРИЗНАКУ СНИЖЕНИЯ УРОВНЯ ГИСТАМИНА В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, пищевой промышленности и биотехнологии и может быть использовано при получении питательных сред для селекционирования штаммов лактобацилл, предназначенных для производства противоаллергических иммунобиологических средств, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания.

Известными используемыми в промышленных целях критериями выделения природных штаммов лактобацилл являются: динамика размножения бактериальной популяции в питательной среде, кислотоустойчивость, антагонизм к патогенным микроорганизмам, антибиотикорезистентность, резистентность к желчи, адгезия к эпителиальной ткани, выживаемость в грудном молоке и амниотической жидкости, способность ассимилировать холестерин, витаминообразующая способность, увеличение суммарной плотности липопротеиновых структурных мембран клеток (RU патент 2176668, C12N 1/20, А23С 9/12, A61K 35/74// (C12N 1/20, C12R 1:23); Gilliland S.E., Walker D.K. Factors to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans // Journal of dairy science. 1990. Vol.73, №4. P.905-911; Dunne С., O'Mahony L., Murphy L. [et al.]. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings // The American journal of clinical nutrition. 2001. Vol.73, №2 Suppl. P.386S-392S; US патент 2005244392, A61K 45/00, C12N 1/20).

Не был разработан и не применялся важный для получения пробиотических противоаллергических иммунобиологических средств, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания критерий селекционирования штаммов лактобацилл по признаку снижения уровня гистамина или снижения нарастания уровня гистамина в среде культивирования в процессе пассирования этих штаммов.

Наиболее перспективным при селекционировании лактобацилл является использование в качестве основы питательных сред молока и молочной сыворотки, которое обосновано тем, что эти компоненты нетоксичны, так как являются продуктом традиционных молочных производств, и обладают протективным действием при стрессорном воздействии, обеспечивающим выживаемость бактериальных клеток (Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства: Справочник / под. ред. Я.И.Костина. - М.: Агропромиздат, 1987. С.120-134; Дощанова Б.К., Шупшибаев К.К., Чижаева А.В., Кадыржанова А.А., Кирбаева Д.К. Получение кормового белка на основе молочной сыворотки // Казахский национальный университет им. аль-Фараби: [сайт]. URL: http://www.kaznu.kz/content/files/pages/folder259/doshanova.doc (дата обращения: 08.06.2010); Jaeger H., Schulz A., Karapetkov N., Knorr D. Protective effect of milk constituents and sublethal injuries limiting process effectiveness during PEF inactivation of Lb. rhamnosus // International journal of food microbiology. 2009. Vol.134, Issues 1-2. P.154-161).

Известно использование молочных сред для селекции лактобацилл путем традиционного пассирования первоначального штамма Lactobacillus acidophilus n. v. 317/402 «Наринэ» без внесения искусственных химических веществ - мутагенов с отбором вариаций пассируемого штамма по показателям антагонистической активности к возбудителям желудочно-кишечных заболеваний, антибиотикорезистентности, динамики размножения бактериальной популяции в питательной среде, витаминообразующей способности, увеличения суммарной плотности липопротеиновых структурных мембран клеток, повышающих жизнеспособность клеток штамма (RU патент 2176668, C12N 1/20, А23С 9/12, A61K 35/74// (C12N 1/20, C12R 1:23)).

Известно использование молочно-сывороточной среды без внесения каких-либо искусственных химических веществ-мутагенов для селекции путем традиционного пассирования первоначального штамма Lactobacillus acidophilus N. V. ЕР 317/402 «Наринэ» по следующим показателям: антагонистическая активность; способность продуцировать полезные вещества (витамины, аминокислоты, антиоксиданты); устойчивость мембранных структур бактериальных клеток к внешним факторам, обеспечивающая сохранение высокого титра лактобактерий в процессе хранения (RU патент 2203946, C12N 1/20, A61K 35/74).

Недостатком известных питательных сред является то, что они не содержат ингредиенты, необходимые для селекционирования штаммов лактобацилл, обеспечивающего снижение уровня гистамина или снижение нарастания уровня гистамина в питательной среде в процессе пассирования этих штаммов, которое является показателем, характеризующим перспективность использования селекционированных штаммов для получения пробиотических противоаллергических иммунобиологических средств, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания.

Задачей заявляемого изобретения является создание с помощью основы питательной среды условий для селекционирования штаммов лактобацилл, по признаку снижения уровня гистамина в среде культивирования или снижения нарастания уровня гистамина. Селекционированные штаммы лактобацилл обеспечивают снижение уровня гистамина или снижение нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе культивирования этих штаммов.

Задача решена тем, что основа для селекционирования штаммов лактобацилл представляет собой стерильную раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, содержит катионы меди (II) в количестве 30-1000 мкмоль/л, гистамин в количестве 200-800 мкмоль/л и имеет рН 6,5-7,4. Основа может дополнительно содержать целевые добавки для получения жидкой или полужидкой или плотной питательной среды в количестве 0,2-300 г/л.

В качестве целевых добавок для получения жидкой или полужидкой или плотной питательной среды используется широкий перечень любых известных добавок, обеспечивающих необходимое содержание катионов меди (II), гистамина, осмотическую плотность среды, ее рН, ионный состав, консистенцию, состав пластического материала, источников энергии, витаминов, стимуляторов роста микроорганизмов и индикаторов в известных их сочетаниях (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. 390 с.; Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. 464 с.; RU патент 2083666, C12N 1/20, А23С 9/12 (C12N 1/20, C12R 1:23, 1:01); HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия): [сайт]. URL: http://www.himedialabs.ru/ (дата обращения: 20.06.2010); Амерханова А.М. Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности: автореф. дис.… д-ра биол. наук. - М., 2009, 49 с. URL: http://vak.ed.gov.ru/common/img/uploaded/files/vak/announcements/biolog/ 2009/30-03/ AmerkhanovaAM.doc (дата обращения: 20.06.2010); Дощанова Б.К., Шупшибаев К.К., Чижаева А.В., Кадыржанова А.А., Кирбаева Д.К. Получение кормового белка на основе молочной сыворотки // Казахский национальный университет им. аль-Фараби: [сайт]. URL: http://www.kaznu.kz/content/files/pages/folder259/doshanova.doc (дата обращения: 08.06.2010); Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. СПб.: НИЦФ, 2003. 148 с.) при условии наличия снижения уровня гистамина или снижения нарастания уровня гистамина в питательной среде в процессе пассирования штаммов лактобацилл в присутствии целевых добавок.

В результате проведенных нами исследований впервые выявлен минимальный комплекс показателей основы питательной среды, необходимый для селекционирования штаммов лактобацилл в направлении снижения уровня гистамина или снижения нарастания уровня гистамина в питательной среде в процессе пассирования этих штаммов, и подобраны ингредиенты, обеспечивающие в сочетании наличие этих показателей питательной среды, в том числе получена раскисленная молочная лимоннокислотная казеиновая сыворотка, содержащая гистамин в количестве 200-800 мкмоль/л, обогащенная катионами меди (II) до их концентрации 30-1000 мкмоль/л и имеющая рН 6,5-7,4.

Заявляемая основа для селекционирования штаммов лактобацилл является новой и в литературе не описана.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание с помощью основы питательной среды условий для селекционирования штаммов лактобацилл, обеспечивающего снижение уровня гистамина или снижение нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этих штаммов.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих селекционирование штаммов лактобацилл с использованием заявляемой основы питательной среды в направлении снижения уровня гистамина или снижения нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этих штаммов.

В качестве дифференциально-диагностической питательной среды с высоким уровнем гистамина использовалась гидролизатно-молочная среда, содержащая гистамин в количестве 4000-7000 мкмоль/л. При этом приведенные в примерах комбинации ингредиентов основы питательной среды показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.

В приведенных примерах показано получение основы питательной среды, а также селекционирование штаммов лактобацилл в направлении снижения уровня гистамина или снижения нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этих штаммов при использовании молочной лимоннокислотной казеиновой сыворотки.

Для приготовления основы питательной среды используют обезжиренное молоко с уровнем гистамина не более 800 мкмоль/л.

Определение уровня гистамина проводили на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом (Р 4.1.1672-03 Методы контроля. Химические факторы. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. 2003. URL: http://rudoctor.net/medicine/bz-bw/med-amjuc/pg-20.htm (дата обращения: 20.06.2010); RU патент 2299440, G01N 33/68).

Пример 1. Для получения основы питательной среды, представляющей собой молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, обезжиренное молоко доводили первоначально раствором лимонной кислоты до рН 4,5-4,8 при температуре 18-38°С, выдерживали 50-120 минут, периодически перемешивая и устанавливая рН на уровне 4,5-4,8, фильтровали, фильтрат нагревали до 39-41°С и сепарированием отделяли молочную сыворотку. Полученную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку раскисляли раствором гидрооксида натрия до рН 6,8-7,7, при этом после стерилизации рН основы питательной среды составляла 6,5-7,4. Определяли уровень гистамина в сыворотке и при содержании его в количестве 200-800 мкмоль/л использовали сыворотку в качестве основы питательной среды для селекционирования лактобацилл. При более высоком или низком содержании гистамина полученную раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку не используют в качестве основы питательной среды для селекционирования лактобацилл.

Затем в полученной раскисленной молочной лимоннокислотной казеиновой сыворотке доводили содержание катионов меди (II) от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л солью меди (II) (сульфатом меди пятиводным). Раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку с содержанием катионов меди (II) 30-1000 мкмоль/л стерилизовали.

Пример 2. Для селекционирования штамма Lactobacillus acidophilus КАА (коллекционный №223, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, охарактеризован в описании патента на изобретение RU 2393214, C12N 1/20, A61K 35/74, С12Р 37/00) использовалось его многократное пассирование в стерильной основе питательной среды, представляющей собой раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, имеющей рН 6,5, содержащей гистамин в количестве 200 мкмоль/л и катионы меди (II) в повышающемся с каждым пассажем количестве от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л, и стерильной жидкой питательной среде, представляющей собой раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, имеющей рН 6,5, содержащей целевые добавки для получения жидкой питательной среды (агар-агар, лактозу, инулин) в количестве 0,2 г/л, гистамин в количестве 200 мкмоль/л и катионы меди (II) в повышающемся с каждым пассажем количестве от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л, с направленным отбором колоний в процессе пассирования штамма по показателю снижения нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина. Эксперимент по селекционированию штамма Lactobacillus acidophilus КАА проводился в 5-кратной повторности.

Для определения изменения нарастания уровня гистамина образцы биомассы отбирались до и через пять часов после начала раздельного культивирования в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина исходного непассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus КАА и пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus КАА. Нарастание уровня гистамина было больше при культивировании исходного непассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus КАА (1189,1±176,4 мкмоль/л), чем при культивировании пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus КАА (512,2±201,9 мкмоль/л). Таким образом было проведено селекционирование штамма Lactobacillus acidophilus КАА с использованием заявляемой основы питательной среды в направлении снижения нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этого штамма.

Пример 3. Для селекционирования штамма Lactobacillus acidophilus NKJC (коллекционный №220, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, охарактеризован в описании патента на изобретение RU 2393214, C12N 1/20, A61K 35/74, С12Р 37/00) использовалось его многократное пассирование в стерильной основе питательной среды, представляющей собой раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, имеющей рН 7,1, содержащей гистамин в количестве 400 мкмоль/л и катионы меди (II) в повышающемся с каждым пассажем количестве от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л, и стерильной полужидкой питательной среде, представляющей собой раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, имеющей рН 7,1, содержащей целевые добавки для получения полужидкой питательной среды (агар-агар, осветленную молочную творожную сыворотку, лактозу, цистеин, твин-80) в количестве 300 г/л, гистамин в количестве 400 мкмоль/л и катионы меди (II) в повышающемся с каждым пассажем количестве от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л, с направленным отбором колоний в процессе пассирования штамма по показателю снижения нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина. Эксперимент по селекционированию штамма Lactobacillus acidophilus NKJC проводился в 5-кратной повторности.

Для определения изменения нарастания уровня гистамина образцы биомассы отбирались до и через пять часов после начала раздельного культивирования в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина исходного непассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus NKJC и пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus NKJC. Нарастание уровня гистамина в питательной среде было больше при культивировании исходного непассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus NKJC (194,5±58,3 мкмоль/л), чем при культивировании пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus NKJC (64,7±23,9 мкмоль/л). Таким образом было проведено селекционирование штамма Lactobacillus acidophilus NKJC с использованием заявляемой основы питательной среды в направлении снижения нарастания уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этого штамма.

Пример 4. Для селекционирования штамма Lactobacillus acidophilus JCH (коллекционный №221, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, охарактеризован в описании патента на изобретение RU 2393214, C12N 1/20, A61K 35/74, С12Р 37/00) использовалось его многократное пассирование в стерильной основе питательной среды, представляющей собой раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, имеющей рН 7,4, содержащей гистамин в количестве 800 мкмоль/л и катионы меди (II) в повышающемся с каждым пассажем количестве от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л, и стерильной плотной питательной среде, представляющей собой раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, имеющей рН 7,4, содержащей целевые добавки для получения плотной питательной среды (агар-агар, лактозу, глюкозу, L-цистин, динатрий-b-глицерофосфат, метиловый красный) в количестве 30 г/л, гистамин в количестве 800 мкмоль/л и катионы меди (II) в повышающемся с каждым пассажем количестве от 30 мкмоль/л до 1000 мкмоль/л, с направленным отбором колоний в процессе пассирования штамма по показателю снижения уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина. Эксперимент по селекционированию штамма Lactobacillus acidophilus JCH проводился в 5-кратной повторности.

Для определения изменения уровня гистамина образцы биомассы отбирались до и через пять часов после начала раздельного культивирования в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина исходного непассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus JCH и пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus JCH. При культивировании исходного непассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus JCH не отмечалось выраженное изменение уровня гистамина в питательной среде. При культивировании пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus JCH происходило снижение уровня гистамина в питательной среде (135,6±52,6 мкмоль/л). Таким образом было проведено селекционирование штамма Lactobacillus acidophilus JCH с использованием заявляемой основы питательной среды в направлении снижения уровня гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этого штамма.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, биотехнологии и пищевой промышленности. Основа питательной среды для селекционирования штаммов лактобацилл по признаку снижения уровня гистамина в среде культивирования или по признаку снижения нарастания уровня гистамина в среде культивирования представляет собой стерильную раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, содержащую катионы меди (II) в количестве 30-1000 мкмоль/л, гистамин в количестве 200-800 мкмоль/л. Указанная основа питательной среды имеет рН 6,5-7,4. Основа может дополнительно содержать целевые добавки для получения жидкой или полужидкой или плотной питательной среды в количестве 0,2-300 г/л. Изобретение позволяет осуществить селекционирование штаммов лактобацилл по признаку снижения уровня гистамина или снижения нарастания гистамина в дифференциально-диагностической питательной среде с высоким уровнем гистамина в процессе пассирования этих штаммов. Уровень гистамина в питательной среде при культивировании пассированного варианта штамма Lactobacillus acidophilus KAA составляет 512,2±201,9 мкмоль/л, штамма Lactobacillus acidophilus NKJC - 64,7±23,9 мкмоль/л, штамма Lactobacillus acidophilus JCH - 135,6±52,6 мкмоль/л. 1 з.п. ф-лы.

1. Основа питательной среды для селекционирования штаммов лактобацилл по признаку снижения уровня гистамина в среде культивирования или по признаку снижения нарастания уровня гистамина в среде культивирования, представляющая собой стерильную раскисленную молочную лимоннокислотную казеиновую сыворотку, содержащую катионы меди (II) в количестве 30-1000 мкмоль/л, гистамин в количестве 200-800 мкмоль/л и имеющую рН 6,5-7,4.

2. Основа по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит целевые добавки для получения жидкой, или полужидкой, или плотной питательной среды в количестве 0,2-300 г/л.