ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2014 года по МПК A61K36/714 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости анемических состояний и их влияние на продолжительность и качество жизни пациентов [1-3] являются основанием широкого применения специфических гемостимулирующих средств в медицинской практике.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1-3].

Наиболее близкими по техническому результату к предлагаемому средству являются препараты рекомбинантного эритропоэтина [2-4].

Недостатками данных средств являются побочные эффекты и осложнения [4-7], связанные с иммуногенностью эритропоэтина, представляющего собой вещество белковой природы, и единственно возможным путем их назначения - парентеральным введением. В частности, могут развиваться аллергические реакции различной интенсивности, в том числе сопровождаемые аплазией костного мозга. В связи с этим существует необходимость создания безопасных гемостимулирующих средств.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных безопасных гемостимулирующих средств.

Поставленная задача достигается применением зонгорина в качестве гемостимулирующего средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве гемостимулирующего средства зонгорина.

Используемое оригинальное средство зонгорина было разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Зонгорин извлекался из растительного сырья (травы растений семейства лютиковых) в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [8].

В практической медицине для лечения анемических состояний, представляющих собой как самостоятельные заболевания, так и патологический синдром, встречающийся при различных нозологиях, достаточно часто используют препараты на основе эритропоэтина (ЭП) [2, 4]. При этом белковая природа указанного вещества предопределяет существование единственно возможного - парентерального пути его введения в организм и значительного риска развития побочных эффектов и осложнений [4-7], обусловленных иммуногенностью данного линейно-рестриктированного фактора роста эритроидных гемопоэтических клеток.

Кроме того, известна возможность стимуляции процессов кроветворения с помощью дитерпенового алкалоида напеллина. Однако эффекты данного небелкового средства заключаются в стимуляции исключительно гранулоцитарного ростка кроветворения [9]. Стимуляции эритропоэза при его применении не наблюдается.

В ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН было установлено выраженное стимулирующее влияние другого алкалоида - зонгорина в отношении стромальных прогениторных клеток кожи и процесса заживления кожных ран при использовании его наружно [10]. При этом влияние зонгорина на процессы кроветворения и возможность стимуляции эритроидного ростка кроветворения в мировой литературе не описаны. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения зонгорина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции гемопоэза, для специалиста является неочевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 64 мышах линии CBA/CaLac. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (2002) [11].

Пример 1

Предлагаемое средство получали из травы аконита байкальского и живокости высокой (растения семейства лютиковых). Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до pH 9-10 и последовательно экстрагировали сначала эфиром, затем хлороформом. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (9→50%). Эфирорастворимую фракцию подвергли дробной экстракции буферными растворами с увеличивающимися значениями pH. Эфирный раствор, оставшийся после экстракции наиболее щелочным буфером, упаривали досуха и хроматографировали на окиси алюминия в системе гексан-метанол до элюции зоноргина, происходящей после выхода напелина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.

Пример 2

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [11].

Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинно введения раствора 5-фторурацила (5-ФУ) в ¹/₂ максимально переносимой дозы (МПД) (114 мг/кг). Начиная со следующего дня после введения цитостатика мыши опытной группы получали per os 0,00025% - водный раствор зонгорина по 0,025 мг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме (0,2 мл).

На 5, 8-е и 12-е сут после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции CO₂. У опытных и контрольных мышей общепринятыми методами определяли содержание ретикулоцитов в периферической крови, а также показатели костномозгового кроветворения (общее количество миелокариоцитов, миелограмма) [12]. Содержание коммитированных клеток - предшественников эритропоэза (КОЕ-Э) и стромальных механоцитов (КОЕ-Ф) в костном мозге, а также продукцию эритропоэтически активных субстанций (ЭПА) прилипающими и неприлипающими элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) определяли с помощью культуральных методов in vitro [12].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В случаях отклонения распределения вариант в выборках от нормального для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента введение 5-ФУ проводило к развитию глубокой продолжительной депрессии эритроидного ростка кроветворения. На протяжении всего сроки исследования отмечалось падение содержания эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани и количества ретикулоцитов в периферической крови (до 10,2% и 0,0% от фона на 5-е сут соответственно). Вместе с тем имела место выраженная компенсаторная реакция со стороны пула кроветворных предшественников. Регистрировалось возрастание числа костномозговых КОЕ-Э (табл.1), связанное с повышением продукции гемопоэтинов (ЭПА) прилипающими и неприлипающими миелокариоцитами. Кроме того, было выявлено возрастание функциональной активности мезенхимальных прекурсоров (табл.2), играющее важную роль в восстановлении поврежденного данным цитостатическим агентом ГИМ [13].

Введение зонгорина приводило к значительному повышению интенсивности восстановления процессов эритропоэза. Наблюдалось увеличение содержания эритрокариоцитов в костном мозге, которое на 8-е и 12-е сут эксперимента достигало уровней фоновых показателей и составляло 240,4% и 306,8% от аналогичных значений у животных цитостатического контроля. Отражением ускорения регенерации гемопоэтической ткани явилось появление значительного количества ретикулоцитов в периферической крови во все сроки наблюдения (табл.1).

Исследование механизмов гемостимулирующего действия зонгорина выявило зависимость формирования картины крови и костного мозга от состояния пула костномозговых родоначальных клеток. Введение раствора исследуемого фармакологического вещества сопровождалось резким увеличением содержания эритроидных прекурсоров в гемопоэтической ткани на 5, 8-е и 12-е сут опыта (до 140,2%, 117,7 и 323,2% от цитостатического контроля соответственно) (табл.1).

Реакция со стороны кроветворных предшественников, во многом, определялась изменением секреторной функции стромальных элементов ГИМ. В ходе эксперимента под влиянием зонгорина регистрировалось возрастание выработки эритропоэтически активных субстанций прилипающими миелокариоцитами на 5, 12-е сут опыта (табл.2).

При этом введение зонгорина приводило к снижению количества фибробластных КОЕ в костном мозге на 5 и 12-е сут эксперимента (табл.2). Указанный факт, исходя из сведений литературы о фармакологических свойствах зонгорина в отношении функций стромальных прогениторных элементов [10], показывает, что развитие выявленного феномена являлось результатом ускорения дифференцировки и созревания мезенхимальных предшественников и послужило основой описанного выше повышения роли ГИМ в восстановлении подавленного 5-ФУ эритропоэза. Причем развитие описанной реакции со стороны мезенхимальных прекурсоров при введении зонгорина носило компенсаторный характер, так как соответствовало динамики изменений данного параметра в цитостатическом контроле (табл.2), когда имеет место значительное участие КОЕ-Ф в регенерации ГИМ [9].

В целом, полученные результаты свидетельствуют о выраженных гемостимулирующих свойствах зонгорина при его пероральном использовании. При этом механизмом ускорения регенерации кроветворной ткани является активация родоначальных гемопоэтических эритроидных клеток и возрастание фидерной способности стромального компартмента ГИМ. В то же время выявленное выраженное влияние зонгорина на функции фибробластных предшественников (содержащих в своем составе, помимо коммитированных прогениторных элементов, истинные (мультипотентные) стволовые клетки [10]) указывает на перспективность разработки на основе зонгорина не только гемостимулирующего средства, но и препарата для регенеративной медицины в целом.

Литература

1) Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1 // The Lancet. - 1989. - Vol.15. - P.825-827.

2) Волкова М.А., Ширин А.Д. Эритропоэтин в лечении анемии при онкологических заболеваниях // Гематол. и трансфузиол. - 1997. - Т.42. - №6. - С.33-36.

3) Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: ОО «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

4) Коломоец Н.М., Бакшеев В.И. Эритропоэтин в клинической практике // Клиническая медицина. - 2007. - N 9. - С.30-37.

5) Bennett С., Luminari S., Nissenson A. e.a. Pure Red-Cell Aplasia and Epoetin Therapy // N. Engl. J. Med. - 2004. - №351. P. - 1403-1407.

6) Clarke JB. Mechanisms of adverse drug reactions to biologies // Handb Exp Pharmacol. 2010; (196):453-74.

7) Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857.

8) Патент (RU) на изобретение №2475260 «Средство, обладающее регенеративной активностью» (опубл. 20.02.2013, бюл. №5). Авторы: Зюзьков Г.Н., Поветьева Т.Н., Семенов А.А., Жданов В.В., Крапивин А.В., Нестерова Ю.В., Суслов Н.И., Фомина Т.И., Дыгай А.М.

9) Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Удут Е.В. и др. Механизмы стимулирующего регенерацию гемопоэтической ткани действия напеллина в условиях цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - Изд-во РАМН, 2013. - №4. - С.431-434.

10) Зюзьков Г.Н., Крапивин А.В., Нестерова Ю.В. и др. Механизмы регенераторного действия дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2012 - №6. - С.823-827.

11) Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Методические рекомендации по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - С.759-766 (944 с.).

12) Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

13) Dygai A.M., Zyuz′kov G.N., Zhdanov V.V., et al. Effect of Transplantation of Peripheral Blood Mononuclears Obtained Using Granulocytic Colony-Stimulating Factor and Hyaluronidase on Regeneration of Hemopoietic Tissue during Myelosuppression // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009. - Vol.148. - №1. - P.120-125.

Таблица 1 Динамика содержания эритроидных клеток в костном мозге, ретикулоцитов в периферической крови, КОЕ-Э в костном мозге мышей линии CBA/CaLac после введения дистиллированной воды (1) либо зонгорина (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ¹/₂ МПД (X±m; P) Сроки исследования, сутки Группы Эритроидные клетки (×10⁶/бедро) Ретикулоциты
( %) КОЕ-Э (×10⁵ нуклеаров) до введения   1,77±0,32 36,00±2,05 22,00±3,02 5 1 0,18±0,05* 0 51,67±3,57* 2 0,51±0,06*# 16,59±3,1*# 72,3±3,57*# 8 1 1,04±0,16 3,33±0,76* 73,33±4,89* 2 2,5±0,42# 56,04±2,6*# 8б,30±3,64 # 12 1 0,59±0,08* 14,33±0,49* 20,33±2,91 2 1,81±0,3# 38,00±1,53# б5,7±2,33*# Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Таблица 2 Динамика уровней эритропоэтической активности в супернатантах от неприлипающих, прилипающих кариоцитов костного мозга, содержания КОЕ-Ф в костном мозге мышей линии CBA/CaLac после введения дистиллированной воды (1) либо зонгорина (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ¹/₂ МПД, (X±m; P) Сроки исследования, сутки Группы ЭПА от прилипающих миелокариоцитов ЭПА от неприлипающих миелокариоцитов КОЕ-Ф (на 2,5×10⁵ миелокариоцитов) до введения   2,33±0,33 4,00±0,73 9,00±0,73 5 1 4,33±0,67* 6,33±0,67 16,00±1,98* 2 8,3±0,65*# 7,27±0,96*# 7,4±0,59# 8 1 4,33±1,09 9,00±0,58 7,17±0,79 2 6,40±0,57 10,7±2,3*# 8,2±1,2 12 1 2,50±0,72 6,00±1,32* 3,33±0,84* 2 6,12±0,26*# 8,3±2,02*# 1,52±0,31*# Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии. Заявлено применение зонгорина в качестве гемостимулирующего средства. Вышеописанное средство является высокоэффективным и безопасным гемостимулирующим средством. 2 табл., 2 пр.

Применение зонгорина в качестве гемостимулирующего средства.