СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТИДИНДЕКАРБОКСИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2007 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при исследовании ферментативной активности бактерий и изучении этиопатогенеза аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Известен способ количественного определения гистидиндекарбоксилазной активности Lactobacillus 30а, включающий манометрическое определение углекислого газа с использованием аппарата Warburg при 37°С. Согласно известному способу использовали композицию, содержащую 1 мл водной суспензии бактерий с концентрацией клеток 1 мг/мл, 1 мл 0,2 М буфера с ацетатом аммония (рН 4,8) и 0,5 мл воды. В качестве субстрата вносили 5 мг гидрохлорида гистидина, растворенного в 0,5 мл воды. Выделение газа регистрировали в течение 15 минут с интервалами по 5 минут. Декарбоксилазную активность выражали в (микролитры CO₂, выделенного 1 мг сухих клеток в течение 1 часа) (Snell E.E., Guirard B.M. Nutritional requirements of Lactobacillus 30а for growth and histidine decarboxylase production // Journal of Bacteriology. - 1964. - Vol.87, N 2. - P. 370-376).

Известный способ не обеспечивает оптимальные условия для жизнедеятельности бактерий, что снижает достоверность результатов исследования.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения - прототипом является способ количественного определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий, включающий определение продукта реакции гистамина с ортофталевым альдегидом. Известны варианты прототипа.

Согласно одному из этих известных способов культуры инкубировали в анаэробных условиях в течение 96 часов на среде Moeller, содержащей 1% L-гистидина. После анаэробной инкубации выделяли гистамин с использованием сильнокислой катионообменной смолы и к 1 мл полученного элюата приливали 0,8 мл воды, 0,4 мл 1н. раствора едкого натра, 0,1 мл 0,1% раствора ортофталевого альдегида и через 4 минуты 0,2 мл 3н. раствора соляной кислоты. Затем измеряли флюорисценцию при 440 нм, возбуждая ее при 355 нм (Воропаева Е.А. Микробная экология и гистаминобразующая активность микроорганизмов задней стенки глотки детей, больных бронхиальной астмой. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. - М., 2002. - С.11-12).

Согласно другому известному способу гистаминпродуцирующие бактерии инкубировали при 25°С в течение 24 часов в бульоне с гистидином (рН 6,5), содержащем в 1 л 10 г пептона, 3 г дрожжевого экстракта, 15 г хлорида натрия и 5 г гистидина. После инкубации и фильтрации бульона через фильтр с размером пор 0,2 мкм выделяли гистамин с помощью ионообменной хроматографии. Затем проводили реакцию с о-ортофталевым альдегидом и определяли флюоресцирующие дериваты аминов (Hajime Takahashi, Bon Kimura, Miwako Yoshikawa, Tateo Fujii. Cloning and sequencing of the histidine decarboxylase genes of gram-negative, histamine-producing bacteria and their application in detection and identification of these organisms in fish // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol.69, N5.-P. 2568-2579).

Известные способы - варианты прототипа - не позволяют одновременно определять наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий, что снижает их информативность, особенно для клинической интерпритации данных бактериологического исследования.

В основу изобретения положена задача повышения информативности результатов исследования гистидиндекарбоксилазной активности бактерий.

Задача решена тем, что согласно заявляемому способу бактерии культивируют с использованием образцов питательной среды, не обогащенной гистидином и обогащенной гистидином в количестве 10-300 мкг/мл, и затем проводят реакцию с диазотированным нитроанилином и после этого определяют наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином. При наличии в образцах питательной среды примесей, препятствующих определению гистамина, их удаляют из образцов питательной среды любым известным последовательным сочетанием приемов очистки, известных из уровня техники и обычно применяющихся в препаративной биохимии, затем проводят реакцию с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом и после этого определяют наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом.

В результате проведенных нами исследований установлено, что повышение информативности результатов исследования гистидиндекарбоксилазной активности бактерий обеспечивается за счет варьирования в выбранных пределах содержания гистидина в питательной среде с последующим комплексным определением наличия, уровня и оптимума гистидиндекарбоксилазной активности бактерий, обусловливающего интеграцию выявленных факторов, определяющих уровень гистамина в среде обитания изучаемых бактерий (в том числе ассоциаций бактерий): интенсивности размножения в оптимальной питательной среде бактерий, метаболизирующих гистидин; количества и активности синтезируемой этими бактериями гистидиндекарбоксилазы; соотношения у изучаемых бактерий гистидиндекарбоксилазной активности и способности к деструкции гистамина. Специфичность реакции гистамина с диазотированным нитроанилином дает возможность в большинстве случаев не производить после культивирования бактерий дополнительные операции для удаления из образцов питательной среды примесей, препятствующих количественному определению гистамина при использовании других способов идентификации гистамина.

Заявляемый способ определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышения информативности результатов исследования гистидиндекарбоксилазной активности бактерий.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих повышение информативности результатов исследования гистидиндекарбоксилазной активности бактерий за счет проведения исследования, обеспечивающего комплексное определение наличия, уровня и оптимума гистидиндекарбоксилазной активности бактерий.

Пример 1. Выделенный из фекалий пациента изолят Escherichia coli культивировали в образцах питательного бульона для культивирования микроорганизмов (ГРМ-бульон), не обогащенного гистидином и обогащенного гистидином в количестве 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/ мл, 150 мкг/мл, 200 мкг/мл, 250 мкг/мл и 300 мкг/мл. Затем проводили реакцию с диазотированным нитроанилином и после этого определяли наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином. Исследованный изолят Escherichia coli обладал гистидиндекарбоксилазной активностью. Оптимум гистидиндекарбоксилазной активности исследованного изолята Escherichia coli выявлен при использовании образца среды, обогащенной гистидином, в количестве 100 мкг/мл. Уровень гистидиндекарбоксилазной активности при ее оптимуме соответствовал продукции гистамина в количестве 100 мкг/мл.

Пример 2. Выделенный из мочи пациента изолят бактерий Enterobacter aerogenes культивировали в образцах питательной среды для культивирования и подсчета широкого спектра аэробных бактерий (среда №1 ГРМ), не обогащенной гистидином и обогащенной гистидином в количестве 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/ мл, 150 мкг/мл, 200 мкг/мл, 250 мкг/мл и 300 мкг/мл. Затем последовательно с использованием известной из уровня техники последовательности приемов очистки (декантацией и центрифугированием) удаляли из образцов питательной среды примеси, препятствующие определению гистамина, проводили реакцию с диазотированным нитроанилином и после этого определяли наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином. Исследованный изолят Enterobacter aerogenes не обладал гистидиндекарбоксилазной активностью.

Пример 3. Выделенный из фекалий пациента изолят Citrobacter freundii культивировали в образцах среды Moeller, не обогащенной гистидином и обогащенной гистидином в количестве 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/ мл, 150 мкг/мл, 200 мкг/мл, 250 мкг/мл и 300 мкг/мл. Затем последовательно с использованием известной из уровня техники последовательности приемов очистки (центрифугированием, фильтрацией и ионообменной хроматографией) удаляли из образцов питательной среды примеси, препятствующие определению гистамина, проводили реакцию с ортофталевым альдегидом и после этого определяли наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с ортофталевым альдегидом. Исследованный изолят Citrobacter freundii обладал гистидиндекарбоксилазной активностью. Оптимум гистидиндекарбоксилазной активности исследованного изолята Citrobacter freundii выявлен при использовании образца среды, обогащенной гистидином в количестве 250 мкг/мл. Уровень гистидиндекарбоксилазной активности при ее оптимуме соответствовал продукции гистамина в количестве 250 мкг/мл.

Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано при исследовании ферментативной активности бактерий и изучении этиопатогенеза аллергических и аутоиммунных заболеваний. Сущностью способа является культивирование бактерий с использованием образцов питательной среды, не обогащенной гистидином и обогащенной гистидином в количестве 10-300 мкг/мл, с последующим проведением реакции с диазотированным нитроанилином и определением наличия, уровня и оптимума гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином. Возможно последовательное удаление из образцов питательной среды примесей, препятствующих определению гистамина, проведение реакции с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом и после этого определение наличия, уровня и оптимума гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом. Изобретение обеспечивает повышение информативности способа. 2 н.п. ф-лы.

1. Способ определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий, характеризующийся тем, что бактерии культивируют с использованием образцов питательной среды, не обогащенной гистидином и обогащенной гистидином в количестве 10-300 мкг/мл, и затем проводят реакцию с диазотированным нитроанилином и после этого определяют наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином.2. Способ определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий, характеризующийся тем, что бактерии культивируют с использованием образцов питательной среды, не обогащенной гистидином и обогащенной гистидином в количестве 10-300 мкг/мл, и затем последовательно удаляют из образцов питательной среды примеси, препятствующие определению гистамина, проводят реакцию с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом и после этого определяют наличие, уровень и оптимум гистидиндекарбоксилазной активности бактерий на основе определения в образцах питательной среды количества продукта реакции гистамина с диазотированным нитроанилином или ортофталевым альдегидом.